Способ получения растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам (варианты), рекомбинантная днк (варианты), трансформирующий растение вектор, штамм agrobacterium и способ снижения ущерба урожаю

Способ получения растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам (варианты), рекомбинантная днк (варианты), трансформирующий растение вектор, штамм agrobacterium и способ снижения ущерба урожаю

Реферат

 

Изобретение предназначено для использования в селекции растений. Рекомбинантная ДНК содержит два гена, один из которых продуцирует вещество, разрушающее питательную среду для нематод, а другой - вещество, которое нейтрализует действие первого. Введение такой ДНК с помощью вектора или штамма Agrobacterium в растение обеспечивает снижение чувствительности трансформированного растения к нематоде за счет разрушения или торможения образования питательной среды в этом растении для нематод. 7 с. и 9 з.п.ф-лы, 16 ил. , 2 табл.

Изобретение касается растений с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам и способа их получения, отличающегося тем, что включает метод рекомбинантных ДНК.

Прототипы изобретения.

Распространенные по всему миру растительные паразитические нематоды вызывают заболевания почти всех экономически важных культурных растений, потери только в США оценивают в 5,8 миллиардов долларов в год (Sasser и Freckman 1987, Мировые перспективы в области нематодологии, в Vistas on Nematology под редакцией Veech и Dickson. Hyatts Vill, Maryland, стр. 7 - 14). В то время как в тропических регионах потери вызваны в основном клубеньковыми нематодами (root-knot nematodes) (Meloidogyne), в Европе серьезными вредителями и важными факторами, ограничивающими культивацию, например, картофеля, капусты и сахарной свеклы, считают нематоды родов Globodera и Heterodera соответственно. Только небольшое количество устойчивых сортов культур появилось в результате программ по селекции, например, картофеля, сахарной свеклы, помидоров, сои и масличной редьки (Dropkin, 1988, Ann. Rev. Phytopath. 26, 145-161. Trudgill, 1991, Ann. Rev. Phytopath. 29, 167 - 192). Часто эта устойчивость основана на одном P-гене (Rick и Fobes, 1974, Tomato Gen. Coop. 24, 25; Barone и др. 1990, Mol. Gen. Genet, 224, 177-182) и ведет к потере устойчивости через несколько поколений (Shidu и Webster, в Plant Parasitic Nematodes. Т. III, 1981, Zuckerman и др. (редакторы) Asad Press, New York, c. 61-87; Turner, 1990, Ann. Appl. Biol. 117, 385-397).

Растительные паразитические нематоды являются облигатными паразитами. Такие нематоды как цист-нематоды и клубеньковые полностью зависят от образования подходящих питательных структур в корнях растений. Эти питательные структуры появляются из отдельных клеток корня. В случае цист-нематод первичная питательная клетка (IFC) развивается в синцитий посредством расщепления клеточных оболочек и гипертрофии. После заражения клубеньковыми нематодами IFC развивается в гигантскую клетку посредством нескольких делений ядра без цитокинеза и становится метаболически очень активной. При образовании питательной структуры молодая нематода становится неподвижной и теряет способность перемещаться к другим местам питания, проявляя свою зависимость от питательной структуры для нематод (NFS).

Ясно, что существует большая потребность в растениях с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам. Представленные стратегии борьбы с болезнетворными организмами и вредителями включают экспрессию рекомбинантной ДНК, кодирующей продукт, непосредственно взаимодействующий с болезнетворными организмами или вредителями.

EP-A 159884 раскрывает экспрессию в растениях гена, кодирующего инсектицидный токсин Bacillus thuringiensis. Когда белок переваривается насекомым, он присоединяется к рецептору в желудочно-кишечном тракте, вызывая в конце концов смерть насекомого. Взаимодействие токсина и рецептора в насекомом является решающим для токсического действия, этим можно объяснить относительно частые случаи устойчивости к токсину.

EP-A 303426 сообщает, что множество штаммов B. thuringiensis действует на нематоды. Следовательно, неудивительно, что предлагается идентифицировать гены, кодирующие для этих нематицидных (nematicidal) токсинов, и осуществить экспрессию этих генов в растениях для их защиты от нематод (EP-A 352052).

Однако некоторое значение имеет тот факт, что прямое взаимодействие токсина и вредителя склонно к быстрому развитию устойчивости, как сообщается для B. thuringiensis эндотоксина (Peferoen M (1991) Agroindustry High - Tech, с. 5-9.

Следовательно, объектом настоящего изобретения является обеспечение растений с пониженной восприимчивостью к болезнетворным организмам и вредителям, что позволит совершенно избежать проблем приобретения устойчивости.

Настоящее изобретение обеспечивает растения, которые в результате экспрессии рекомбинантной ДНК обладают пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам. В соответствии с предпочтительным вариантом указанная рекомбинантная ДНК вызывает разрушение питательной структуры для нематод. В другом предпочтительном варианте экспрессия указанной рекомбинантной ДНК по крайней мере замедляет образование питательной структуры для нематод. Согласно наиболее предпочтительному варианту указанная рекомбинантная ДНК включает: 1) ген-A, который при экспрессии разрушает питательную структуру для нематод, причем указанный ген-A контролируется промотором-A, который управляет экспрессией по крайней мере в питательной структуре для нематод; и 2) ген-B, который при экспрессии нейтрализует разрушающее действие гена-A, причем указанный ген-B контролируется промотором-B, который управляет экспрессией практически во всех клетках растения, где происходит экспрессия гена-A, при условии, что указанный промотор неэффективен в управлении экспрессией гена-B в питательной структуре для нематод. Предпочтительный ген-A кодирует barnase (барназу), а ген-B кодирует barstar (барстар), при этом промотор-A является постоянным промотором растения, а промотор-B можно получить из CaMV 35S-промотора или rolD-промотора. В других вариантах промотор-A выделяют из растения или он является производным указанного промотора. В соответствии с данным вариантом предпочтительным является промотор-A, который можно получить из Дельта-0.3Tob RB7-5A промотора или усеченного rolC промотора.

В соответствии с другим аспектом изобретения указанная рекомбинантная ДНК включает ген, ингибирующий эндогенный ген, который кодирует белок или полипептидный продукт, существенный для образования или поддержания питательной структуры для нематод. В соответствии с этим аспектом изобретения предпочтительным является ген-A, который продуцирует транскрипт РНК, который является комплементарным к транскрипту эндогенного гена, кодирующего белок или полипептидный продукт, существенный для образования или поддержания питательной структуры для нематод, в частности гена, существенного для жизнеспособности клеток, при этом указанный ген-B кодирует белок или полипептидный продукт, который заменяет функцию белка или полипептида, закодированного указанным эндогенным геном. Указанный нейтрализующий ген предпочтительно можно получать из гетерологичного гена различных видов, например, видов растений, видов животных или микробов, предпочтительны различные виды растений. Особо предпочтительными генами, которые существенны для жизнеспособности клеток, согласно настоящему изобретению являются гены, кодирующие белок или пептид, выбранный из группы, состоящей из АТФ-синтазы, транслокатора адениннуклеотида, транслокатора трикарбоксилата, транслокатора дикарбоксилата, транслокатора 2-оксо-глутарата, цитохрома C, пируваткиназы, глицеральдегид-3P-дегидрогеназы, NADPH-цитохром-p450-редуктазы, комплекса синтазы с жирной кислотой, глицерол-3P-ацилтрансферазы, оксиметилглутарил-CoA-редуктазы, аминоацилтрансферазы, фактора инициирования транскрипции и фактора элонгации транскрипции. Предпочтительными растениями в соответствии с изобретением являются растения из семейства Solanaceae, более предпочтительными из семейства Solanum tuberosum, картофель, еще более предпочтителен картофель, обладающий пониженной восприимчивостью к картофельным клеточным нематодам.

Изобретение также включает растительный материал, такой как цветы, фрукты, листья, пыльцу, семена или клубни, который можно получать из растений в соответствии с изобретением.

Изобретение также обеспечивает способы получения растений с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам, отличающиеся тем, что включают стадии: (1) трансформации реципиентной растительной клетки с рекомбинантной ДНК, которая включает (а) ген, который при экспрессии в питательной структуре нематод вызывает ее разрушение, и (b) выбираемый ген-маркер растения; (2) генерации растения из трансформированной клетки при давлении отбора; (3) отбора трансформированного растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам.

Изобретение, кроме того, включает способ получения растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам, отличающийся тем, что включает стадии: (1) трансформации реципиентной растительной клетки с рекомбинантной ДНК, которая включает (а) ген-A, который при экспрессии разрушает питательную структуру для нематод, причем указанный ген-A контролируется промотором-A, который управляет экспрессией по крайней мере в питательной структуре для нематод, и (b) ген-B, который при экспрессии нейтрализует разрушительное действие гена-A, причем указанный ген-B контролируется промотором-B, который управляет экспрессией практически всех клеток растений, в которых происходит экспрессия гена-A, при условии, что указанный промотор неэффективен в управлении экспрессией гена-B в питательной структуре для нематод, и (с) выбираемый ген-маркер растения, (2) генерирования целого растения из трансформированной клетки под давлением отбора, (3) идентифицирования трансформированного растения с пониженной восприимчивостью к указанным растительным паразитическим нематодам.

В соответствии с немного отличающимся вариантом обеспечивают способ получения растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам, отличающийся тем, что включает стадии: (1) трансформации реципиентной растительной клетки рекомбинантной ДНК, которая включает (а) ген-B, который при экспрессии нейтрализует разрушающее действие гена-A, вводимого на стадии (3), причем указанный ген-B находится под контролем промотора-B, управляющего экспрессией практически во всех клетках растения, где происходит экспрессия гена-A, при условии, что указанный промотор неэффективен в управлении экспрессией гена-B в питательной структуре для нематод, и (b) выбираемый маркер растения, (2) генерации целого растения из трансформированной клетки при давлении селекции, (3) трансформации реципиентной клетки растения (полученного на стадии (2), или его потомства), которая содержит по крайней мере ген-B, за счет рекомбинантной ДНК, которая включает (с) ген-A, разрушающий при экспрессии питательную структуру для нематод, причем указанный ген-A находится под контролем промотора-A, управляющего экспрессией, по крайней мере, в питательной структуре для нематод корней зараженного растения, (4) генерации растения из клетки, трансформированной на стадии (3) при подходящем давлении селекции, (5) идентификации растения, обладающего пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам.

Предпочтительным способом трансформации реципиентной клетки растения является совместная инкубация указанной клетки со штаммом Agrobacterium, который содержит указанную рекомбинантную ДНК.

Кроме того, изобретение обеспечивает рекомбинантную ДНК, содержащую растительный экспрессивный ген, который последовательно включает: промотор-A, управляющий экспрессией гена в питательной структуре для нематод; ген-A, который при экспрессии в питательной структуре для нематод разрушает эту структуру; и обычно терминатор транскрипции и сигнальную последовательность полиаденилирования; связанные таким образом, что экспрессия указанного гена-A осуществляется в указанной питательной структуре для нематод. Согласно изобретению в предпочтительной рекомбинантной ДНК указанный промотор можно получить из Дельта-0.3TobRВ7-5A или усеченного rolC промотора. Согласно изобретению в рекомбинантной ДНК предпочтителен также ген-A, который можно получить из Barnase гена Bacillus amyloliquefaciens.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом обеспечивают рекомбинантную ДНК, в которой указанный ген-A можно получить из растения-хозяина и выбрать из группы, включающей гены, кодирующие АТФ-синтазу, транслокатор адениннуклеотида, транслокатор трикарбоксилата, транслокатор дикарбоксилата, транслокатор 2-оксоглутарата, цитохром C, пируваткиназу, глицеральдегид-3P-дегидрогеназу, NADPH-цитохром-p450-редуктазу, комплексы синтазы и жирных кислот, глицерол-3P-ацилтрансферазу, оксиметил-глутарил-CoA-редуктазу, аминоацилтрансферазу, фактор инициирования транскрипции и фактор элонгации транскрипции; при этом указанный ген встроен в указанный промотор с обратной ориентацией относительно природной ориентации в растении-хозяине.

Кроме этого, изобретение обеспечивает вектор трансформации растения, содержащий рекомбинантную ДНК, соответствующую изобретению, а также штаммы Agrobacterium, содержащие указанные векторы трансформации растений.

Особо предпочтительные векторы для использования в способе согласно изобретению можно выбрать из группы, состоящей из pMOG716, pMOG719, pMOG589, pMOG699, pMOG717, pMOG711, pMOG712, pMOG713, pMOG714, pMOG715, pMOG718 и pMOG720 и их производных, модифицированных несущественным для изобретения способом.

Кроме того, изобретение обеспечивает способы снижения ущерба урожаю, наносимого растительными паразитическими нематодами при росте растений согласно изобретению.

В соответствии с другим аспектом изобретения обеспечивают способ снижения ущерба урожаю, наносимого растительными паразитическими нематодами, отличающийся тем, что включает рост растения, содержащего ген гербицидной устойчивости, контролируемый промотором-B, экспрессия которого осуществляется практически во всех клетках корней растения, где происходит экспрессия гена-A, при условии, что он неэффективен в управлении экспрессии в питательной структуре для нематод (NFS); указанный способ включает стадии: 1) роста указанного растения; 2) контакта корней указанного растения с гербицидом.

Смысл использованных здесь экспрессий, наряду с применением и преимуществами изобретения будет ясен из следующего далее подробного описания изобретения.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 (а, б) - схематическое изображение двухкомпонентной стратегии устойчивости, намеченной в этом изобретении.

Фиг. 2 - плазмида pMOG707, промежуточный вектор, сконструированный с целью клонирования.

Фиг. 3 - карта рестрикции фрагмента Ti-плазмиды pTiB6.

Фиг. 4 - промежуточный вектор pMOG579.

Фиг. 5 - бинарный вектор pMOG23.

Фиг. 6 - бинарный вектор pMOG22.

Фиг. 7 - бинарный вектор pMOG25. Плазмида, содержащая 35S-HPT и 35S-GUS между левой и правой границами T-ДНК.

Фиг. 8 - бинарные векторы pMOG452, pMOG630 и pMOG679.

Эти плазмиды являются производными от pMOG23 или pMOG22 и содержат либо GUS-конструкцию без промотора, либо GUS-конструкцию с rolD-промотором, либо GUS-конструкцию с усеченным rolD-промотором, и выбираемый маркер растения (NPT11 или HPT).

Фиг. 9 - бинарный вектор pMOG583. Эта плазмида является производной от pMOG22 и содержит 35S-промотор, встроенный в Barstar ген.

Фиг. 10 - бинарный вектор pMOG716. Эта плазмида является производной от pMOG22 и содержит 35S-промотор, встроенный в Barstar ген.

Фиг. 11 - бинарный вектор pMOG718. Эта плазмида является производной от pMOG22 и содержит два Barstar гена, один регулируется 35S-промотором, а другой регулируется rolD-промотором.

Фиг. 12 - плазмида pMOG587. Промежуточный вектор, полученный для инсерции Barnase гена и содержащий Barstar ген с бактериальным промотором и nos-терминатором.

Фиг. 13 - бинарные векторы pMOG589, pMOG591, pMOG717 и pMOG699. Эти плазмиды являются производными от pMOG23 и содержат либо Barnase ген без промотора сразу после правой границы (pMOG589), либо сайт мультиклонирования для инсерции набора регуляторных последовательностей различных типов промоторов-А (pMOG591), либо усеченный rolC-промотор и Barnase ген (pMOG717), либо усеченный Дельта-0.3TobRB7 промотор и Barnase ген (pMOG699). Для предотвращения возможных вредных эффектов Barnase гена во время процедур клонирования в бактерии с внешней стороны границы Т-ДНК можно либо вставить Barstar ген с бактериальным промотором, либо можно вставить интрон в кодирующую область Barnase гена. В последнем случае к номерам pMOG добавляют i (например, pMOG699i).

Фиг. 14 - бинарные векторы pMOG711 и pMOG715. Эти плазмиды являются производными от pMOG23 и содержат усеченный Дельта-0.3TobRB7 промотор и антисмысловую конструкцию гена, существенного для жизнеспособности клетки.

Фиг. 15 - бинарный вектор pMOG719, является общей иллюстрацией плазмиды, которую можно использовать для введения гетерологичного существенного гена, регулируемого промотором типа B.

Фиг. 16 - бинарный вектор pMOG720, является общей иллюстрацией плазмиды, которая содержит полную антисмысловую/смысловую двухкомпонентную систему для экспрессии в растениях с целью получения устойчивости к нематодам.

Было обнаружено, что растения можно сделать восприимчивыми к растительным паразитическим нематодам путем разрушения питательной структуры для нематод через экспрессию Barnase гена под контролем промотора, активного в питательной структуре для нематод (NFS), при этом было показано, что потенциальная активность по разрушению клеток растения вне NFS значительно ослаблена конкурентной экспрессией Barstar под контролем CaMV 35S-промотора. Эти растения не имеют неудобств, связанных с тем, что растительные паразитические нематоды могут оказаться устойчивыми относительно токсического вещества, примененного для защиты, так как прямое взаимодействие патогенного организма или вредителя с токсином не играет роли в защите растения.

Следующие удивительные находки иллюстрируют, как можно использовать изобретение различными способами. Когда CaMV 35S-промотор (Guilley и др., 1982, Cell 30, 763-773), который в здоровых растениях вызывает высокую степень экспрессии GUS-гена в клетках корней и, главным образом, сосудистом цилиндре (Benfey и др. (1990) EMBO J, 9, 1677-1684), используют для управления экспрессией GUS-гена в зараженных нематодами растениях, наблюдают заметное отсутствие GUS-активности в питательной структуре для нематод (NFS). Это было проверено на трех видах растений: Arabidopsis, табак и картофель, зараженных представителями видов растительных паразитических нематод (PPN) (H. schachtii, M. incognita, G. tabacum, G. rostochiensis соответственно), и в которых образовалась NFS. Другими промоторами, которые вызывают высокую степень экспрессии в ткани корней (Leach и Aoyagi, 1991, Plant Sci. 79, 69-76), включая клетки эпидермиса и корневые волоски, являются последовательности rolC и rolD промоторов плазмиды pRi A4 из Agrobacterium rhizogenes (5' фланкирующий участок открытых рамок считывания 12 и 15 соответственно в Slightom и др. (1986, J. Biol. Chem. 261, 108-121). С этими промоторами наблюдают также удивительно сильное подавление GUS-активности в NFS после заражения PPN.

В противоположность приведенным выше данным усеченная версия rolC-промотора, производного нуклеотидной последовательности 11286 до 12132 между открытыми рамками считывания 11 и 12 TL-ДНК из Agrobacterium rhizogenes плазмиды pRi A4 (Slightom и др. 1986, J. Biol. Chem. 261, 108-121) остается активной в NFS, как наблюдали после слияния усеченного rolC-промотора с GUS-геном и трансформации Arabidopsis с этой конструкцией. Очевидно, что часть промотора чувствительна к регуляции при развитии NFS, и когда эта часть удалена, промотор больше не подавляется в NFS.

Растения трансформируют конструкцией рекомбинантной ДНК на основе бинарного вектора из Agrobacterium, содержащем GUS-ген без промотора, клонированный прямо по соседству с правой границей в Т-ДНК в направлении от правой границы и второго выбираемого маркера. Регенеранты выращивают на избирательных средах до зрелости и позволяют завязаться семенам. Растения, полученные из семян, выращивают и после заражения и образования NFS проверяют корни на GUS-активность. Зарегистрировали несколько неожиданное количество линий растений с GUS-активностью в NFS. Однако, не обнаружили линий растений, обладающих GUS-активностью только в NFS; все линии клеток растений показывают, по крайней мере, некоторую GUS-активность в других (не NFS) частях растений. Кроме того, большинство линий растений с GUS-конструкцией без промотора, проявляющих GUS-активность в сосудистом цилиндре здоровых корней, также демонстрируют регуляцию GUS-активности при развитии NFS.

Авторы делают вывод, что с разумной частотой можно получать линии растений, которые дают ген без промотора в NFS зараженного растения, используя подход, проиллюстрированный GUS-геном без промотора. Из этих экспериментов также можно сделать вывод, что промоторы, действительно специфические для NFS, встречаются по крайней мере очень редко. Кроме того, недостаток GUS-ферментативной активности в NFS неизбежно вызывается понижающей регуляцией CaMV 35S-промотора в NFS.

Приведенные выше данные, например, о том, что промотор, активный в NFS, можно с разумной частотой прикреплять, используя конструкцию гена без промотора, и тот факт, что, как было показано, 35S промотор подвергается понижающей регуляции в NFS, приводят к выводу, что можно использовать особенности мозаичной экспрессии для получения растений с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам (PPN), применяя приведенный ниже подход.

Стадия 1.

Растения трансформируют за счет рекомбинантной ДНК, которая включает (а) ген-B, кодирующий нейтрализующее вещество как Barstar, встроенный после промотора-B, в основном, постоянного, но подвергающегося понижающей регуляции при развитии питательной структуры, и (b) выбираемый маркер растения. Регенеранты на селекционных средах можно отобрать для экспрессии гена-B, используя, например, способ Вестерн-детектирования. Растения, дающие экспрессию гена-B, выращивают до зрелости и дают завязаться семенам, из которых можно получить второе поколение (Т2).

Стадия 2.

Поколение Т2 используют для второго этапа трансформации теперь за счет рекомбинантной ДНК, которая включает ген-A без промотора, кодирующий разрушающее вещество, такое как Barnase, или ген, ингибирующий ген, существенный для жизнеспособности клеток в соответствии с изобретением, клонированный прямо по соседству с правой границей в T-ДНК в направлении от правой границы, и второй селектируемый маркер. (Селектируемый маркерный ген растения может отличаться от гена, используемого на первом этапе трансформации, в зависимости от того, присутствует ли еще этот ген или функционирует в Т2. Способы удаления или инактивации селектируемых маркеров растений известны специалистам (например, как раскрыто в WO 92/01370). Регенеранты выращивают на селекционной среде до зрелости и позволяют завязаться семенам, от которых выращивают следующее поколение растений (Т3).

Стадия 3.

Отбирают следующее поколение (Т3) для снижения восприимчивости к PPN и отсутствия роста и развития отклоняющихся форм. Вследствие случайности интеграции второй этап трансформации иногда дает интеграцию гена-A без промотора в участки генома растения, способного активно промотировать транскрипцию гена-A в NFS. Отбор после заражения дает в результате растения, обеспечивающие достаточную экспрессию гена-A в питательных структурах, достаточную для предотвращения полного развития этих структур, и которые неспособны поддерживать полный жизненный цикл PPN, при этом, с другой стороны, возможная экспрессия гена-A в других областях (кроме питательной структуры) нейтрализуется сопутствующей экспрессией гена-B.

Говоря более обобщенно, изобретение обеспечивает способ получения растений, которые демонстрируют пониженную восприимчивость к PPN, отличающийся тем, что включает стадии осуществления интеграции в геном указанного растения 1) гена-A, который при экспрессии разрушает питательную структуру для нематод, причем указанный ген находится под контролем промотора-A, экспрессия которого происходит, по крайней мере, в NFS, и 2) гена-B, который при экспрессии нейтрализует разрушающее действие гена-A, причем указанный ген-B находится под контролем промотора-B, управляющего экспрессией практически во всех клетках растения, но неэффективного в NFS, и стадию 3) селекции растений, демонстрирующих пониженную восприимчивость к PPN.

Преимущества и многочисленные пути осуществления изобретения будут понятны из последующего описания изобретения.

Для изобретения важно отметить, что не существует абсолютных требований для каждого из промоторов (A и B) в отдельности, то есть промотор-B не должен быть активным в каждой клетке растения вне NFS на всех стадиях развития, но должен быть активным по крайней мере в тех клетках растения вне питательной структуры, где промотор-A демонстрирует активность с неполным блокированием функций (leaky activity) в такой степени, что экспрессия разрушающего гена ухудшает жизнеспособность растения в областях вне питательной структуры для нематод. Подобным образом, промотор-A не должен быть совершенно специфическим для NFS до тех пор, пока активность в других клетках растения на любой стадии развития растения нейтрализуется конкурентной активностью продуктов гена-B в этих клетках. Промотор-B даже может проявлять некоторую активность по неполному блокированию функций (leaky activity) в NFS до тех пор, пока экспрессия гена-B достаточно низка, чтобы допустить вредное воздействие продуктов гена-A в NFS.

Подходящий промотор-A, который активен в NFS, но неактивен в возможно большем количестве других тканей, можно идентифицировать, применяя способы, описанные в заявке. После идентификации и выделения такого промотора-A его можно вставить перед разрушающим геном-A и использовать на втором этапе трансформации, как описано в стадии 2. Полученные линии растения, трансгенные и для конструкции промотор-A/ген-A, и для конструкции промотор-B/ген-B, можно проверить на пониженную восприимчивость к PPN, как указано в этом описании.

По-другому, обе составные конструкции (промотор-B/ген-B и промотор-A/ген-A) можно поместить в один вектор и использовать на одной стадии трансформации растения. Регенеранты выращивают на селективной среде до зрелости. Следующее поколение растений можно прямо отобрать для снижения восприимчивости к PPN и отсутствия роста и развития отклоняющихся форм.

В соответствии с другим аспектом изобретения NFS-специфическое подавление конструктивного промотора-B согласно изобретению можно использовать для получения растений, устойчивых к гербицидам или антибиотикам, получая растения, которые локально (например, в NFS) восприимчивы к соединениям с гербицидной или антибиотической активностью. Специалисты могут легко выбрать подходящие гены устойчивости к гербицидам, способные нейтрализовать гербицидное действие и которые встраивают к промотору-B согласно изобретению, эти гены включают гены устойчивости к гербицидам, указанные ниже как выбираемые маркеры, но не ограничены ими.

Подходящие выбираемые маркерные гены, которые можно использовать для отбора или поиска трансформированных клеток, можно выбрать из приведенного далее списка, не ограничивающего области изобретения: гены неомицин-фосфотрансферазы, сообщающие устойчивость к канамицину (EP-B 131623), ген устойчивости к гигромицину (EP 186425 A2), ген глутатион-S-трансферазы из печени крысы, сообщающий устойчивость к гербицидам, производным от глутатиона (EP-A 256223), ген глутаминсинтетазы, сообщающий при чрезмерной экспрессии устойчивость к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин (WO 87/05327), ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, сообщающий устойчивость к селективному средству фосфинотрипсину (EP-A 275957), ген, кодирующий 5-енолшикимат-3-фосфатсинтазу (5-enolshikimate-3- phosphate synthase) (EPSPS), сообщающий устойчивость к N-фосфонометилглицину, bar ген, сообщающий устойчивость к Bialaphos (биалафосу) (например, WO 91/02071) и подобные. Выбор маркера не является критичным до тех пор, пока он является функциональным (например, селективным) в комбинации с выбранными клетками растения.

Маркерный ген и интересующий ген необязательно должны быть связаны, так как совместная трансформация несвязанных генов (патент США 4399216) является также эффективным процессом в трансформации растений.

Настоящее изобретение также обеспечивает векторы, которые включают рекомбинантную ДНК для устойчивой трансформации растений и содержащие: (а) отбираемый ген для изучения активности промотора и выделения подходящего промотора-A и/или промотора-B (pMOG452), (b) подходящие гены нейтрализатора, согласно изобретению контролируемые промотором-B (pMOG583, pMOG716, pMOG719), либо (с) разрушающие гены, согласно изобретению не имеющие промотора, которые можно использовать для второго этапа трансформации и которые ниже объединяются с подходящим промотором-A, согласно изобретению находящимся в геноме растения, который уже содержит нейтрализующий ген (pMOG589), либо (d) разрушающие гены, которые согласно изобретению контролируются выделенным промотором-A, соответствующим изобретению (pMOG699, pMOG717, pMOG711, pMOG712, pMOG713, pMOG714, pMOG715), и которые можно использовать для второго этапа трансформации или совместной трансформации с вектором, содержащим нейтрализующий ген под контролем промотора-B согласно изобретению; (е) подходящие комбинации разрушающего и нейтрализующего генов, в которых согласно изобретению разрушающий ген может не иметь промотора (pMOG718) или быть ниже выделенного промотора-A (pMOG718, pMOG720 и производные); указанные комбинации можно применять для трансформации растений в один этап, и многие из них имеют пониженную устойчивость к растительным паразитическим нематодам.

В контексте данного изобретения термины "вещества, разрушающие NFS" и "нейтрализующие вещества" охватывают серии выбранных соединений, которые кодируются ДНК, генные продукты которых (либо белок, либо РНК, либо антисмысловая РНК) вредны для метаболизма, и/или функционирования, и/или жизнедеятельности NFS или органелл в них, и для которых известно, что нейтрализующие вещества способны подавлять активность разрушающего вещества при одновременной экспрессии в одной клетке с разрушающим веществом. Предпочтительными комбинациями разрушающих и нейтрализующих веществ являются, например, barnase/barstar из Bacillus amyloliquefaciens (Hartley, 1988, J. Mol. Biol. 202, 913-915), рестриктазы/соответствующие метилазы, такие как EcoRI из Е. coli (Green и другие, 1981, J. Biol. Chem. 256, 2143-2153) и EcoRI-метилаза или похожие комбинации, как описано в обзоре модификационных систем для рестрикции типа II (Wilson, 1991, Nucl. Acid. Res. 19, 2539-2566), бактериоцины и соответствующие иммунные протеины, например колицин E3/иммунный протеин из E.coli (Lau и др., 1985, Nucl. Acid. Res. 12, 8733-8745) или любой ген, кодирующий разрушающее вещество, который можно нейтрализовать одновременным продуцированием противосмысловой РНК под контролем промотора-B, такой как последовательности ДНК, кодирующие цепь A токсина дифтерии (Czako и An. 1991, Plant Physiol., 95, 687-892), РНКазы, такие как РНКаза Т1, рибонуклеазы или протеазы, рибозимы против мРНК, которые кодируют фитотоксические протеины.

В соответствии с другим аспектом изобретения комбинации разрушающих и нейтрализующих веществ включают соответственно гены, ингибирующие эндогенный ген, кодирующий белок или полипептидный продукт, существенный для жизнеспособности клетки, и в качестве нейтрализующего гена ген, кодирующий белок или полипептидный продукт, способный выполнять функцию эндогенного белка или полипептидного продукта. Такие разрушающие гены можно выбрать из группы, состоящей из (а) генов, кодирующих рибозимы против транскрипта эндогенной РНК, (b) гены, продуцирующие при транскрипции транскрипты РНК, комплементарные или, по крайней мере, частично комплементарные транскриптам РНК эндогенных генов, существенных для жизнеспособности клетки, способом, известным как антисмысловое ингибирование экспрессии генов (раскрыт в EP-A 240208), или (с) генов, которые при транскрипции продуцируют транскрипты РНК, идентичные или по крайней мере очень похожие на транскрипты эндогенных генов, существенных для жизнеспособности клетки, неизвестным пока способом ингибирования экспрессии генов, относящимся к совместной супрессии (раскрыта Napoli C. и др., 1990, The Plant Cell, 2, 279-289).

В соответствии с предпочтительным вариантом изобретения применяют антисмысловые гены для ингибирования экспрессии эндогенных генов, существенных для жизнеспособности клеток, гены которых участвуют в экспрессии в питательных структурах для нематод, посредством промотора-A, встроенного выше указанного антисмыслового гена.

Разрушающее действие, производимое антисмысловым геном, ингибирующим по отношению к существенному эндогенному гену, нейтрализуют экспрессией нейтрализующего гена, контролируемого промотором-B согласно изобретению, причем указанный ген-B при экспрессии продуцирует белок или полипептидный продукт, идентичный или похожий на белок или полипептид, закодированный жизнеспособным эндогенным геном и способный выполнять функцию продукта эндогенного гена в растении-хозяине. Предпочтительно, чтобы последовательность нуклеотидов транскрипта РНК, закодированного согласно изобретению нейтрализующим геном, отклонялась от транскрипта РНК витального эндогенного гена, избегая возможного эффекта совместной супрессии. Следовательно, предпочтительно, чтобы нейтрализующий ген кодировал белок или полипептид по существу с такой же функцией, как эндогенный существенный ген, но посредством промежуточного продукта транскрипта РНК, который является дивергентным; нейтрализующие гены, наилучшим образом соответствующие этому описанию, можно удобно получить путем отбора из базы данных генов, получаемых из различных видов растений или даже из различных нерастительных видов, таких как дрожжи, эукариоты и прокариоты животных. Предпочтительно, чтобы идентичность нуклеотидных последовательностей транскриптов, закодированных разрушающим антисмысловым трансгеном и нейтрализующим смысловым трансгеном, составляла менее 90%, предпочтительно менее 80%, еще более предпочтительно, чтобы указанный нейтрализующий смысловой трансген кодировал белковый или полипептидный генный продукт, неидентичный по аминокислотной последовательности продукту разрушающего гена, в котором идентичность нуклеотидной последовательности транскриптам, закодированным нейтрализующим трансгеном, составляла менее 75%.

Заданные гены для антисмысловых разрушающих генов выбирают из генов, кодирующих ферменты, существенные для жизнедеятельности клеток, называемые также обязательными ферментами, эти гены должны быть закодированы ядрами, предпочтительно как однокопийные гены, хотя семейство генов небольшого размера должно также подходить для целей изобретения. Кроме того, эффект антисмысловой экспрессии указанных генов не должен сводиться к нулю диффузией или транслокацией от других клеток или органелл продуктов ферментов, обычно синтезированных такими ферментами. Предпочтительно выбирать гены, кодирующие для ферментов мембранных транслокаций, по тому, как они включаются в создание химических градиентов через мембраны органелл. Ингибирование таких белков по определению нельзя аннулировать диффузией субстратов через мембрану, в которой находятся эти белки. Перенесенные соединения не ограничены органическими молекулами, а могут иметь неорганическую природу, например P, H, OH или электроны.

Предпочтительно, чтобы ферменты мембранных транслокаций присутствовали в органеллах, количество которых увеличивается при паразитизме, что иллюстрирует существенную роль таких органелл в клетках, включающих NFS. Специфическими примерами таких органелл являются митохондрии, эндоплазматический ретикулум и плазмодесма (Hussey и др., 1992, Protoplasma, 167, 55-65; Magnusson и Colinowski, 1991, Can. J. Botany, 69, 44-52). Список усеченных ферментов приведен в табл. 1 в виде примеров, не ограничивающих изобретение упомянутыми в таблице ферментами. Более подробный перечень можно составить из таких серий, как Биохимия растений (редакторы Stumpf и Conn, 1988-1991, тома 1 - 16, Academic Press) или Энциклопедия физиологии растений (New Series, 1976, Springer-Verlag, Берлин).

Хотя гены, кодирующие эти ферменты, выделены только в некоторых случаях, и, следовательно, множество копий генов не известно, в этом изобретении описаны необходимые критерии.

Для увеличения до предела антисмысловых эффектов в растении-хозяине предпочтительно использовать гомологичные гены. "Гомологичные" означает получаемые из того же вида растения, что и растение-хозяин. "Гетерологичные" в данном описании будет означать получаемые из другого растения или нерастительных видов. Гетерологичные гены также будут включать синтетические аналоги генов, модифицированные в своих м