Способ очистки белков плазмы от липопротеинов (его варианты)

Способ очистки белков плазмы от липопротеинов (его варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и может быть использовано для очистки белков плазмы от липопротеинов. Очистку белков от липопротеинов осуществляют путем обработки хлороформом в присутствии ЭДТА или ЭДТУК или буферов, содержащих борат-ионы, сукцинат-ионы, цитрат-ионы и последующего добавления солей кальция или магния с дальнейшим удалением осадка центрифугированием. Наряду с двухэтапным удалением липопротеинов предлагается и одноэтапный вариант способа, который заключается в обработке белков плазмы хлороформом с последующим добавлением растворимых солей кальция или магния. Полученный осадок удаляют центрифугированием. Технический результат: способ обеспечивает повышение степени делипидизации и выхода целевого продукта. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам из плазмы крови, которые содержат белковые вещества, и может быть использовано для очистки плазменных белков от липопротеинов.

Липопротеины (ЛП) представляют собой естественный компонент плазмы крови, выполняющий в организме функции переноса биологически активных веществ, гормонов и поддержания энергетического баланса в организме человека.

Однако присутствие ЛП, особенно -ЛП (липопротеины очень низкой плотности или ЛОНП) и пере--ЛП (липопротеины низкой плотности или ЛНП) в препаратах плазмы (альбумине, иммуноглобулинах и др.) является крайне нежелательным, так как липопротеины уменьшают растворимость белков и нарушают стабильность (1), при внутривенном применении липопротеины могут вызывать микротромбоз легочных, почечных, мозговых капилляров (2), являются причиной многих посттрансфузионных реакций (3), затрудняют оценку биологической активности и количественного содержания препаратов.

Наличие ЛП в исходном сырье мешает нормальному процессу фракционирования белков из-за дополнительного вовлечения в процесс гидрофобных и заряженных гидрофильных участков. ЛП могут сорбировать хроматографические сорбенты, ультрафильтрационные и микрофильтрационные мембраны, затруднять центрифугирование вязких растворов, снижая производительность операций и ингибировать вируцидность стандартных методов (4).

В настоящее время содержание липопротеинов является неконтролируемым показателем для белковых препаратов, хотя согласно всех Фармакопей все компоненты препаратов должны быть охарактеризованы не только качественно - внесены не только в "состав" препарата, но и охарактеризованы количественно.

Считается общепризнанным, что снижение содержания липопротеинов является показателем улучшения фармакологических свойств и клинической эффективности препаратов. Поэтому уменьшение примесей ЛП в препаратах плазмы крови является весьма актуальной задачей и ее решению посвящено огромное количество исследований.

К сожалению, большинство исследований касаются улучшения качества наиболее стабильного белка плазмы - альбумина, выдерживающего кислотную обработку при pH 2 с последующей обработкой активированным углем (5).

Известно много методов делипидизации биологических материалов, однако, они часто недостаточно эффективны, приводят к значительной потере выхода целевого продукта, снижают его биологическую активность или не могут быть воспроизведены в условиях производства.

Так, использование сульфата декстрана обеспечивает оптимальную делипидизацию, но характеризуется низким выходом по продукту (6). Использование гепарина показало соосаждение с липидами значительного количества белков плазмы и поэтому он не нашел промышленного применения (7).

Двуокись кремния (8), активированный уголь, лиофилизация, термообработка, микрофильтрация низкоэффективны, способ обработки при низкой ионной силе в изоэлектрической области ЛП нетехнологичен (9). Детергенты могут повредить биологические функции белка.

Ультрафильтрация применима только в отношении соединений с небольшим молекулярным весом (10).

Фильтрация через асбестовые фильтры запрещена из-за их канцерогенности.

Комбинации различных методов делипидизации или модификации стандартных способов также не дали стандартного широкораспространенного эффективного метода.

Все эти методы используют только один из принципов удаления - просто удаление свободных или слабосвязанных ЛП, без отсоединения связанных с белком липидов, что и приводит к неполному удалению липидов и низкому выходу продукта, так как заодно с ЛП удаляется и интересуемый препарат или продукт. Или после экстракции липидов с белков не интенсифицируют процесс сорбции, например после подкисления, подщелачивания, обработки детергентами не удается в полученном растворе полностью сорбировать или осадить липиды, без создания для этого специальных условий: ионное окружение, pH, ионная сила и другие ранее не учитываемые параметры. Не учитывается и гетерогенность ЛП, наличие гидрофобных (за счет собственно липидной части), гидрофильных (за счет углеводной части), ионных связей между ЛП и белками.

Наиболее близким к заявленному способу является способ (11), включающий обработку хлороформом раствора белка из расчета 1,5 мл на 1 г белка, в течение 30 - 60 минут при температуре 10 - 20^oC, pH 5,2 - 5,6, в дистиллированной воде или физиологическом растворе.

Этот метод обладает следующими преимуществами: низкая себестоимость органического растворителя, легкость удаления его любыми известными способами (ультрафильтрацией, гель-фильтрацией, вакуумной дистилляцией, диализом, нагреванием выше 60^oC, лиофилизацией). Кроме того хлороформ обеспечивает гарантию вирусологической безопасности (12) и одновременно депирогенизацию (13).

Однако данный метод не обладает полной делипидизацией и характеризуется невысоким выходом по белку.

Задача, на решение которой направлено изобретение является разработка метода, условия проведения которого обеспечивают повышение степени делипидизации и выхода целевого продукта.

Достигаемый технический результат заключается в снижении содержания липопротеинов, что является показателем улучшения фармакологических свойств и клинической эффективности препарата. Кроме того, в отличии от известных способов достигается также повышение выхода целевого продукта.

Сущность метода заключается в следующем. В первом варианте в раствор белка, подлежащего делипидизации, вводят комплексообразователи или лиотропные буферы или буфер, обладающий избирательной растворимостью белков. Затем вводится хлороформ с последующим добавлением растворимых солей кальция или магния. Во втором варианте в раствор белка, подлежащего делипидизации, вводят хлороформ с последующим добавлением растворимых солей кальция и магния.

В отличии от прототипа в заявленном способе перед добавлением хлороформа вводят комплексообразователи или лиотропные буферы или буфер, обладающий избирательной растворимостью белков. После добавления хлороформа вносят растворимые соли кальция или магния.

Совокупность отличительных признаков заявляемого способа позволили получить следующие преимущества.

Введение в раствор белка комплексообразователей или лиотропных агентов или буферов, обладающих избирательной растворимостью белков, обеспечивает полную экстракцию ЛП с белков и более высокую экстракцию белка за счет ослабления гидрофобного взаимодействия между белком и ЛП. А добавление растворимых солей кальция или магния подавляет электростатическое взаимодействие между молекулами белка и ЛП и вызывают агрегацию ЛП, что вызывает более полный перевод ЛП в хлороформ.

Все это позволяет увеличить степень очистки белков плазмы от липопротеинов, повысить выход белка и сохранить белки в нативном состоянии, так как соли кальция или магния выступают в качестве стабилизаторов.

Данные по эффективности делипидизации и выходу в сравнении с прототипом приведены в таблице.

Содержание липопротеинов определялось согласно общепринятому сульфофосфованилиновому способу (14).

Как видно из таблицы, использование предлагаемого способа позволяет максимально делипидировать протеины и повысить выход белка.

Способ осуществляется следующим образом. В первом варианте раствор белка с температурой от 5 до 20^oC вводят комплексообразователи (ЭДУКТ или ЭДТА) от 1 до 50 мМ, или буферы, обладающие лиотропным эффектом, например цитратный, сукцинатный или буфер, обладающий избирательной растворимостью белков, например боратный, молярностью от 0,02 до 0,1 М при pH от 2 до 6. Затем вводится хлороформ в концентрации от 5 до 15% и осуществляют перемешивание. Далее добавляют растворимые соли магния или кальция в концентрации от 0,05 М до 2 М. Потом раствор подвергают центрифугированию. Полученный раствор доводится до необходимых значений pH, ионной силы, ионного состава.

Во втором варианте в раствор белка с температурой от 5 до 20^oC и pH 2,0 - 6,0 добавляют хлороформ в концентрации от 5 до 15% и перемешивают. Затем добавляют растворимые соли кальция или магния в концентрации от 0,05 до 2 М. Раствор центрифугируют.

Примеры.

Пример 1. Исходный материал - плазма с первоначальным содержанием липопротеинов 2200 мг/100 мл и белка 5,9% в объеме 2 л (372,9 мг ЛП/1 г белка). В плазму вносят до 10 мМ ЭДТА, охлаждают до температуры 10^oC и подкисляют 0,5 N раствором соляной кислоты до pH 5,0. Затем добавляют хлороформ до 10% (объем/объем) и перемешивают, потом добавляют кальция хлорид до 0,1 М и перемешивают, отстаивают и центрифугируют при 5000 об./мин в течение 40 мин. Выход по белку составил 96,2%, остаточное содержание липопротеинов 4 мг% (0,7 мг ЛП/1 г белка). Следовательно, % делипидизации составил 99,81%.

Очищенная по известному способу плазма имела % делипидизации 89,85% и выход по белку 91,0%.

Пример 2.

Сырье: 1 кг осадка Б, полученного согласно метода Кона 6, (содержащий 500 мг ЛП/1 г белка), растворяют на гомогенизаторе в 15 л дистиллированной воды температуры 10^oC. Затем добавляют хлороформ до 10% (объем/объем) и перемешивают. После этого вводят кальция хлорид до 0,1 М и продолжают перемешивание. Отстаивают и центрифугируют. Содержание белка в центрифугате составило 1,45%. Выход по белку составил 96,7%, остаточное содержание липопротеинов 6 мг% (4,1 мг ЛП/1 г белка). Следовательно, % делипидизации составил 99,2%. Очищенный по известному способу препарат имел % делипидизации 91,7% и выход по белку 89,9%.

Примечание: За 100% выход по белку взят % белка, равный 1,5%, полученный при экстракции осадка Б физиологическим раствором при тех же условиях, но в отсутствии хлороформа.

Пример 3. Сырье: 100 мл 10% препарата иммуноглобулина, полученного согласно метода Кона 6 с содержанием липопротеинов 462 мг% (46,2 мг ЛП/1 г белка) переводят в боратный буфер 0,075 М pH 4,5 с помощью подходящей техники (диафильтрация на ВПУ 15 000 Да), охлаждают до температуры 5^oC. Затем добавляют хлороформ до 10% (объем/объем), перемешивают и добавляют кальций хлорид до 0,1 М и перемешивают 15 минут. Центрифугирование проводят при 3000 об. /мин в течение 30 минут. Полученный центрифугат переводят до необходимых значений pH и осмотичности. Получают готовый раствор 9,9% раствора иммуноглобулина в объеме 990 мл. Выход по белку составил 98,0%, остаточное содержание липопротеинов - 0,6 мг% (0,06 мг ЛП/1 г белка). Следовательно, % делипидизации составил 99,87%.

Очищенный по известному способу препарат имел % делипидизации 97,9% и выход по белку 92,1%.

Пример 4. Источник - альбумин, полученный дополнительным извлечением из осадка IV-4 (15). 1 л 10% альбумина, содержащий 1300 мг% ЛП (130 мг ЛП/1 г белка) обработан согласно примера 1, за исключением того, что вместо ЭДТА внесен цитратный буфер до 0,05 М. Выход конечного альбумина по белку составил 99,5%, остаточное содержание липопротеинов 0,5 мг% (0,05 мг ЛП/1 г белка). Следовательно, % делипидизации составил 99,96%. Очищенный по известному способу препарат имел % делипидизации 93,15% и выход 94,8%.

Использованная литература 1. Патент Франции N 2608751. Способ делипидизации плазмы. A 61 К 35/16, 1987.

2. Патент США N 4481189Процесс получения стерилизованной плазмы и плазмодериватов. A 61 K 35/16, 1984.

3. Шабалин В. Н., Серова Л.Д. Клиническая иммуногематология. Л.: Медицина, 1988, с. 236.

4. Патент США N 5186945. Процесс инактивации вирусов в плазме. A 61 K 35/16, 1993.

5. Chen R.F. Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment. J. Biological Chemistry, 1967, 242, 2, 173 - 181.

6. Патент США N 3955925. Метод удаления липидов сульфат декстраном. A 61 K 35/16, 1975.

7. Патент США N 3993585. Способ удаления липидов из плазмы. A 61 K 35/16, 1975.

8. Патент ФРГ N 2837168. Метод получения иммуноглобулина, подходящего для внутривенного введения. C 07 G 7/00, 1980.

9. Патент США N 4639513. Способ получения внутривенного иммуноглобулина. A 61 K 37/04, 1987.

10. Титов В.Н. Использование ультрафильтрации для получения сыворотки, лишенной липопротеидов. Вопросы медицинской химии, 1981, 27, 1, с. 83 - 87.

11. Крашенюк А. И. , Доманская Л.В. Сравнение двух способов обработки альбумина с целью удаления липопротеидов и влияние обработки на качество препарата. Иммуноглобулины и другие препараты крови. Л., 1976, с. 78 - 87.

12. Патент США N 4581231. Инактивация вирусов, содержащих эссенциальные липиды. A 61 K 35/14, 1987.

13. Патент ЧССР N 147339. Способ депирогенизации альбумина. A 61 K 17/00, 1973.

14. Определение общих липидов в сыворотке крови по цветовой реакции с сульфофосфованилиновым реактивом. Лабораторное дело 1976, N 6, с. 374 - 375.

15. Патент СССР N 743564 Способ получения альбумина. A 61 K 37/02, 1976.

Формула изобретения

1. Способ очистки белков плазмы от липопротеинов, включающий обработку раствора белков хлороформом с последующим удалением липопротеинов, отличающийся тем, что перед добавлением хлороформа в раствор белка с рН 2,0 - 6,0 и температурой 5 - 20^oС вводят комплексообразователи или лиотропные буферы или буфер, обладающий избирательной растворимостью белков, а после добавления хлороформа добавляют растворимые соли кальция или магния.

2. Способ очистки белков плазмы от липопротеинов, включающий обработку раствора белков хлороформом с последующим удалением липопротеинов, отличающийся тем, что в раствор белка с рН 2,0 - 6,0 и температурой 5 - 20^oС после обработки хлороформом добавляют растворимые соли кальция или магния.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве комплексообразователя используют этилендиаминтетраацетат натрия или этилендиаминтетрауксусную кислоту.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве лиотропного буфера используют цитратный или сукцинатный буфер.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве буфера, обладающего избирательной растворимостью белков, используют боратный буфер.

6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве растворимых солей кальция или магния используются хлорид кальция или хлорид магния.

РИСУНКИ

Рисунок 1

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 10.08.2004        БИ: 22/2004