Способ получения o-антигена холерного очищенного

Способ получения o-антигена холерного очищенного

Реферат

 

Изобретение предназначено для специфической индикации и диагностики холеры, вызванной возбудителями трех сероваров: Инаба, Огава, 0139. Штаммы трех сероваров (Инаба, Огава, 0139) выращивают при глубинном культивировании с подкормкой глюкозой и аммиаком. Получают нативный препарат О-антигена, спонтанно выделяющийся в культуральную среду. Удаляют балластные белки осаждением их при рН 4,4 0,2. Концентрируют и отделяют неспецифические примеси с мол. массой менее 100 кДа ультрафильтрацией. Неспецифические примеси с молекулярной массой менее 300 кДа отделяют колоночной хроматографией. При этом сохраняют на всех стадиях очистки однофазное растворенное состояние О-антигена. Концентрированный раствор O-антигена лиофильно высушивают в ампулах. Одна ампула содержит (5 0,5) мг сухого препарата, 250-500 условных доз антигена, равных обратному титру в РПГА с О-сывороткой (холерной или против 0139 штамма) в зависимости от серовара. Содержание белка составляет 7-8% (по Лоури). Токсичность для белых мышей по LD₅₀ равна (2 0,5) мг. Препарат гомогенен при контроле с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Изобретение позволяет получить высокоочищенный, хорошо растворимый О-антиген холерного вибриона 01 серовара (Инаба, Огава), а также эпидемически значимого НАГ вибриона 0139 серовара. 3 ил.

Изобретение относится к медицинe и может использоваться для специфической индикации и диагностики инфекционных болезней (в данном случае холеры, вызванной возбудителями трех сероваров: Инаба, Огава, 0139).

Известно, что действующим началом препаратов, используемых для серодиагностики и идентификации холеры, как и для ряда других представителей микробов кишечной группы, является О-антиген - основной компонент клеточной стенки грамотрицательных микроорганизмов, имеющий липополисахаридную природу и обладающий серологической специфичностью. В тоже время известно, что для производства диагностических препаратов (сывороток, диагностикумов), в том числе и холерных, наиболее часто используют целые убитые микробные клетки, обладающие комплексом различных антигенов, что затрудняет технологию (необходимостью удаления адсорбцией неспецифических балластных антител) и уменьшает активность и специфичность препаратов. О-антигены бактерий и их дериваты применяют с целью создания некоторых МИБП (диагностикумов эритроцитарных, латексных и др.), причем для их приготовления, как правило, используют жесткие методы получения О-антигена путем воздействия на клетки фенолом, смесью фенол-хлороформ-петролейный эфир, трихлоруксусной кислотой, бутанолом и т.п. Все эти методы, предложенные рядом авторов: Буавеном, Месробяну, Вестфалем, Людеритцем и некоторыми другими, в 40-50-х годах стали классическими и в настоящее время остались общепринятыми при получении комплексных антигенов липополисахаридной природы - О-антигенов компонентов оболочек грамнегативных микробов. Так, например, в 1997 году в каталоге фирмы Sigma описано более 60 коммерческих препаратов липополисахаридов бактерий кишечной группы, выделенных при помощи вышеназванных реагентов и методов, в том числе и фенольной экстракцией из штамма 569B холерного вибриона (см. Sigma. Diochemikalien und reagenzien fur die Naturnissenschaftiche Torschung. Deutschland. - 1997. - С. 694-697).

Известны способы получения препаратов O-антигена, основанные на применении вышеперечисленных методов из клеток холерного вибриона, в основном при создании химических вакцин (Александров и Гефен, 1948 г.; Ватанабе и Вервей, 1963 г. ; Лавровская, 1966 г.; B кн. Захарова И.Л., Варбанец Л.Д. Углеводсодержащие биополимеры мембран бактерий. - Киев: Наукова думка, 1983). В последние годы для тех же целей для получения O-антигена С.Кабир (Infection and Immunity, 1987) и некоторые другие авторы применяли водно-фенольную экстракцию из убитых целых клеток с последующим деацилированием щелочью при 56^oC.

В работах Джапаридзе М.Н., Караевой Л.Т, Дертевой И.И, Бургасова П.Н., Сумарокова А. А., и др. (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1981, N 11; 1990, N 12; 1991, N 4) для получения O-антигенов холерного вибриона было использовано его свойство при глубинном культивировании выделять спонтанно в среду выращивания растворимый O-антиген, что исключало применение химических агентов для его выделения. В результате выполнения этих работ разработан способ получения оральной холерной бивалентной вакцины, состоящей из двух компонентов - анатоксина-холерогена и O-антигенов серовара Инаба и Огава (патенты N 2076734 и N 2080121, кл. A 61 K 39/00). Эта вакцина применяется в России.

Известен способ получения O-антигена Огава (Способ производства вакцины для профилактики холеры, патент N 2080121), при котором проводят глубинное культивирование вибрионов в реакторе, обезвреживание, сепарирование микробных тел, выделение и очистку O-антигена из культуральной жидкости путем осаждения сульфатом аммония при 0,5 насыщения при pH 7,00,3 и фракционирование между 0,3-0,4 насыщения при pH 6,80,1, диализ, лиофилизацию.

Недостатком данного способа является то, что получение O-антигена осуществляется двукратным переводом его сульфатом аммония из растворенного состояния в осадок, отрицательно влияющий на нативность и растворимость препарата.

Известен также способ получения O-антигена штамма возбудителя холеры 0139 серовара (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1996, N 2), в котором также выделение антигена из культуральной жидкости проводится фракционированием сульфатом аммония в интервале 0,2-0,8 насыщения при pH 7,00,3, с последующим диализом и лиофилизацией.

Однако и он связан с переводом антигена из растворенного состояния в осадок, полученная фракция кроме липополисахаридного компонента содержит белки, экзоферменты.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения холерных O-антигенов Инаба и Огава (патент N 2076734), который заключается в их осаждении из культуральной жидкости сульфатом аммония при 0,5 насыщения с последующим диализом осадка и затем рефракционированием между 0,25 - 0,5 насыщения при pH 6,80,1 повторным диализом и лиофилизацией.

Содержание O-антигена в 1 мг конечного продукта выражается условными единицами - обратным титром реакции непрямой гемагглютинации с холерной O-сывороткой (для O-антигена Инаба она составляет в РПГА не ниже 50 усл. ед., а для O-антигена Огава - 100 усл. ед.).

Этот способ принят в качестве ближайшего аналога заявленного способа получения O-антигена, поскольку исходные и конечные продукты обладают сходными биологически-активными свойствами, являются O-антигенами холерного вибриона, находящимися в культуральной жидкости липополисахаридобелковыми комплексами клеточной стенки. Конечные продукты обоих методов лиофильно высушены, и их качество описывается специфической антигенной активностью O-антигена.

Имеется также сходство в операциях получения бульонной культуры штаммов-продуцентов при глубинном культивировании в реакторе с подкормкой глюкозой и аммиаком. Основным материалом для выделения O-антигена обоими способами является культуральная жидкость с растворенным O-антигеном, так что применение химических агентов, жестких методов исключается.

Однако и при данном способе получения в O-антигене присутствуют ряд иммуногенов холерного вибриона, экзоферменты, что объясняется его назначением как компонента холерной оральной вакцины.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего получить препарат высокоочищенного, нативного, хорошо растворимого O-антигена холерного вибриона 01 серовара (Инаба, Огава), а также эпидемически значимого НАГ вибриона 0139 серовара.

Сущность способа получения O-антигена заключается в использовании совокупности последовательных операций, начиная от выбора в качестве исходного материала растворимого в культуральной жидкости O-антигена, спонтанно выделенного штаммом-продуцентом.

Все последующие операции по его очистке и концентрации предполагали сохранение целевого продукта в однофазном растворенном состоянии.

Известно решающее значение при получении биологических объектов сохранения постоянным их фазового состояния. Воздействие на высокомолекулярные биологические соединения, не изменяющие их фазового состояния, позволяют сохранить структуру и биологическую активность даже лабильных соединений (Гейли Дж., Олис Д. Основы биохимической инженерии. - М.: Мир, 1989).

В предлагаемом способе получения очищенного O-антигена для решения вышеназванной задачи применяют следующие последовательно сменяющиеся операции. Проводят глубинное культивирование штаммов в реакторе с подкормкой глюкозой и аммиаком и в качестве исходного материала используют культуральную жидкость, в которой растворен спонтанно образованный O-антиген. Очистку O-антигена от балластных белков культуральной жидкости осуществляют осаждением их при pH 4,40,2 с последующим отделением центрифугированием. O-антиген, оставшийся растворенным в центрифугате, концентрируют в 10-20 раз и освобождают от неспецифических компонентов с мол. массой менее 100 кДа. Жидкий концентрат O-антигена вновь очищают методом колоночной разделительной хроматографии на геле TSK и выделяют цельный продукт с мол. массой 1000-2000 кДа. Препарат замораживают при -40^oC и лиофильно высушивают.

В отличие от наиболее близкого аналога, где очистка и концентрация осуществляются переводом O-антигена сульфатом аммония в осадок с последующим растворением и диализом, предлагаемый способ обеспечивает сохранение O-антигена в однофазном растворенном состоянии на всех этапах очистки, что осуществляется тщательным подбором, последовательным использованием высокоэффективных методов отделения балластных неспецифических примесей (гель-хроматография, мембранная ультрафильтрация), не изменяющих фазового состояния целевого продукта.

Отличия заявляемого способа от наиболее близкого аналога в следующем.

1. В предлагаемом способе на всех этапах получения сохраняется однофазное состояние O-антигена, так как он остается в растворенном состоянии, что сохраняет его нативность, неизменность медико-биологических свойств. В практике известного способа ближайшего аналога получение O-антигена осуществляется двукратным переводом его сульфатом аммония из растворенного состояния в осадок.

2. Очистка - отделение примесей от O-антигена заявляемьм способом проводится совокупностью последовательных не изменяющих фазного состояния операций, заключающихся в переводе в нерастворимое состояние примесей (белков), а не O-антигена, ультрафильтрации, отделяющей его от веществ с молекулярной массой менее 100 кДа, и гель-хроматографии, удаляющей соединения, не обладающие специфической серологической активностью O-антигена с мол. массой менее 300 кДа, чем достигается высокая степень очистки и гомогенности O-антигена.

В наиболее близком аналоге очистка O-антигена проводится путем фракционирования сульфатом аммония при насыщении 0,25 - 0,50. Уровень чистоты O-антигена в этом случае значительно ниже, присутствуют ряд иммуногенов холерного вибриона, экзоферментов, некоторые факторы патогенности, что объясняется его назначением как компонента холерной оральной вакцины.

В результате медико-биологические свойства полученного препарата значимо отличаются от таковых аналога.

Подробное изложение способа представлено с помощью фиг. 1 и 2, где на фиг. 1 показан график гель-фильтрации холерного O-антигена на TSK-геле HW-60 (A) и HW-75 (B), где по оси ординат: A280 - кривая элюции белка; T - величина титра; O-ag - содержание O-антигена; Pr, Ph - протеазная и фосфолипазная активности (Т/в пробе); по оси абсцисс - номер проб. На фиг. 2 показан спектр ВЭЖХ очищенного гель-фильтрацией O-антигена, где по оси ординат A280 - кривая элюции белка, по оси абсцисс - время выхода проб.

Подробное описание осуществления способа представлено на примере технологии, разработанной РосНИПЧИ "Микроб".

В качестве продуцентов холерного O-антигена использовали штаммы 01 серовара M41 Огава и 569B Инаба, а также 0139.

Холерный вибрион выращивают при температуре 34-37^oC в реакторе на среде из ферментативного гидролизата казеина (pH 8,0, 200 мг% аминного азота, Na₂HPO₄ - 0,05%, NaCl - 0,5%) в условиях глубинного культивирования с подкормкой глюкозой и аммиаком. В стационарной фазе роста (10-11 ч выращивания), когда концентрация микробных тел, достигнув 70-80 млрд в 1 мл, оставалась постоянной в течениe 3 ч, выращивание прекращали добавлением 0,6 - 0,2% формалина. Содержание растворенного в культуральной жидкости O-антигена в это время по реакции диффузионной преципитации с O-сывороткой составляло 4-8 усл. ед. (обратный титр реакции диффузионной преципитации в геле). Убитые микробные тела через 12 ч отделяли центрифугированием при 15000 об/мин, а надосадочную жидкость выдерживали 30 дней при температуре 10-12^oC для снижения токсичности O-антигена (и одновременно образования анатоксина у токсигенного штамма 569B). После этого приступали к выделению, очистке и концентрации O-антигена из культуральной жидкости, сохраняя его на всех этапах в растворенном нативном состоянии. Оставшиеся микробные тела и балластные белки осаждают снижением pH до 4,4 0,2 (возможно в присутствии гексаметафосфата натрия) и удаляют центрифугированием при 15000 об/мин, при этом O-антиген остается растворенным в центрифугате. Стерильность достигалась добавлением азида натрия в конечной концентрации 0,02%. На следующем этапе очистка центрифугата производится мембранной ультрафильтрацией центрифугата на автоматизированной установке АУФ-01 через полые волокна, пропускающие частицы с мол. массой менее 100 кДа, очищающие O-антиген от неспецифических примесей и одновременно концентрирующие в 20 раз. Концентрированный раствор O-антигена отделяют от оставшихся высокомолекулярных неспецифических примесей путем разделительной хроматографии (например, на TSK-геле HW-60), который обладает высокой механической стабильностью, и обеспечивая высокоскоростное выделение антигена при минимальном разведении образца, что позволяет использовать его в производстве. Преимущество разделительной способности TSK-геля HW-60 показано на фиг. 1.

Полученный целевой продукт диализуют против 0,9% хлорида натрия, разливают по 1 мл в ампулы и лиофильно высушивают.

Одна ампула содержит (50,5) мг сухого препарата, 250-500 условных доз O-антигена, равных обратному титру в РПГА с O-сывороткой (холерной или против 0139 штамма). Содержание белка составляет 7-8% белка (по Лоури), токсичность при введении белым мышам в расчете по LD₅₀, установленная в среднем, равна (20,5) мг. Препарат гомогенен при высокоэффективной жидкостной хроматографии на TSK геле 3000 SW, элюция происходит одним острым пиком со временем удерживания 4,8 мин (фиг. 2).

Формула изобретения

Способ получения холерного O-антигена очищенного из культуральной жидкости штаммов трех сероваров (Инаба, Огава, 0139), выращенных при глубинном культивировании в реакторе с подкормкой глюкозой и аммиаком, отличающийся тем, что для получения нативного препарата, спонтанно выделяющегося в культуральную среду, удаляют балластные белки осаждением их при рH 4,4 0,2, концентрируют и отделяют неспецифические примеси с мол. массой менее 100 кДа ультрафильтрацией, неспецифические примеси с молекулярной массой менее 300 кДа отделяют колоночной хроматографией, сохраняя на всех стадиях очистки однофазное растворенное состояние O-антигена.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2