Производные рапамицина и фармацевтическая композиция

Производные рапамицина и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Описываются новые производные рапамицина общей формулы I где значения Y, R¹, R⁴ указаны в п.1 формулы, обладающие иммуносупрессивной активностью. Описывается также фармацевтическая композиция на основе соединений формулы I. 2 с. и 4 з.п.ф-лы.

Настоящее изобретение описывает новые алкилированные производные рапамицина, имеющие фармацевтическое значение, особенно в качестве иммуносупрессантов.

Рапамицин - это известный макролидный антибиотик [1-3], продуцируемый Streptomyces hyqroscopicus, имеющий структуру, описываемую формулой А: Рапамицин является чрезвычайно сильным иммуносупрессантом, и было показано также, что он обладает противоопухолевой и антигрибной активностью. Его применение в качестве фармацевтического препарата ограничивается, однако, его очень низкой и непостоянной биологической доступностью, а также высокой токсичностью. Кроме того, рапамицин практически нерастворим, что осложняет технологии приготовления стабильных галеновых препаратов.

Неожиданно было обнаружено, что некоторые новые производные рапамицина (Новые Соединения) обладают улучшенными фармакологическими показателями по сравнению с рапамицином, обладают большей стабильностью и биологической доступностью и облегчают приготовление галеновых препаратов. Новые Соединения являются алкилированными производными рапамицина, имеющими структуру, описываемую формулой I: в которой X является (H, H) или О; Y представляет собой (H, ОН) или О; R¹ представляет собой H, алкил, арилалкил, гидроксиалкил, дигидроксиалкил, гидроксиалкиларилалкил, дигидроксиалкиларилалкил, ацилоксиалкил, аминоалкил, алкиламиноалкил, алкоксикарбониламиноалкил, ациламиноалкил, арилсульфонамидоалкил, аллил, дигидроксиалкилаллил, диоксоланилаллил и гидроксиалкоксиалкил, где "алк-" или "алкил" обозначают линейный или разветвленный C_1-6алкил, и "арил" обозначает фенил или толил; R² представляет собой H или C_1-6алкил, и R⁴ представляет собой метил, или R⁴ и R¹ вместе образуют C_2-6aлкилен, при условии, что R¹ и R² не являются одновременно Н.

Наиболее перспективными Новыми Соединениями являются следующие: 1. 40-O-Бензил-рапамицин 2. 40-O-(4'-Гидроксиметил)бензил-рапамицин 3. 40-O-[4'-(1,2-Дигидроксиэтил)]бензил-рапамицин 4. 40-O-Аллил-рапамицин 5. 40-O-[3'-(2,2-Диметил-1,3-диоксолан-4(S)-ил] -проп-2'-ен-1'- ил]-рапамицин 6. (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-Дигидроксипент-2'-ен-1'-ил)-рапамицин 7. 40-O-(2-Гидрокси)этоксикарбонилметил-рапамицин 8. 40-O-(2-Гидрокси)этил-рапамицин 9. 40-O-(3-Гидрокси)пропил-рапамицин 10. 40-O-(6-Гидрокси)гексил-рапамицин 11. 40-O-[2-(2-Гидрокси)этокси]этил-рапамицин 12. 40-O-[(3S)-2,2-Диметилдиоксолан-3-ил]метил-рапамицин 13. 40-O-[(2S)-2,3-Дигидроксипроп-1-ил]-рапамицин 14. 40-O-(2-Ацетокси)этил-рапамицин 15. 40-O-(2-Никотиноилокси)этил-рапамицин 16. 40-O-[2-(N-Морфолино)ацетокси]этил-рапамицин 17. 40-O-(2-N-Имидазолилацетокси)этил-рапамицин 18. 40-O-[2-(N-Метил-N'-пиперазинил)ацетокси]этил-рапамицин 19. 39-O-Дезметил-39,40-O,O-этилен-рапамицин 20. (26R)-26-Дигидро-40-O-(2-гидрокси)этил-рапамицин 21. 28-O-Метил-рапамицин 22. 40-O-(2-Аминоэтил)-рапамицин 23. 40-O-(2-Ацетаминоэтил)-рапамицин 24. 40-O-(2-Никотинамидоэтил)-рапамицин 25. 40-O-(2-(N-метил-имидазо-2'-илкарбоксамидо)этил-рапамицин 26. 40-O-(2-Этоксикарбониламиноэтил)-рапамицин 27. 40-O-(2-Толилсульфонамидоэтил)-рапамицин 28. 40-O-[2-(4',5'-Дикарбоэтокси-1',2',3'-триазол-1'-ил)-этил] -рапамицин Предпочтительными являются Новые Соединения, у которых как X, так и Y являются О, R² является H, R⁴ является метилом, a R¹ не является H; наиболее предпочтительно, если R¹ выбран из гидроксиалкила, гидроксиалкоксиалкила, ациламиноалкила и аминоалкила; особенно 40-O-(2-гидрокси)этил-рапамицин.

В изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая новое соединение, как определено выше, вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, предназначенная для лечения или профилактики любого из следующих состояний: отторжение трансплантата органа или ткани, заболевание "трансплантат против хозяина", аутоиммунные заболевания и воспалительные нарушения и астма.

Предпочтительно проводить О-замещение по C40 или O,O-двойное замещение по C28 и C40 согласно следующему общему способу: рапамицин (либо дигидро- или деоксорапамицин) подвергают взаимодействию с органическим радикалом, присоединенным к отщепляемой группе (например, RX, где R является органическим радикалом (R¹ или R², как определено выше), а X является отщепляемой группой, например, CCl₃C(NH)O или CF₃SO₃), в соответствующих реакционных условиях, желательно в кислой или нейтральной среде, например, в присутствии кислоты, такой как трифторметансульфокислота, камфорсульфокислота, р-толуолсульфокислота, или их соответствующих пиридиниевых или замещенных пиридиниевых солей, в случае, когда X является CCl₃C(NH)O, или в присутствии основания, такого как пиридин, замещенный пиридин, диизопропилэтиламин или пентаметилпиперидин, в случае, когда X является CF₃SO₃. O-замещения только по C28 производят тем же способом, но с предварительной защитой C40. Возможны дальнейшие модификации. Например, если заместителем является аллил, то изолированная однозамещенная двойная связь остатка аллила легко поддается дальнейшей модификации.

Соединения 9-деоксорапамицина предпочтительно получают путем восстановления рапамицина с помощью сероводорода, путем взаимодействия рапамицина с дифенилдиселенидом и трибутилфосфином, либо в ходе любой другой подходящей реакции восстановления.

26-Дигидро-рапамицины предпочтительно получают путем восстановления у рапамицинов или 9-деоксорапамицинов кето группы при C26 до гидроксигруппы путем реакции восстановления в мягких условиях, например реакции восстановления бороводородом.

Новые Соединения наиболее перспективны для применения в следующих случаях.

а) Лечение и профилактика отторжения пересаженных органов и тканей, например, для лечения реципиентов трансплантатов сердца, легких, комбинаций сердце-легкое, печени, почек, панкреатических, кожных или роговичных трансплантатов. Также они показаны для профилактики заболевания "трансплантат против хозяина", например после пересадки костного мозга.

б) Лечение и профилактика аутоимунного заболевания и воспалительных состояний, в особенности воспалительных состояний с этиологией, включающей аутоимунную компоненту, такую как артрит (например, ревматоидный артрит, хронический прогрессирующий артрит, деформирующий артрит) и ревматические заболевания. Специфические аутоимунные заболевания, при которых могут быть применены соединения по изобретению, включают аутоимунные гематологические расстройства (включая, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, эритроцитарную анемию и идиопатическую тромбоцитопению), системную красную волчанку, полихондрит, склеродому, гранулематоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, тяжелую псевдопаралитическую миастению, псориаз, синдром Стивена-Джонсона, идиопатическое спру, болезнь аутоимунного воспаления кишечника (включая, например, неспецифический язвенный колит и болезнь Крохна), эндокринную офтальмопатию, болезнь Гравеса, саркоидоз, множественный склероз, первичный билиарный цирроз печени, юношеский диабет (сахарный диабет I-го типа), увеит (предшествующий и последующий), сухой кератоконъюктивит и весенний кератоконъюктивит, интерстициальный фиброз легких, псориатический артрит, гломерулонефрит (с и без нефротического синдрома, например, включая идиопатический нефротический синдром или нефропатию с минимальными изменениями) и юношеский дерматомиозит.

в) Лечение и предупреждение астмы.

г) Терапия множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) Новые Соединения подавляют Р-гликопротеины (Ргп), которые являются мембранными транспортными молекулами, ассоциированными с МЛУ. МЛУ особенно проблематична у раковых больных и больных СПИДом, которые не будут реагировать на обычную химиотерапию из-за того, что лекарственные препараты выводятся из клеток посредством Ргп. Новые Соединения полезны поэтому для повышения эффективности других химиотерапевтических средств при лечении и регуляции состояний множественной лекарственной устойчивости, таких как рак с множественной лекарственной устойчивостью или СПИД с множественной лекарственной устойчивостью.

д) Лечение пролиферативных расстройств, например опухолей, гиперпролиферативных кожных нарушений и тому подобное.

е) Лечение грибковых инфекций.

ж) Лечение и профилактика воспаления, особенно для усилении действия стероидов.

з) Лечение и профилактика инфекции, особенно инфекции, вызываемой патогенами, обладающими ПМИ или ПМИ-подобными факторами.

Новые Соединения применяют путем введения фармацевтически эффективной дозы в фармацевтически приемлемой форме пациенту, нуждающемуся в лечении. Соответствующие дозы Новых Соединений могут меняться, например, в зависимости от состояния, которое собираются лечить (например, типа заболевания или природы устойчивости), желаемого эффекта и способа введения.

В целом успешные результаты получают при пероральном введении в дозах порядка от 0,05 до 5 или до 10 мг/кг/день; например, порядка от 0,1 до 2 или до 7,5 мг/кг/день при однократном введении, или раздельными дозами - от 2 до 4-х в день, или при парентеральном введении, в частности, внутривенно, например путем капельного внутривенного введения или вливания, в дозах порядка от 0,01 до 2,5 или до 5 мг/кг/день, например, порядка от 0,05 или 0,1 до 1,0 мг/кг/день. Рекомендуемыми дневными дозами для пациентов являются дозы порядка 500 мг перорально, например, порядка от 5 до 100 мг перорально, или порядка от 0,5 до 125 и до 250 мг внутривенно, например, порядка от 2,5 до 50 мг внутривенно.

Другим возможным и даже более предпочтительным вариантом является систематизация дозирования для пациента специфическим образом так, чтобы обеспечить предварительно определенные уровни в крови, например, как определено RIA методикой. Так, например, дозирование пациенту может быть отрегулировано таким образом, чтобы текущий уровень лекарства в крови, согласно измерениям с помощью RIA, составлял регулярно порядка от 50 или 150 до 500 или 1000 нг/мл, например, аналогично способам дозирования, применяемым в настоящее время в Циклоспориновой иммунно-супрессивной терапии.

Новые Соединения могут вводиться в виде одного активного ингредиента или совместно с другими лекарственными препаратами. Например, при иммуносупрессивной терапии, такой как профилактика и лечение болезни "трансплантат против хозяина", отторжения трансплантата или аутоимунного заболевания, Новые Соединения могут быть использованы в сочетании с Циклоспорином, FK-506, или их иммуносупрессивными производными; кортикостероидами; азатиопреном; иммуносупрессивными моноклональными антителами, например моноклональными антителами к CD3, CD4, CD25, CD28 или CD45; и/или другими иммуномодуляторными соединениями. При противовоспалительной терапии Новые Соединения могут применяться совместно с противовоспалительными средствами, например кортикостероидами. В антиинфекционной терапии Новые Соединения могут применяться в сочетании с другими средствами подавления инфекций, например антивирусными препаратами и антибиотиками.

Новые Соединения вводят любым стандартным путем, в частности энтерально, например перорально, в виде растворов для питья, таблеток или капсул, или парэнтерально, например, в виде растворов или суспензий для инъекций. Рекомендуемые разовые дозы для перорального введения содержат, например, от 1 до 50 мг соединения по изобретению, обычно от 1 до 10 мг. Фармацевтические композиции, содержащие новые соединения, могут быть приготовлены аналогично фармацевтическим композициям, содержащий рапамицин [4], что очевидно для специалиста в этой области.

Фармакологическую активность Новых Соединений демонстрируют следующие тесты.

1. Смешанная лимфоцитарная реакция (СЛР).

Смешанная Лимфоцитарная Реакция первоначально была разработана в применении к аллотрансплантатам, для оценки тканевой совместимости между потенциальными донорами и реципиентами органов, и является одной из лучших существующих моделей имунной реакции in vitro. Например, описанную [5,6] муриновую модель СЛР используют для демонстрации иммуносупрессивного действия Новых Соединений. Клетки селезенки (0,5 10⁶) Balb/c мышей (самки, 8-10 недель) коинкубируют в течение 5 дней с 0,5 10⁶ облученных (2000 рад) или обработанных митомицином C клеток селезенки СВА мышей (самки, 8-10 недель). Облученные аллогенные клетки индуцируют пролиферативный ответ в Balb/с клетках селезенки, который может быть измерен путем включения в ДНК меченого предшественника. Так как стимуляторные клетки облучены (или обработаны митомицином C), то они на отзываются на Balb/c клетки пролиферацией, но сохраняют при этом свою антигенность. Антипролиферативное действие Новых Соединений в отношении Balb/c клеток измеряют в различных разведениях и вычисляют концентрацию, обеспечивающую 50% ингибирование клеточной пролиферации (ИК₅₀). Ингибирующую способность тестируемого образца можно сравнить с рапамицином и выразить в виде относительной ИК₅₀ (например, ИК₅₀ тестируемого образца/ИК₅₀ рапамицина).

2. ИЛ-6 опосредованная пролиферация.

Способность Новых Соединении повреждать фактор роста, ассоциированный с сигнальными путями, оценивают с помощью клеточной линии интерлейкин-6 (ИЛ-6)-зависимой мышиной гибридомы. Анализ проводят в 96-луночных микротитрационных планшетах. 5000 клеток/на лунку культивируют в бессывороточной среде [7, 8], обогащенной 1 нг рекомбинантного ИЛ-6/мл. После 66 часов инкубации в отсутствии или присутствии тестируемого образца, клетки обрабатывают 1 мкКи (3-Н)-тимидин/лунку в течение следующих 6 часов, их сбор и подсчет осуществляют посредством жидкостной сцинтилляции. Включение (3-Н)-тимидина в ДНК коррелирует с возрастанием количества клеток и таким образом является мерой клеточной пролиферации. Серии разведений тестируемого образца позволяют вычислять концентрацию, обеспечивающую 50% ингибирование клеточной пролиферации (ИК₅₀). Ингибирующую способность тестируемого образца можно сравнить с рапамицином и выразить в виде относительной ИК₅₀ (например, ИК₅₀ тестируемого образца/ИК₅₀, рапамицина).

3. Анализ на связывание макрофилина.

Известно, что рапамицин и структурно сходный с ним иммуносупрессант FK-506 связываются in vivo с макрофилином-12 (известным также как FK-506 связывающийся белок или FKBP-12), и считается, что это связывание соотносится с иммуносупрессивной активностью этих соединении. Новые Соединения также сильно связываются с макрофилином-12, как это продемонстрировано в опыте по конкурентному связыванию.

В этом опыте для покрытия микротитрационных лунок используют FK-506, иммобилированный на БСА. Биотинированный рекомбинантный человеческий макрофилин-12 (биот-МАФ) оставляют для связывания в присутствии или отсутствии тестируемого образца с иммобилизованным FK-506. После промывания (для удаления неспецифически связанного макрофилина) связанный биот-МАФ определяют путей инкубации с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза с последующей промывкой и добавлением р-нитрофенил-фосфата в качестве субстрата. Измеряют значения ОП при 405 нм. Связывание тестируемого образца с биот-МАФ приводит к уменьшению количества биот-МАФ, связанного с FK-506, и таким образом, к уменьшению ОП 405. Серии разведений тестируемого образца позволяют определить концентрацию, обеспечивающую 50% ингибирование биот-МАФ связывания с иммобилизованным FK-506 (ИК₅₀). Ингибирующую способность тестируемого образца сравнивают с ИК₅₀ свободного FK-506 в качестве стандарта и выражают в виде относительной ИК₅₀ (например, ИК₅₀ тестируемого образца/ИК₅₀ свободного FK-506).

4. Локализированная реакция "Трансплантат против хозяина" (ТпХ).

Эффективность Новых Соединении in vivo изучают на подходящей животной модели [9] . Клетки селезенки (1 10⁷) от 6-недельных самок Wistar/Furth (WF) крыс вводят подкожно на 0-е сутки в левую заднюю лапу самок (F344 х WF)F₁ крыс с весом около 100 г. Животных обрабатывают в течение следующих 4 дней и на 7-е сутки удаляют и взвешивают подколенные лимфатические узлы. Разницу в весе между двумя лимфатическими узлами используют в качестве параметра для оценки реакции.

5. Почечная аллотрансплантатная реакция у крысы.

Одну почку от самки fisher 344 крысы пересаживают в почечную лоханку однолатерально (левая сторона) нефрэктомизированного WF крысы-реципиента путем анастомоза "конец в конец". Уретральный анастомоз также относится к типу "конец в конец". Обработку начинают в день пересадки и продолжают в течение 14 суток. Спустя семь суток проводят нефрэктомию с противоположной стороны, оставляя реципиента на обеспечении донорной почки. Выживание реципиента трансплантата используют в качестве параметра для функционального трансплантата.

6. Экспериментально индуцируемый аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) у крыс.

Эффективность Новых Соединений в отношении ЭАЭ измеряют, например, описанным способом [10-12]. ЭАЭ является широко применяемой моделью множественного склероза. Самцов Wistar крыс инъецируют в задние лапы смесью бычьего спинного мозга и полного адъюванта Фройнда. Симптомы заболевания (паралич хвоста и обеих задних ног) обычно развиваются в течение 16 суток. Регистрируют количество заболевших животных, а также время начала заболевания.

7. Артрит, вызываемый адъювантом Фройнда.

Эффективность против экспериментально вызываемого артрита была продемонстрирована описанным способом [13, 14]. OFA и Wistar крысам (самцы и самки с весом тела 150 г) вводят внутрикожно в основание хвоста или в заднюю лапу 0,1 мл минерального масла, содержащего 0,6 мг лиофилизированной убитой теплом Mycobacterium smegmatis. В модели развивающегося артрита лечение начинают немедленно после инъекции адъюванта (1-18 сутки), в модели стабильного артрита лечение начинают на 14-е сутки, когда хорошо развивается вторичное воспаление (14-20 сутки). В конце эксперимента измеряют с помощью микроциркуля опухание суставов. ЭД₅₀ - это пероральная доза в мг/кг, которая уменьшает опухание (первичное или вторичное) наполовину по сравнению с контролем.

8. Противоопухолевая и МЛУ активность.

Противоопухолевую активность Новых Соединений и их способность усиливать действие противоопухолевых средств путем ослабления множественной лекарственной устойчивости демонстрируют, например, путем введения противоракового средства, например колхицина, или этопозида, в клетки, обладающие множественной лекарственной устойчивостью, и клетки, чувствительные к лекарственным препаратам, in vitro, или животным, имеющим опухоли или инфекции с множественной лекарственной устойчивостью, с параллельным введением тестируемых Новых Соединений или без него, а также путем введения только одних Новых Соединений.

Такое тестирование in vitro выполняют, используя любую соответствующую устойчивую к лекарственным препаратам клеточную линию и контрольную (родительскую) клеточную линию, полученные, например, как описано [15, 16]. Конкретными выбранными клонами являются линия chr с множественной лекарственной устойчивостью (например, устойчивостью к колхицину) (субклон C5S3.2) и родительская, чувствительная линия AUX В1 (субклон АВ1 S11).

In vivo противоопухолевую активность и анти-МЛУ активность демонстрируют, например, на мышах, инъецированных раковыми клетками с множественной лекарственной устойчивостью и чувствительными к лекарственным препаратам. Выращивают суб-линии асцитной карциномы Ehrlich'a (EA), устойчивые к лекарственным веществам, DR, VC, AM, ET, ТЕ или CC. путем непрерывного переноса EA клеток последовательным поколениям BALB/c мышей-хозяев [17].

Эквивалентные результаты могут быть получены с помощью тест-моделей для Новых Соединений со сравнимой схемой, например, in vitro, или с использованием опытных животных, инфицированных устойчивыми к лекарственным препаратам и чувствительными к лекарственным препаратам вирусными штаммами, антибиотикоустойчивыми (например, к пенициллину) и чувствительными бактериальными штаммами, грибными штаммами, устойчивыми и чувствительными к антимикотическим препаратам, а также устойчивыми к лекарственным препаратам штаммами простейших, например штаммами плазмодий, например суб-штаммами природного происхождения Plasmodium falciparum, обладающими приобретенной устойчивостью к химиотерапевтическим, антималярийным препаратам.

10. Стероидное потенцирование.

Макрофилин-связывающая активность Новых Соединений делает возможным их применение для усиления или потенцирования действия кортикостероидов. Комбинированная обработка соединениями по изобретению и кортикостероидом, таким как дексаметазон, приводит к сильному увеличению стероидальной активности. Это может быть продемонстрировано, например, в опыте с репортерным геном хлорамфениколацетилтрансферазы вируса муриновой опухоли молочной железы (МОМЖВ-ХАТ) [18]. Такой синергический эффект позволяет применять уменьшенные дозы кортикостероидов, уменьшая тем самым возможность побочного действия в отдельных случаях.

11. Ингибирование ПМИ и ПМИ-подобными факторами.

В добавление к вышесказанному, Новые Соединения связываются и блокируют различные ПМИ (потенциатор макрофаговой инфективности) ПМИ-подобные факторы, структурно сходные с макрофилином. ПМИ и ПМИ-подобные факторы являются факторами вирулентности, производимыми самыми разнообразными патогенами, включая патогены рода Chlamidia, например Chlamidia trachomatis; Neisseria, например Neisseria meningitidis; и Legionella, например Legionella pneumophilia, а также облигатными паразитами, представителями порядка Rickettsiales. Эти факторы играют решающую роль в возникновении внутриклеточной инфекции. Эффективность Новых Соединений в понижении инфективности патогенов, которые производят ПМИ или ПМИ-подобные факторы, может быть продемонстрирована путем сравнения инфективности патогенов в клеточной культуре в присутствии и отсутствии макролидов, например описанными способами [19].

Новые Соединения перспективны также для применения в опытах по выявлению присутствия или определению количества макрофилинсвязывающих соединений, например, в сравнительных анализах, в целях диагностики или скриннинга. Так, например, изобретение предлагает применять Новые Соединения в качестве средства скриннинга для определения присутствия макрофилинсвязывающих соединений в тестируемом растворе, например крови, кровяной сыворотке или тестируемом бульоне, который должен быть подвергнут скринингу. Лучше всего, чтобы Новое Соединение было иммобилизовано в микротитрационных лунках, после чего оно может связываться в присутствии и отсутствии тестируемого раствора с меченым макрофилином-12 (FKBR-12). В другом случае, FKBR-12 иммобилизован в микротитрационных лунках и оставлен для связывания в присутствии и отсутствии тестируемого раствора с Новым Соединением, которое было мечено, например, фторо-, ферментными или радио-метками, например, Новое Соединение, O-замещенное по C40 и/или C28 меченой группой. Планшеты промывают и измеряют количество связанного меченого соединения. Количество макрофилинсвязывающего вещества в тестируемом растворе приблизительно обратно пропорционально количеству связанного меченого соединения. Для количественных анализов строят стандартную кривую связывания, используя известные концентрации связывающего макрофилин соединения.

Примеры.

В следующих примерах для облегчения идентификации приводят характерные спектроскопические данные. Пики, которые не отличаются существенно от рапамицина, не включены. Биологические характеристики выражают в виде относительной ИК₅₀, сравниваемой с рапамицином в случае анализов смешанной лимфоцитарной реакции (СЛР) и ИЛ-6-зависимой пролиферации (ИЛ-6-зав. прол.) и сравниваемой с FK-506 при проведении анализа на связывание макрофилина (ACM). Более высокая ИК₅₀ коррелирует с более низким связывающим сродством.

FAB-ионизация быстрыми атомами.

Пример 1: 40-O-Бензил-рапамицин К перемешанному раствору 183 мг (0,200 ммоль) рапамицина в 1,1 мл 2:1 смеси циклогексан-метиленхлорид добавляют сначала 75 мкл (0,402 ммоль) бензил-трихлорацетимидата, а затем - 2,6 мкл (29 мкмоль 15 мол.%) трифторометансульфокислоты, после чего смесь немедленно желтеет. Спустя 3 часа смесь разбавляют этилацетатом и гасят 10%-ным водным бикарбонатом натрия. Слои разделяют и водный слой дважды экстрагируют этилацетатом. Объединенный органический раствор промывают 10%-ным водным бикарбонатом натрия, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (50:50 гексан-этилацетат), в результате получают 40-O-бензил-рапамицин в виде белого твердого аморфного вещества: ¹H-ЯМР (CDCl₃) 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (4H, s и m), 3,33 (3H, s), 3,49 (3H, s), 4,15 (1H, bd), 4,65 (1H, d), 4,71 (1H, d), 7,22-7,38 (5H, m); MC (FAB) m/e 1026 ([M+Na]⁺), 972 ([M-OCH₃)]⁺), 954 ([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

АСМ (отн. ИК₅₀) 1,8 ИЛ-6 зав. прол. (отн. ИК₅₀) 10 СЛР (отн. ИК₅₀) 110 Пример 2: 40-O-(4'-Гидроксиметил)бензил-рапамицин а) 40-O-[4'-(t-Бутилдиметилсилил)оксиметил]бензил-рапамицин К перемешанному охлажденному (-78^oC) раствору 345 мкл (2,0 ммоль) трифликового ангидрида в 5 мл метиленхлорида добавляют раствор 504 мг (2,0 ммоль) 4-(t-бутилдиметилсилил)оксиметил-бензилового спирта и 820 мг (4,0 ммоль) 2,6-ди-t-бутил-4-метил-пиридина в 5 мл метиленхлорида. Полученную смесь подогревают до -20^oC и продолжают перемешивание при этой температуре в течение 0,5 часа. Затем смесь снова охлаждают до -78^oC и добавляют раствор 914 мг (1,0 ммоль) рапамицина в 5 мл метиленхлорида. Смесь оставляют для нагрева до комнатной температуры в течение ночи, а затем гасят 10%-ным водным бикарбонатом натрия. Слои разделяют в экстрагируют водный слой этилацетатом. Объединенный органический раствор промывают насыщенным солевым раствором и сушат над сульфатом натрия, фильтруют при пониженном давлении и концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (50:50 гексан-этилацетат), в результате получают 40-O-[4'-(t-бутилдиметилсилил) оксиметил]бензил-рапамицин в виде белой пены: MC (FAB) m/e 1170 ([M+Na]⁺), 1098 ([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

б) 40-O-(4'-Гидроксиметил)бензил-рапамицин К перемешанному, охлажденному (0^oC) раствору 98 мг (0,093 ммоль) соединения, полученного в примере 2, в 2 мл ацетонитрила добавляют 0,2 мл HF-пиридина. Полученную смесь перемешивают в течение 2 часов и гасят водным бикарбонатом натрия, а затем экстрагируют этилацетатом. Органический раствор промывают рассолом, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (20:80 гексан-этилацетат), в результате получают соединение, указанное в заголовке, в виде белой пены: ¹ H-ЯМР (CDCl₃) 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,22 (1H, m), 4,67 (4H, m), 7,35 (4H, m); MC (FAB) m/e 1056 ([M+Na]⁺), 1002 ([M-OCH₃] ⁺), 984 ([M-(OCH₃+H₂O)] ⁺), 966 [М-(OCH₃+2H₂O)] ⁺), 934 ([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

АСМ (отн. ИК₅₀) 2,7 ИЛ-6 зав. прол. (отн. ИК₅₀) 3,9 СЛР (отн. ИК₅₀) 3 Пример 3: 40-O-[4'-(1,2-Дигидроксиэтил)]бензил-рапамицин а) 40-O-[4'-(2,2-Диметил-1,3-диоксолан-4-ил)]бензил-рапамицин В 10 мл смеси 1: 1 циклогексан-метиленхлорид растворяют 452 мг (1,24 ммоль) 4-(2,2-диметил-1,3-диоксаолан-4-ил)бензил трихлорацетимидата, затем - 0,14 мл (0,64 ммоль) 2,6-ди-t-бутилпиридина и 56 мкл (0,64 ммоль) трифторметансульфокислоты. К этой смеси добавляют раствор 587 мг (0,64 ммоль) рапамицина в 2 мл метиленхлорида. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и гасят водным бикарбонатом натрия. Слои разделяют, водный слой дважды экстрагируют этилацетатом. Объединенный органический раствор промывают насыщенным рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (50:50 гексан-этилацетат), в результате получают 40-O-[4'-(2,2-Диметил-1,3-диоксолан-4-ил)] бензил-рапамицин в виде белого, аморфного вещества: ¹H ЯМР (CDCl₃) 0,73 (1H, dd), 1,48 (3H, s), 1,55 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,67 (3H, m), 4,28 (1H, dd), 4,62 (1H, d) 4,69 (1H, d), 5,06 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MC (FAB) m/e 1126 ([M + Na]⁺), 1072 ([M-OCH₃] ⁺), 1054 ([M-(OCH₃+H₂O)] ⁺), 1014 ([M-(OCH₃+CH₃COCH₃)]⁺), 996 ([M-(OCH₃+H₂O+CH₃COCH₃)]⁺), 978 ([M-(OCH₃+2H₂O+CH₃COCH₃)]⁺). б) 40-O-[4'-(1,2-Дигидроксиэтил)]бензил-рапамицин К раствору 90,7 мг (0,08 ммоль) 40-O-[4'-(2,2-Диметил-1,3-диоксолан-4-ил)]бензил-рапамицина в 4 мл метанола добавляют 1 мл 1N водной HCl. Спустя 2 часа смесь гасят водным бикарбонатом натрия и экстрагируют дважды этилацетатом. Органический раствор промывают рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (этилацетат), в результате получают соединение, указанное в заголовке, в виде белой пены: ¹H-ЯМР (CDCl₃) 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,70 (4H, m), 4,63 (1H, d), 4,69 (1H, d), 4,80 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MC (FAB) m/e 1086 ([M+Na]⁺), 1032 ([M-OCH₃]⁺), 1014 ([M-(OCH₃+H₂O)] ⁺), 996 ([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺).

АСМ (отн. ИК₅₀) 0,92 ИЛ-6 зав. прол. (отн. ИК₅₀) 10,5 СЛР (отн. ИК₅₀) 22 Пример 4: 40-O-Аллил-рапамицин К перемешанному, охлажденному (-78^oC) раствору 0,33 мл (2,01 ммоль) трифликового ангидрида в 10 мл метиленхлорида медленно добавляют раствор 0,14 мл (2,06 ммоль) аллилового спирта и 0,42 г (2,04 ммоль) 2,6-ди-t-бутил-4-метил-пиридина в 5 мл метилен-хлорида. Полученный зеленоватый раствор перемешивают в течение 1,5 часа и добавляют раствор 915 мг (1,00 ммоль) рапамицина и 0,42 г (2,04 ммоль) 2,6-ди-t-бутил-4-метил-пиридина в 5 мл метиленхлорида. Перемешивание продолжают в течение 0,5 часа при -78^oC, а затем смесь нагревают до комнатной температуры. Спустя час смесь гасят водным бикарбонатом натрия и разделяют слои. Водный слой дважды экстрагируют этилацетатом. Объединенный органический раствор промывают водным бикарбонатом натрия и рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Полученное зеленое масло очищают хроматографически на колонке с силикагелем (60:40 гексан-этилацетат), в результате получают соединение, указанное в заголовке, в виде бесцветного аморфного вещества: ¹H ЯМР (CDCl₃) 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,05 (1H, m), 4,13 (2H, bd), 5,14 (2H, m), 5,27 (2H, m), 5,92 (2H, m): MC (FAB) m/e 976 ([M+Na]⁺), 922 ([M-OCH₃] ⁺), 904 ([M-(OCH₃-H₂O]⁺), 886 ([M(OCH₃+2H₂O)]⁺), 872 ([M-(2CH₃OH+OH)] ⁺), 854 ([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

ACM (отн, ИК₅₀) 1 ИЛ-6 зав. прол. (отн. ИК₅₀ ) 8 СЛР (отн. ИК₅₀) 260 Пример 5: 40-O-[3'-(2,2-Диметил-1,3-диоксолан-4(S)-ил)-проп-2'-ен-1'-ил] -рапамицин К перемешанному, охлажденному (-78^oC) раствору 0,64 г (4,00 ммоль) E-(4S)-4,5-0,0-изопропилиден-пент-2-ен-1,4,5-триола и 1,26 г (6,00 ммоль) 2,6-ди-t-бутил-4-метил-пиридина в 20 мл метиленхлорида добавляют 0,82 мл (5,00 ммоль) трифликового ангидрида. Полученную смесь перемешивают при этой температуре в течение 2 часов и добавляют раствор 1,82 г (2,00 ммоль) рапамицина и 1,26 г (6,00 ммоль) 2,6-ди-t-бутил-4-метил-пиридина в 5 мл метиленхлорида. Смесь оставляют на ночь для постепенного нагрева до комнатной температуры, а затем гасят водным бикарбонатом натрия. Слои разделяют, водный слой экстрагируют три раза этилацетатом. Органический раствор промывают водным бикарбонатом натрия и рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (40:60 гексан-этилацетат), в результате получают соединение, указанное в заголовке, в виде твердого белого вещества: ¹H ЯМР (CDCl₃) 0,72 (1H, dd), 1,38 (3H, s), 1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,58 (2H, m), 4,08 (1H, dd), 4,15 (2H, m), 4,52 (1H, bdd), 5,72 (1H, m), 5,88 (1H, m); MC (FAB) m/e 1076 ([M+Na]⁺), 1022 ([M-OCH₃]⁺), 1004 ([M-(OCH₃+H₂)]⁺), 964 ([M-(OCH₃+CH₃COCH₃)]⁺), 946 ([M(OCH₃+H₂O+CH₃COCH₃)]⁺), 946 ([M-(OCH₃+2H₂O+CH₃COCH₃)]⁺).

АСМ (отн. ИК₅₀) 0,64 ИЛ-6 зав. прол. (отн. ИК₅₀) 11 СЛР (отн. ИК₅₀) 8 Пример 6: (2'E, 4'S)-40-O-(4',5'-Дигидроксипент-2'-ен-1'-ил)-рапамицин Условия, описанные в примере 3, стадия б), в применении к соединению, полученному в предыдущем примере, с последующей хроматографической очисткой на колонке с силикагелем (95:5 этилацетат-метанол), обеспечивают получение соединения, указанного в заголовке, в виде белой пены: ¹H ЯМР (CDCl₃) 0,68 (1H, dd), 3,04 (1H, m), 4,18 (5H, m), 5,75 (1H, dd), 5,88 (1H, m); MC (FAB) m/e 1036 ([M+Na] ⁺), 1013 (M⁺), 995 ([M-H₂O]⁺), 982 ([M-OCH₃]⁺), 964 ([M-(OCH₃+H₂O)] ⁺), 946 ([M-(OCH₃+2H₂O)] ⁺), 832 ([M-(2CH₃OH+OH)]⁺), 914 ([M-(OCH₃+CH₃OH+2H₂O)]⁺).

АСМ (отн. ИК₅₀) 1,7 ИЛ-6 зав. прол. (отн. ИК₅₀) 12 СЛР (отн. ИК₅₀) 3,5 Пример 7: 40-O-(2-Гидрокси)этоксикарбонилметил-рапамицин а) 40-O-[2-(t-Бутилдиметилсилил)окси]этоксикарбонилметил-рапамицин К перемешанному раствору 2,74 г (3,00 ммоль) рапамицина и 30 мг (0,06 ммоль) дигидрата тетраацетата диродиума в 30 мл метиленхлорида добавляют раствор 0,38 мл (3,60 ммоль) 2-(t-бутилдиметилсилил)оксиэтилдиазоацетата в 10 мл метиленхлорида в течение свыше 5 ч. После того, как добавление закончено, продолжают перемешивание в течение еще одного часа, затем реакцию останавливают 1N водной HCl. Слои разделяют, водный слой экстрагируют этилацетатом. Объединенный органический раствор промывают водным бикарбонатом натрия и рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (40: 60 гексан-этилацетат), в результате получают 40-O-[2-(t-бутилдиметилсилил)окси] этоксикарбонилметил-рапамицин: ¹H ЯМР (CDCl₃) 0,06 (6H, s), 0,68 (1H, dd), 0,88 (9H, s), 1,64 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (5H, s и m), 3,81 (2H, dd), 4,19 (2H, dd), 4,32 (2H, s); MC (FAB) m/e 1152 ([M+Na]⁺), 1080 ([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

б) 40-O-(2-Гидрокси)этоксикарбонилметил-рапамицин К перемешанному, охлажденному (0^oC) раствору 81 мг (0,07 ммоль) 40-O-[2-(t-бутилдиметилсилил)окси] этоксикарбонилметил-рапамицина в 1,5 мл ацетонитрила добавляют 0,15 мл HF-пиридина. Спустя 2 часа реакцию останавливают водным бикарбонатом натрия. Смесь экстрагируют этилацетатом. Органический раствор промывают рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают посредством ПТСХ (этилацетат), в результате получают соединение, указанное в заголовке, в виде твердого белого вещества: ¹H ЯМР (CDCl₃) 0,70 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,13 (5H, s и m), 3,85 (3H, m), 4,25 (5H, m); MC (FAB) m/e 1038 ([M+Na]⁺), 984 ([M-OCH₃] ⁺), 966 ([M-(OCH₃+H₂O)]⁺), 948 ([M-(OCH₃+2H₂O)]⁺).

АСМ (отн. ИК₅₀) 4 ИЛ-6 зав. прол. (отн. ИК₅₀) 9,7 СЛР (отн. ИК₅₀) 2,1 Пример 8: 40-O-(2-Гидрокси)этил-рапамицин а) 40-O-[2-(t-Бутилдиметилсилил)окси]этил-рапамицин Раствор 9,14 г (10 ммоль) рапамицина и 4,70 мл (40 ммоль) 2,6-лутидина в 30 мл толуола нагревают до 60^oC и добавляют к нему раствор 6,17 г (20 ммоль) 2-(t-бутилдиметилсилил)оксиэтилтрифлата и 2,35 мл (20 ммоль) 2,6-лутидина в 20 мл толуола. Эту смесь перемешивают в течение 1,5 часа. Затем с интервалом в 1,5 ч добавляют две порции раствора 3,08 г (10 ммоль) трифлата и 1,2 мл (10 ммоль) 2,6-лутидина в 10 мл толуола. После добавления последней порции перемешивание продолжают при 60^oC в течение 2 часов, а полученную коричневую суспензию фильтруют. Фильтрат разбавляют этилацетатом и промывают водным бикарбонатом натрия и рассолом. Органический раствор сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют. Остаток чистят хроматографически на колонке с силикагелем (40:60 гексан-этилацетат), в результате получают 40-O-[2-(t-бутилдиметилсилил)-окси] этил-рапамицина в виде твердого белого вещества: ¹H ЯМР (CDCl₃) 0,06 (6H, s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m); MC (FAB) m/e 1094 ([M+Na]⁺), 1022 ([M-(OCH₃+H₂O)]⁺).

б) 40-O-(2-Гидрокси)этил-рапамицин К перемешанному, охлажденному (0^oC) раствору 4,5 г (4,2 ммоль) 40-O-[2-(t-бутилдиметилсилил)окси] -этил-рапамицина в 20 мл метанола добавляют 2 мл 1N HCl.