Полинуклеотидная последовательность (варианты), полипептид (варианты), слитый белок, фармацевтическая композиция, моноклональное антитело, штамм гибридных культивируемых клеток

Полинуклеотидная последовательность (варианты), полипептид (варианты), слитый белок, фармацевтическая композиция, моноклональное антитело, штамм гибридных культивируемых клеток

Реферат

 

Изобретение относится к полипептидэкспрессирующим системам, требующим расщепления продукта-предшественника, к новому полипептиду, способному к восстановлению дихлориндофенола и окисленного глутатиона, к ДНК, кодирующей этот полипетид, фармкомпозициям, включающим данный полипептид, моноклональным антителам против указанного полипептида. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, характеризуется структурной формулой А-В-С. А представляет последовательность нуклеотидов 10-1311 в SEQ ID NO. В представляет собой Asn-Cys-Ser-Phe-Gln. С представляет собой последовательность, кодирующую полипептид КМ31-7. Полипептид КМ31-7 имеет аминокислотную последовательность 1-526 в SEQ ID 12. Фармацевтическая композиция содержит полипетид КМ3 1-7 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем для него. Моноклональное антитело специфически взаимодействует с полипептидом КМ31-7. Оно продуцируется штаммом гибридных культивируемых клеток Mus musculus МКМ 150-2 FERM ВР-5086. Относится к изотипу Ig G1. Изобретение позволяет получить новый полипептид, обладающий восстанавливающей активностью in vivo и может быть использован для лечения заболеваний, вызванных окислительным стрессом. 9 c. и 2 з.п.ф-лы, 14 ил.

Изобретение относится к полипептид-экспрессирующим системам, требующим расщепления продукта-предшественника, а также к протеазам, используемым в этих системах. Кроме того, настоящее изобретение относится к новому полипептиду, способному к восстановлению дихлороиндолфенола и окисленного глутатиона, к ДНК, кодирующей указанный новый полипептид, к векторам, содержащим указанную ДНК, к клеткам-хозяевам, трансформированным указанными векторами, и к фармацевтическим композициям, содержащим указанный полипептид. Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам против указанного полипептида и к способу выделения и очистки этого полипептида с использованием указанных антител.

Предшествующий уровень техники Потивирусы представляют собой группу вирусов, которые имеют геном, состоящий приблизительно из 10 000 оснований одноцепочечной РНК, и которые инфицируют растения, например растения семейства Пасленовых (Solancede). Геном потивируса отличается тем, что он имеет исключительно длинную открытую рамку считывания (ORF) (Dougherty, W.G. & Hiebert, E. (1980) Virology 101, 466-474, Allison, R. et. al. (1986), Virology 154: 9-20). Для экспрессии отдельных белков, кодируемых внутри ORF, транслированный полипротеин переваривается двумя типами протеаз, которые также кодируются внутри (Dougherty, W. G & Carrington, R. et. al., (1988), Ann. Rev. Phutopath 26: 23-143).

Вирус табачной гравировки (TEV) является членом семейства потивирусов и продуцирует ядерные включения, которые в инфицированных клетках могут быть окрашены трипановым синим. Эти ядерные включения состоят, по-видимому, из двух видов белка, один из которых, как было установлено, является вирусной протеазой, обозначенной "ядерным включением a" или Nla (J. Virol., 61 2540-2548 (1987)).

Протеазы потивирусов, именуемые ядерным включением a, распознают и расщепляют пептидную последовательность, которая включает в себя один из Gln-Cly, Gln-Ser, и Cln-Ala, и которая является, очевидно, гексамерной последовательностью, находящейся у C-конца рассматриваемого Nla внутри полипротеина. Это расщепление происходит между двумя остатками, образующими вышеуказанные димеры.

Были определены полные геномные последовательности TEV и вируса стеблевой пятнистости табака (TYMV), другого члена семейства потивирусов, и в результате гомологических исследований этих последовательностей было установлено, что Nla этих вирусов локализуются в их соответствующих геномах. (Virology 154, 9-20 (1986), Nucleic Acids Res., 14: 5417-5430 (1986)).

Вирус желтой прожилковой мозаики клевера, или CYVV, также является потивирусом. До настоящего времени был секвенирован только лишь ген, расположенный у 3'-конца генома CYVV, вместе с белком оболочки, который этот ген кодирует (Uyeda, 1. et al., (1991), Intervirol 32: 234-245). Однако до сих пор структура Nla-области этого генома остается невыявленной, и, кроме того, само включение Nla не было выделено.

Продуцирование экзогенных белков с помощью экспрессирующих систем может быть осуществлено непосредственно с использованием хорошо известной техники. Однако существует множество полипептидов, которые не могут быть легко экспрессированы в экзогенных системах. Проблема заключается в том, что эти полипептиды не могут быть синтезированы в больших количествах, и простое введение регуляторного элемента выше указанного гена не приводит к желаемому результату. Альтернативно, может оказаться так, что посттранскрипционный процессинг, необходимый для образования зрелой формы белка, либо вовсе не происходит, либо происходит неправильно.

Так, например, трансляция многих эукариотических полипептидов начинается с N-концевого метионина, который затем делетируется с образованием зрелой формы. В прокариотах такого процессинга не происходит, а поэтому необходимо было найти альтернативный способ достижения экспрессии. Один из таких способов предусматривает сшивание нужного экзогенного белка, например, с мальтозу-связывающим белком или глутатион-S-трансферазов, а затем очистку синтезированного гибридного белка с последующим его расщеплением протеазой, такой как фактор Xa, энтерокиназа, или тромбин. Основной недостаток этого трудоемкого способа заключается в том, что он требует две стадии очистки, что приводит к значительной потере конечного продукта.

В патенте США N 5162601 раскрывается использование TEV-протеазы в синтезе полипротеина, содержащего между белками линкерные последовательности, что является желательным для синтеза полипептида, такого как чел. tPA. Однако в этом патенте описывается лишь клонирование мультигена, кодирующего указанный полипротеин, в хозяйскую клетку, но не описываются ни экспрессия, ни очистка протеолитически расщепленного конечного продукта.

Кислород для метаболической энергии, обычно, поставляется окисляющими агентами, присутствующими в окружающей клетку среде. Активированной формой, в виде которой обычно потребляется кислород, являются свободные радикалы, такие как супероксид (O₂^-), пероксид (H₂O₂), или гидроксильный радикал (OH^-), при этом все указанные радикалы, после их использования, восстанавливаются с образованием воды (H₂O). Газообразный кислород, сам по себе, является очень хорошим окислителем, однако используемый в настоящем описании термин "активированный кислород" относится к кислороду или кислородсодержащим молекулам, обладающим более высоким окисляющим потенциалом, чем атмосферный кислород. Наиболее эффективной формой активированного кислорода является свободный радикал, который представляет собой молекулу или атом, имеющие один или несколько неспаренных электронов.

Свободные радикалы, обычно, являются нестабильными, и без соответствующего контроля они могут денатурировать липиды, белки и нуклеиновые кислоты. А поэтому, хотя активированный кислород необходим для жизнеобеспечения, он может представлять значительную опасность для здоровья человека, в результате чего его количество в организме должно быть строго регулируемым. Благодаря своей высокой реакционной способности активированный кислород, даже в ничтожно малых количествах, может вызывать определенные нарушения в организме. Поэтому высокоактивные формы кислорода способны даже убить живую клетку, если только эта клетка не обладает механизмами защиты от указанного поврежденного действия кислорода.

В окружающей клетку среде локализация, количество и время генерации активированного кислорода должно быть тщательно сбалансировано в отношении способности клетки нейтрализовать его повреждающее действие. Эта способность, обычно, обеспечивается механизмами защиты клетки, использующей в этих целях свои собственные антиоксиданты или антиокислительные ферменты. В контексте настоящего описания термин "антиоксидант" используется как общее название для всех природных соединений, обладающих способностью предупреждать или ингибировать самоокисление, например, липидов. Термин "антиокислительный фермент" означает в основном фермент, который катализирует реакцию элиминирования активированного кислорода, а термин "антиокисляющее действие" означает, соответственно, действие, направленное на элиминирование указанного активированного кислорода.

Избыточное количество активированного кислорода в организме может индуцировать ряд патологических явлений в этом организме, сходных с явлениями, вызванными стрессом, принятием лекарственного средства, курением, хирургической операцией, трансплантацией какого-либо органа, либо явлениями, вызванными ишемией, или даже инфарктом головного мозга или миокарда. Под большими количествами кислорода подразумеваются количества, превышающие тот уровень кислорода, который регулирующие системы организма способны элиминировать, а поэтому указанные избыточные количества кислорода обладают токсическим действием на организм, вызывая серьезные нарушения в жизнедеятельности его клеток. Это токсическое действие, названное иначе окислительным стрессом, является ответственным за возникновение многих патологических состояний организма.

Так, например, считается, что одна из причин возникновения атеросклероза является продуцирование липопротеинов низкой плотности, которые были окислены активированным кислородом (Steinberg, D. (1983), Arterioslerosis 3, 283-301). Считается также, что окислительный стресс имеет непосредственное отношение к механизмам возникновения метаболических нарушений и васкулярных осложнений диабета (Kondo, M. ed., "Approaches from Modern Medicine (4) Free Radicals", Medical View Pub., pp. 138-146).

Активированный кислород также является причиной возникновения других патологических состояний и нарушений, например, таких, как ишемические нарушения (реперфузионные повреждения, ишемическая болезнь сердца, ишемия головного мозга, ишемический энтерит и т.п.), отеки, сосудистая сверхпроницаемость, воспалительные заболевания, повреждения слизистой желудка, острый панкреатит, болезнь Крока, язвенный колит, заболевания печени, болезнь Paraquat, эмфизема легких, химический карцерогенез, метастазы рака, респираторный дистресс-синдром у взрослых, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови (ДВС-синдром), катаракта, ретролетальная фиброплазия, аутоиммунные заболевания, порфиремия, гемолиз, эритробластическая (среднеземноморская) анемия, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, эпилепсия, нарушения, вызванные ультрафиолетовым излучением, нарушения, вызванные радиоактивным излучением (лучевая болезнь), отморожения и ожоги.

Клетки имеют несколько внутренних и внешних механизмов защиты, направленных исключительно на элиминирование активированного кислорода, генерируемого внутри организма.

Известно, что внутриклеточные средства защиты, а именно антиоксиданты и антиокислительные ферменты, примеры которых приведены ниже, утилизируют и элиминируют активированный кислород. Так, например, в пероксисомах клетки присутствует каталаза, которая восстанавливает и удаляет пероксид водорода. Глутатион-пероксидаза, присутствующая в цитоплазме и митохондриях, катализирует восстановление и детоксикацию пероксида водорода и пероксидов липида в присутствии восстановленного глутатиона. Трансферрин, ферритин и лактоферрин, например, ингибируют генерирование активированного кислорода путем стабилизации ионов железа, тогда как церулоплазмин осуществляет аналогичную функцию в отношении ионов меди. Кроме того, в цитоплазме и митохондриях имеется супероксиддисмутаза, катализирующая восстановление супероксидов с образованием перекиси водорода, который затем элиминируется каталазой. Помимо вышеуказанных ферментов, способностью к восстановлению и элиминированию активированного кислорода обладают также витамины C и E, восстановленный глутатион и другие низкомолекулярные соединения.

С другой стороны, такие агенты, как внеклеточная супероксиддисмутаза, внеклеточная глутатионпероксидаза, и восстановленный глутатион присутствуют во внеклеточном пространстве, где они имеют те же самые функции, что и их внутриклеточные аналоги, описанные выше. Однако по сравнению с ситуацией, имеющей место внутри клетки, во внеклеточной среде присутствует гораздо меньшее число различных видов антиоксидантов и антиокислительных ферментов, и, кроме того, лишь немногие из них обладают антиокислительным действием.

Восстановленный глутатион, формула которого представлена ниже, играет главную роль в поддержании восстановительного состояния как вне, так и внутри клетки. Впервые глутатион был обнаружен в дрожжах в 1888 году de-Rey-Pailhade, и свое название глутатион получил после его выделения как соединения в 1921 году Хопкинсом.

Глутатион состоит из трех аминокислот: глутаминовой кислоты, цистеина и глицина. Тиоловые группы двух молекул глутатиона могут быть окислены с образованием дисульфидной связи в присутствии активированного кислорода, что приводит к восстановлению указанного активированного кислорода.

Глутатион продуцируется главным образом в печени, после чего он попадает в кровоток и циркулирует в организме. В нормальном организме глутатион, почти полностью, присутствует в восстановленной форме. В случае увеличения уровней окисленной формы происходит регенерация восстановленной формы благодаря действию глутатионредуктазы в присутствии никотинамидаденин-динуклеотидфосфата (НАДФ). Таким образом, восстановленный глутатион защищает клеточную мембрану от повреждающего действия активированного кислорода путем восстановления указанного активированного кислорода и свободных радикалов. Благодаря своим антиокислительным свойствам восстановленный глутатион обладает также противорадиационным действием и может быть использован как терапевтическое средство против катаракты. Кроме того, недавно было установлено, что у пациентов, страдающих СПИДом, системные уровни восстановленного глутатиона понижены, что указывает на исключительно важную роль восстановленного глутатиона в организме человека. Однако в аномальных условиях количество активированного кислорода может быть настолько велико, что фактически весь глутатион присутствует в окисленном состоянии, и активированный кислород удаляется гораздо медленней, чем это обычно происходит в нормальных условиях.

Вторым примером соединения, обладающего, благодаря своим окислительным свойствам, различными физиологическими функциями, является тиоредоксин, присутствующий как во внутриклеточном, так и во внеклеточном пространстве. Тиоредоксин человека (известный также, как фактор T-клеточного лейкоза взрослых, ADF) был клонирован как фактор, способный индуцировать рецепторы интерлейкина-2 (1L-2R) в клеточных линиях T-клеточного лейкоза взрослых. Этот фактор представляет собой тиол-зависимую редуктазу, имеющую в своем активном центре два цистеиновых остатка и обладающую способностью восстанавливать активированный кислород и свободные радикалы.

Помимо индуцирования 1L-2-рецепторов, тиоредоксин человека также обладает действием, стимулирующим рост клеток B-клеточного штамма 3B6, инфицированного вирусом Эпштейна - Барра (EBV), защитным действием против фактора некроза опухоли (TNF), происходящего от моноцитарной клеточной линии U937, и защитным действием против повреждения васкулярных эндотелиальных клеток нейтрофилами. Кроме того, благодаря своей восстановительной активности внутри клетки, тиоредоксин человека воздействует на транскрипционные факторы NFkB, JUN и FOS, что способствует стимулированию ДНК-связывающей активности и тем самым повышению транскрипционной активности. В настоящее время разрабатывается способ использования тиоредоксина человека в качестве защитного средства от радиационных поражений, а также в качестве терапевтического средства для лечения реперфузионных повреждений, ревматоидного артрита и воспалительных заболеваний, одним словом, таких повреждений и заболеваний, которые могут быть устранены или уменьшены посредством восстанавливающей активности указанного тиоредоксина человека.

Как указывалось выше, для нормальной физиологической деятельности организма крайне важно, чтобы внутриклеточное и внеклеточное пространство поддерживалось в восстановительных условиях, что может быть достигнуто путем элиминирования активированного кислорода и свободных радикалов. Очевидно, что во внутриклеточном и внеклеточном пространстве присутствует много пока еще неизвестных антиоксидантов и антиокислительных ферментов, выполняющих функцию удаления активированного кислорода и свободных радикалов. Поэтому было бы крайне важно обнаружить эти восстановительные агенты, способные регенерировать, например, восстановленный глутатион. Такие вещества модно было использовать для лечения различных патологических состояний, например заболеваний и нарушений, описанных выше.

Краткое описание изобретения.

Первой целью настоящего изобретения является получение новой протеазы; нуклеотидной последовательности, кодирующей эту протеазу; вектора, содержащего ДНК-последовательность, кодирующую указанную протеазу, и клетки-хозяина, трансформированной указанным вектором.

Второй целью настоящего изобретения является получение ДНК, кодирующей нужный белок, а также ДНК, кодирующей новую протеазу, расположенную выше от указанного белка, причем нуклеотидная последовательность, находящаяся между указанными двумя ДНК-последовательностями, кроме того, кодирует пептид, расщепляемый указанной протеазой, а все указанные последовательности находятся в одной и той же открытой рамке считывания. Кроме того, целью настоящего изобретения является получение белка, кодируемого указанной ДНК, а также вектора, содержащего указанную ДНК, и экспрессирующей системы, включающей в себя указанный вектор, причем указанный вектор обладает способностью к автономной репликации в соответствующей клетке-хозяине, например, в клетке, содержащей нуклеотидную последовательность, необходимую для осуществления автономной репликации.

В альтернативном варианте, первой целью настоящего изобретения является получение нуклеотидной последовательности, кодирующей новый полипептид, обладающий восстанавливающей активностью in vivo. Кроме того, целью настоящего изобретения является также получение такой ДНК-последовательности, которая кодирует пептид, способный восстанавливать дихлороиндофенол и окисленный глутатион.

Другой целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного вектора, содержащего вышеуказанную ДНК и обладающего способностью к автономной репликации в клетке-хозяине, а именно в клетке, включающей в себя последовательность оснований, обеспечивающую указанную автономную репликацию.

Еще одной целью настоящего изобретения является продуцирование микроорганизма-хозяина, трансформированного с использованием вышеуказанного рекомбинантного вектора. Кроме того, целью настоящего изобретения является получение вышеупомянутого пептида в качестве продукта экспрессии трансформированной клетки-хозяина, а также получение моноклональных антител против этого пептида.

В данной работе мы идентифицировали и клонировали новую CYVV-протеазу (Nla), и при этом, неожиданно обнаружили, что CYVV-Nla может быть использована как часть гибридного белка, способного экспрессироваться в таком хозяине, как E.coli, что позволяет продуцировать большие количества указанного гибридного белка, который, кроме того, обладает способностью к саморасщеплению с образованием нужного экзогенного продукта. При этом CYVV-Nla-ген может стабильно сохраняться и экспрессироваться в Esherichia coli, а экспрессированный Nla-продукт сохраняет свою активность как специфическую протеазную активность даже в том случае, если указанный белок составляет лишь часть от данного гибридного белка.

Кроме того, мы также обнаружили ДНК-последовательность, кодирующую новый полипептид, обладающий способностью восстанавливать дихлороиндофенол (известный также, как дихлорофенолиндофенол, 2,6-дихлороиндофенол, или 2,6-дихлоро-4-(4-гидроксифенил)имино-2,5-циклогексадиен-1-он), и окисленный глутатион, причем указанный полипептид может быть получен в больших количествах путем использования техники генной инженерии. Этот полипептид может быть с особой эффективностью использован для лечения заболеваний, вызванных или опосредованных окислительным стрессом, или любых других заболеваний, вызванных активированным кислородом, например, таких, как атеросклероз, диабет, и ишемические состояния (включая реперфузионные нарушения, ишемическая болезнь сердца, цереброишемия и ишемический энтерит).

Так, например, в первом аспекте первого варианта своего осуществления, настоящее изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, которая, в направлении 5_ 3 и в той же самой открытой рамке считывания, включает в себя: а) последовательность, кодирующую белок "ядерного включения а" вируса желтой прижилковой мозаики клевера, либо его мутант или вариант, обладающий такой же протеолитической специфичностью, что и белок "ядерного включения а" вируса желтой прижилковой мозаики клевера, b) последовательность, кодирующую пептид, распознаваемый и расщепляемый указанным белком "ядерного включения а" вируса желтой прижилковой мозаики клевера, либо его мутантом или вариантом, с) по крайней мере одну последовательность, кодирующую полипептид.

Настоящее изобретение также относится к последовательности, кодирующей белок "ядерного включения а" вируса желтой прижилковой мозаики клевера, либо его мутант или вариант, обладающий такой же протеолитической специфичностью, что и указанный белок "ядерного включения а" вируса желтой прижилковой мозаики клевера.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору, в частности к экспрессирующему вектору, содержащему последовательность, определенную выше.

Настоящее изобретение также относится к хозяину, трансформированному вектором, определенным выше; к экспрессирующей системе, включающей в себя указанного хозяина и указанный экспрессирующий вектор, а также к полипептиду, продуцированному указанной экспрессирующей системой.

В первом аспекте альтернативного варианта своего осуществления, настоящее изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из аминокислот 1-526 последовательности ID N 12, либо кодирующей мутант или вариант указанного полипептида при условии, что полипептид, кодированный указанной полинуклеотидной последовательностью, обладает способностью восстанавливать дихлороиндофенол и окисленный глутатион.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору, в частности к экспрессирующему вектору, содержащему последовательность, определенную выше.

Настоящее изобретение также относится к хозяину, трансформированному вектором, определенным выше, к экспрессирующей системе, включающей в себя указанного хозяина и указанный экспрессирующий вектор, а также к полипептиду, продуцированному указанной экспрессирующей системой.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вышеуказанному полипептиду, который может быть использован в терапевтических целях, к использованию указанного полипептида для лечения и профилактики заболеваний или состояний, вызванных или опосредованных окислительным стрессом, или любых других заболеваний, вызванных активированным кислородом, а также к фармацевтической композиции, содержащей указанный полипептид.

Помимо вышеуказанного, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу и его эквивалентам, направленным против указанного полипептида, к способу продуцирования этого антитела, а также к способу очистки полипептида с использованием указанного антитела.

Краткое описание фиг. 1 - 7, 8а, 8b, 9 - 13 Настоящее изобретение иллюстрируется фиг. 1 - 7, 8а, 8b, 9 - 13, описание которых приводится ниже.

На фиг. 1 показана рестрикционная карта кДНК Nla-области, выделенной из CYVV-кДНК.

На фиг. 2 проиллюстрировано конструирование плазмиды pKN15', содержащей 5'-область "ядерного включения а" (Nla).

На фиг. 3 проиллюстрировано конструирование плазмиды pKN151L, содержащей часть 1L-11-гена и 5'-область Nla.

На фиг. 4 показаны праймеры, которые были использованы для получения 5' 1L-ДНК-фрагмента и C1N3-ДНК-фрагмента, и в который 3'-конец Nla-гена был сшит с 5'-концом 1L-11-гена.

На фиг. 5 проиллюстрировано лигирование C1N3-ДНК-фрагмента и 5'-1L-ДНК фрагмента с помощью полимеразно-цепной реакции.

На фиг. 6 проиллюстрировано конструирование плазмиды pK SUN 9.

На фиг. 7 показана рестрикционная карта плазмиды PUCKM31-7.

На фиг. 8a и b проиллюстрировано сравнение нуклеотидных последовательностей 3'-концов в pUCKM31-7 и pcD-31.

На фиг. 9 показана диаграмма конструирования pSR 31-7.

На фиг. 10 показана схема введения последовательности, кодирующей гистидиновый гексамер, в плазмиду pUCKM31-7.

На фиг. 11 показана схема конструирования плазмиды pMAL31-7.

На фиг. 12 проиллюстрирован анализ дихлорфенол-индофенол-восстанавливающей активности.

На фиг. 13 проиллюстрировано определение активности, направленной на восстановление окисленного глутатиона.

Подробное описание изобретения Нижеприведенное описание настоящего изобретения относится главным образом к первому варианту его осуществления, однако это описание может быть также отнесено и ко второму его варианту, за исключением тех случаев, когда совершенно очевидно, что данное обсуждение не может быть применено к указанному второму варианту.

При этом следует отметить, что предпочтительной формой полинуклеотидной последовательности настоящего изобретения является ДНК, а поэтому дальнейшее описание будет относиться в основном к ДНК. Однако там, где это необходимо, в описании имеются также указания на РНК. РНК не является предпочтительной формой нуклеотидной последовательности для настоящего изобретения, поскольку ее использование практически ограничено. Например, мРНК может быть экспрессирована в социтах Xenopus (шпорцевой лягушки) или в системе лизатов пшеничных проростков, однако ни одна из этих экспрессирующих систем не способна экономически эффективно продуцировать большие количества гибридного белка.

Используемый в настоящем описании термин "пептид" означает любую молекулу, содержащую 2 или более аминокислот, связанных между собой пептидной связью. Этот термин может означать олигопептид, полипептид или белок. Термин "гибридный белок" относится к любому отдельно взятому полипептиду, полученному путем объединения двух или более различных пептидных последовательностей.

Следует также отметить, что предпочтительной последовательностью настоящего изобретения является двухцепочечная последовательность; при этом в настоящем изобретении также рассматривается антисмысловая последовательность, соответствующая последовательности настоящего изобретения. Двухцепочечная (дц) последовательность настоящего изобретения может иметь один или два "липких" конца, и в этом случае, необязательно, чтобы антисмысловая и смысловая нити точно соответствовали друг другу.

При этом имеется в виду, что белок, кодируемый последовательностью (а), определенной выше, расщепляет пептид, кодируемый последовательностью (b), определенной выше, в результате чего высвобождается полипептид(ы), кодируемый последовательностью (с), определенной выше, при условии, что указанная последовательность настоящего изобретения экспрессируется в подходящей экспрессирующей системе.

Расщепление гибридного белка может иметь место в любое время после трансляции последовательностей (а) и (b), определенных выше. В этой связи следует заметить, что полипептид, кодированный последовательностью (c), определенной выше, необязательно должен быть полностью транслирован перед расщеплением. На практике, однако, было обнаружено, что по крайней мере некоторая часть, а иногда и большая часть гибридного белка является полностью транслированной перед его расщеплением.

Если последовательность (c), определенная выше, кодирует более чем один полипептид, то в этом случае необходимо, чтобы, кроме того, кодировались расщепляемые последовательности, расположенные между каждыми из кодированных полипептидов, за исключением лишь тех случаев, когда требуется получить нерасщепленный гибрид из множества полипептидов.

Если последовательность (c), определенная выше, кодирует более чем один полипептид, то эта последовательность может быть восприимчивой к аттенюации в условиях транскрипции. При аттенюации транскрипция мРНК-последовательности настоящего изобретения прекращается до того, как будет прочитана вся мРНК, в результате чего полипептиды, кодируемые ближе к 3'-концу последовательности, будут продуцироваться в меньших количествах, чем полипептиды, кодируемые ближе к 5'-концу. Однако если не кодируется несколько полипептидов и/или, если эти полипептиды не являются очень длинными, то каких-либо проблем, связанных с аттенюацией, не возникает.

В основном предпочтительно, чтобы последовательность (c), определенная выше, кодировала только один полипептид, за исключением тех случаев, когда необходимо получить несколько пептидов для их совместного использования, либо, когда необходимо получить гибрид из нескольких полипептидов. В противном случае, после расщепления потребуется выделять каждый отдельный полипептид, а эта операция может оказаться весьма трудоемкой, и, кроме того, процедуры очистки могут привести к значительным потерям конечного продукта.

Однако если последовательность (c), определенная выше, кодирует более чем один полипептид, и если между каждыми из этих кодируемых полипептидов имеется расщепляемая последовательность, то совсем необязательно, чтобы эти расщепляемые последовательности распознавались CYVV-Nla. Все, что требуется в этом случае, это, чтобы расщепляемая последовательность, находящаяся между последовательностью (а) и 5'-концом последовательности (b), распознавалась протеазой, кодируемой последовательностью (a). Однако если необходимо или допустимо, чтобы гибридный белок подвергался саморасщеплению с образованием нескольких полипептидов, то любая другая из расщепляемых последовательностей может быть распознаваемой протеазой, кодированной последовательностью (a). Причем указанные другие последовательности могут быть выбраны таким образом, чтобы они расщеплялись другими путями. Например, гибридный белок будет расщепляться своей Nla-частью после транскрипции с образованием в результате Nla и полипротеина, после чего Nla может быть удалена, а полипротеин может быть расщеплен, например, фактором Xa или трипсином.

Расщепляемый пептид, кодированный последовательностью (b), определенной выше (именуемой также "расщепляемой последовательностью" и "расщепляемым пептидом") может представлять собой последовательность, которая целиком или частично входит в состав любой из последовательностей, кодируемых последовательностями (a) и (c) ("Nla" или "протеаза" и "полипептид" соответственно). Так, например, N-конец расщепляемого пептида может быть также включен в C-концевую последовательность протеазы, а C-концевая часть расщепляемого пептида может быть включена в N-концевую часть полипептида. В этом случае расщепляемый пептид не может существовать независимо, и от C-конца протеазы и до N-конца полипептида должны быть сконструированы сайты рестрикции для протеазы.

Расщепляемый пептид может быть также включен лишь в часть либо протеазы, либо полипептида. В этом случае N-конец расщепляемого пептида будет включен в C-концевую часть протеазы, а N-часть полипептида будет либо непосредственно связана с расщепляемой последовательностью, либо между этим полипептидом и линкером может присутствовать один или несколько аминокислотных остатков.

Если между расщепляемой последовательностью и протеазой и/или между расщепляемой последовательностью и полипептидом присутствует один или несколько аминокислотных остатков, то число и природа этих остатков должны быть такими, чтобы эти остатки не препятствовали действию протеазы. Избыточное количество аминокислотных остатков на N-конце полипептида в основном нежелательно, поскольку эти остатки должны быть удалены для получения зрелой формы полипептида. Обычно предпочтительно, если, это возможно, и если не имеется каких-либо противопоказаний, сконструировать расщепляемый пептид таким образом, чтобы зрелая форма нужного белка образовывалась после расщепления гибридного белка. Однако вполне возможно получить белок, имеющий, например, Gly, Ser или Ala, присоединенные к N-концу, которые могут быть затем удалены, если это необходимо, с помощью соответствующей аминопептидазы.

В некоторых случаях может оказаться предпочтительным между N-концом полипептида и расщепляемой последовательностью кодировать пролин. Это позволит, например, с помощью аминопептидазы P (3.4.11.9) отщепить остатки, находящиеся перед пролином, но не после него. А затем пролиновый остаток может быть удален с помощью пролин-иминопептидазы с получением зрелого белка. Этот вариант осуществления настоящего изобретения является предпочтительным.

Последовательность (a) кодирует протеазу, способную расщеплять гибридный белок, кодируемый последовательностью настоящего изобретения. В соответствии с настоящим изобретением, такой протеазой является "ядерное включение a" (Nla) вируса желтой прижилковой мозаики клевера либо его мутант или вариант, обладающий такой же протеолитической специфичностью, что и указанная Nla-протеаза вируса желтой мозаики клевера.

Эта протеза, а именно "ядерное включение а" (Nla) вируса желтой прижилковой мозаики клевера (CYVV), кодируется нуклеотидами 10-1311 последовательности ID N 1 (см. ниже, список последовательностей), а первичная последовательность Nla представлена аминокислотами 4-437 последовательности ID N 2 (см. ниже, список последовательностей). Эти последовательности являются новыми, а поэтому так же, как и их мутанты и варианты, они входят в объем настоящего изобретения.

"Ядерное включение а" обладает протеолитической активностью, способствующей специфическому гидролизу пептидной связи между Gln-Ala, Gln-Gly или Gln-Ser в пептидном субстрате. Кроме того, было также обнаружено, что Nla может расщепляться Gln-Val. Таким образом, авторами настоящей заявки было обнаружено, что в противоположность другим протеазам семейства потивирусов, Nla CYVV (далее, если это не указывается особо, обозначение Nla будет означать Nla CYVV) может расщеплять последовательность AsnCys SerPheGlnX, где X представляет собой любой аминокислотный остаток, предпочтительно Gly, Ala, Val или Ser, а более предпочтительно Gly, Ala или Ser.

Следует также отметить, что пептиды, включающие в себя последовательность AsnCys SerPheGlnX могут быть расщеплены Nla-протеазой, особенно, если эта последовательность подвергается стерическому воздействию Nla-протеазы. Таким образом, настоящее изобретения также относится к системе, используемой для получения полипептида, где предшественник полипептида, содержащий последовательность AsnCys SerPheClnX, расщепляется Nla-протеазой. Эта система может также включать в себя любые другие стадии процессинга, осуществляемые, если это необходимо, перед, после или одновременно с расщеплением Nla-протеазой.

Хотя в основном предпочтительно использовать последовательность, кодирующую натуральную Nla (последовательность ID N 2), однако в настоящем изобретении с таким же успехом могут быть использованы мутанты или варианты Nla.

Как указывалось выше, эти мутанты или варианты должны иметь специфичность, аналогичную специфичности натуральной Nla. В соответствии с этим данный мутант или вариант должен иметь последовательность, в основном гомологичную последовательности аминокислот 4-437 в SEQ ID N2, за исключением разве что тех случаев, где, как очевидно каждому специалисту, возможно некоторые изменения, не затрагиваемые распознающую последовательность или не снижающие активность протеазы ниже допустимого уровня.

В целом, м