Продуцирование трегалозы в растениях

Продуцирование трегалозы в растениях

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в сельском хозяйстве и пищевой промышленности. При введении в растительную клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей трегалозофосфатсинтазу Е.соli, можно получить растение с повышенным содержанием трегалозы. Трегалоза может быть применена, например, в качестве добавки к пищевым продуктам или кормам, если ее извлечь из растения. За счет более высокого содержания в частях растений трегалозы достигается продолжительность хранения содержащей ее продукции, т.к. наличие трегалозы стабилизирует низкий уровень содержания влаги в продукте, т.е. обеспечивает его консервацию. 6 с. и 3 з.п. ф-лы, 11 ил.

Изобретение относится к модификации углеводного метаболизма растений с применением техники рекомбинантной ДНК, к самой рекомбинантной ДНК с целью ее использования для такой модификации, а также же растениям и частям растений, обладающим измененной генетической конституцией. Упомянутые растения могут быть использованы для экстрагирования из них определенных соединений углеводной природы или, альтернативно, они могут быть подвержены обработке для получения пищевых продуктов, кормов или их ингредиентов, которые будут характеризоваться улучшенными свойствами в связи с присутствием в процессе их приготовления упомянутых углеводных соединений.

Уровень техники Трегалоза представляет собой общее название, данное D-глюкозил-D-глюкозидам, которые включают дисахариды, построенные на основе двух молекул глюкозы, соединенных -, ,- и ,-связями. Трегалоза, и в особенности - трегалоза 1-(O-a-D-глюкопиранозил)-1'-O--D-глюкопираноза), представляет собой широко распространенный натуральный дисахарид.

Химический синтез трегалозы весьма сложен (требуется введение защищающих группировок) и неэффективен. В настоящее время в качестве естественного источника трегалозы используют грибы и дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые обладают способностью аккумулировать свыше 10% своего сухого веса в виде трегалозы. Однако получение трегалозы затруднено высокой активностью трегалозы, которая приводит к быстрому метаболизму трегалозы. Элбейн (Elbein A.D. Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem., 1974, 30, 227-256) приводит в своем обзоре данные по встречаемости и метаболизму в живых организмах дисахарида трегалозы, в частности ,-трегалозы. В растительном мире наличие трегалозы было показано у некоторых видов низших растений, а также у множества видов высших растений, принадлежащих к семенным растениям; Echinops persicus; Carex brunescens; Fagus silvaticus.

Однако эти результаты на были ни разу подтверждены другими авторами (Kendall et al., Phytochemictry, 1990, 29, N 8, 2525-2528). Так, например, в указанной выше публикации Кендалл с соавт., говоря о встречаемости трегалозы в семенных растениях, отмечает, что наличие ее было точно подтверждено только в случае семян тмина обыкновенного (Carum carvi). Сообщение о наличии трегалозы в подсолнечнике (Cegla et al., J. Am. Oil Chem. Soc., 1977, 54, 150 et seq.) было оспорено Кандлером с сотр. (Kandler et al., in: The Biochemictry of Plants, Vol. 3: Carbohydrates: Structure and Functions; Preiss. J. ed. , p. 228. Academic Press), согласуясь с данными Кендалла и сотр. (Kendall et al., 1990, выше). Сообщение о нахождении трегалозы в буке (Fagus silvaticus) и капусте также не было подтверждено другими авторами (Kendall et al., 1990, приведенная выше публикация, а также содержащиеся в ней ссылки).

Несмотря на очевидную редкую встречаемость трегалозы в высших растениях, имеются сообщения о наличии деградирующей активности в отношении трегалозы в значительном числе исследованных семейств растений. Стабильная высокая трегалазная активность была обнаружена в трех линиях пшеницы, сосне бангковой и Selaginella lepidophilla.

Стабильная низкая трегалазная активность была найдена в люцерне, черной мексиканской сахарной кукурузе и канадской сосне. Лабильная, умеренная активность была обнаружена в двух различных суспензиях канолы (canola), однако, по-видимому, она не имеет отношения к специфической трегалазной активности. Ячмень, костер, соя культурная и черная ель, как было показано, вовсе не содержит трегалазной активности (Kendall, 1990, выше).

Считается, что в организмах, способных к образованию трегалозы, биосинтез ее приводится через образование 6-фосфата, тогда как формой для ее хранения является свободный сахар. В этой связи есть основания полагать, что организмы, способные продуцировать и/или хранить трегалозу, содержат фосфатазу, способную к расщеплению трегалозо-6-фосфата (Elbein, 1974, выше). Однако относительно наличия специфических трегалозо-фосфат-фосфатаз в высших растениях известно также очень немного.

В заявке на Международный патент WO 93/17093 A1, опубликованной 2 сентября 1993 г., описывается образование трегалозы в дрожжах, трансгенных относительно дрожжевых генов, кодирующих трегалозо-фосфат-синтазу. Было высказано предположение, что трегалоза может также образовываться в высших растениях с использованием таких дрожжевых генов, однако упомянутая заявка не содержит настоящего раскрытия вопроса продукции трегалозы в растениях. При этом было отмечено, что WO93/17093 A1 была опубликована раньше даты подачи заявки, однако после наступления приоритетной даты заявки.

Настоящее изобретение относится к способу получения трегалозы в растении-хозяине, связанному с наличием в упомянутом растении-хозяине гена, экспрессируемого в растении, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине.

Другой вариант изобретения относится к продуцированию в высших растениях трегалозы в связи с наличием в упомянутом растении-хозяине экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности; а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую последовательность РНК, которая по крайней мере частично комлементарна последовательности РНК, кодирующей фермент сахарозо-фосфат-синтазу (СФС), встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине.

Еще один вариант изобретения относится к продуцированию трегалозы в растении-хозяине в связи с наличием в упомянутом растении-хозяине экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую последовательность РНК, которая по крайней мере частично комплементарна последовательности РНК, кодирующей фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилазу, встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине.

Еще один вариант изобретения включает продуцирование трегалозы в растении-хозяине в связи с наличием в упомянутом растении-хозяине экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующая последовательность РНК, которая по крайней мере частично комплементарна последовательности РНК, кодирующей фермент сахарозо-фосфат-синтазу, встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (ж) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (3) последовательность ДНК, кодирующую последовательность РНК, которая по крайней мере частично комплементарна к последовательности РНК, кодирующей фермент АДФ-глюкозо-пирофосфорилазу, встречающийся в естественных условиях в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (и) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине.

Изобретение относится также к экспрессируемым в растениях генам, которые используются в процессе получения трегалозы, равно, как и к различным сочетаниям экспрессируемых в растениях генов, а также к клонируемым плазмидам, к применяемым для трансформации векторам, микроорганизмам, индивидуальным растительным клеткам, несущим в соответствии с настоящим изобретением экспрессируемые в растениях гены.

Изобретение относится, кроме того, к рекомбинантной геномной ДНК из растений, которая содержит экспрессируемый в растении ген трегалозо-фосфат-синтазы, который не является для него естественным. Изобретение также включает в свои рамки рекомбинантную геномную ДНК из растений, которая содержит экспрессируемый в растении ген трегалозо-фосфат-синтазы, который не является для него естественным, а также экспрессируемый в растении ген, способный привести к ингибированию биосинтеза активной СФС, и/или экспрессируемый в растениях ген, способный привести к ингибированию биосинтеза активной АГФ-азы.

Изобретение относится, кроме того, к способу получения растения, подходящего для применения с целью продуцирования трегалозы, который включает следующие стадии: (1) введения в реципиентную растительную клетку экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (б) последовательность ДНК, кодирующую активность трегалозо-фосфат-синтазы, и факультативно (в) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, а также ген, экспрессируемый в растении, который включает в своей последовательности: (г) регион инициации транскрипции, функционирующий в упомянутом растении-хозяине; (д) последовательность ДНК, кодирующую селективный ген-маркер, функционирующий в упомянутом растении-хозяине, и факультативно (е) последовательность терминации транскрипции, функционирующую в упомянутом растении-хозяине, и (2) выращивания растения из трансформированной клетки в условиях, позволяющих проводить отбор в присутствии отобранного маркерного гена.

Изобретение относится также к растениям, которые в результате генетической модификации продуцируют трегалозу (имеют повышенный уровень ее).

Кроме того, изобретение охватывает растения, имеющие геномную рекомбинантную ДНК, которая содержит в соответствии с настоящим изобретением экспрессируемый в растениях ген.

Настоящее изобретение относится также к растениям, имеющим в геноме рекомбинантную ДНК, содержащую экспрессируемый в растениях ген, и которые продуцируют трегалозу.

Изобретение относится также к растениям, имеющим геномную рекомбинантную ДНК, содержащую экспрессируемый в растениях ген, и которые обладают повышенной засухоустойчивостью.

Кроме того, настоящее изобретение относится к тем частям растений, которые укладываются в рамки настоящего изобретения, таким, как клетки или протопласты, или их культуры, цветы, фрукты, листья, пыльца, корни (включая культуры, имеющие корни с корневыми волосками), семена, стебли, клубни (включая так называемые микроклубеньки) и другие.

Изобретение включает также в свои рамки способ консервирования растений или частей растений в присутствии трегалозы, который включает следующие стадии: (1) выращивания в соответствии с настоящим изобретением растения, которое продуцирует трегалозу; (2) сбора растений или частей растений, которые содержат трегалозу, и (3) воздушной сушки растений или частей растений или альтернативно (4) лиофильной сушки растений или частей растений.

Кроме того, изобретение относится к растениям или частям растений, которые могут быть сохранены с помощью метода, раскрытого в настоящем изобретении.

Кроме того, изобретение включает способ продуцирования трегалозы, который включает стадии: (1) выращивания растения, которое благодаря присутствию геномной рекомбинантной ДНК, способно к продуцированию трегалозы (повышенных уровней ее), (2) сбора упомянутых выше растений или частей растений, (3) выделения трегалозы из упомянутых выше растений или упомянутых частей растений.

Изобретение также относится к способу продуцирования трегалозы, который включает стадии: (1) выращивания культуры растительных клеток, которые благодаря присутствию в клетках геномной рекомбинантной ДНК способны к продуцированию трегалозы (повышенных уровней ее), (2) выделения трегалозы из упомянутой культуры растительных клеток.

Изобретение, кроме того, относится к выделенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей активность трегалозо-фосфат-синтазы. Предпочтение среди таких выделенных последовательностей нуклеиновых кислот отдается последовательности, выделенной из E.coli, а наиболее предпочтительной является последовательность, отраженная в SEQID NO:2. Другой предпочтительный вариант включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, отраженную в SEQID NO:3.

Описанные ниже фигуры иллюстрируют приведенное изобретение.

Фиг. 1. Схематическое изображение участков пути биосинтеза сахарозы и крахмала в накапливающих тканях растений. На фигуре показано, что углевод, полученный в листе в результате фотосинтеза, транспортируется затем в виде сахарозы через флоэмную ткань. При вхождении в сайт накапливания он расщепляется с помощью инвертазы, локализованной в ограничивающей мембране, с получением моносахаров - глюкозы и фруктозы. В результате прохождения различных стадий энзиматических реакций указанные моносахара превращаются в крахмал и/или сахарозу, как условно изображено на фигуре. При этом, по-видимому, метаболиты глюкозы - Г-6-Ф и УДФГ используются как субстраты для ТФС фермента, возникающего в результате введения в растение с помощью генно-инженерных методов экспрессируемого в растении гена otsA. На фигуре представлено, насколько повышается количество доступных в качестве субстратов Г-6-Ф и УДФГ при снижении уровня ферментов СФС и АГФ-азы. Их ингибирование выражено при гибридизации.

Фиг. 2. Полученная Кохара с сотр. (Kohara et al., 1987) схематическая карта EMBL 4 клона 77F11, содержащего otsBA оперон из E.coli. Вставка размером 18,8 kb закрашена. Указаны сайты рестрикции для рестрикционных эндонуклеаз EcoRV и Hind III, которые используются для клонирования гена otsA, равно как и расстояния до них в kb относительно левого сайта вставки. Отмечены также гены otsA и B, а стрелки указывают направление транскрипции (см. фиг. 8, расширенная карта).

Фиг. 3. Последовательность клонируемой кДНК для СФС из картофеля. Подчеркнуты: последовательности кДНК для СФС из кукурузы, использованные в качестве олигонуклеотидов в полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации.

Фиг. 4. Схематическое изображение бинарного вектора pMOG664.

Фиг. 5. Рестрикционная карта участков pTi B6, показывающая два фрагмента, клонированных в pMOG579.

Фиг. 6. Схематическое изображение рМОG579, используемого для конструирования в Agrobacterium, штамм MOG101, хелперной плазмиды без T-региона.

Фиг. 7. Схематическое изображение вектора экспрессии pMOG180.

Фиг. 8. Полученная Кохара с сотр. (Kohara et al., 1987) расширенная карта EMBL 4 клона 7F11, содержащего otsBA оперон из E.coli. Указано также местоположение открытой рамки для считывания (ОРС) ТФС (^*: Hind III сайты не присутствуют на карте Кохара, ниже).

Фиг. 9. Схематическое изображение бинарного вектора pMOG799.

Фиг. 10. Схематическое изображение бинарного вектора pMOG801.

Фиг. 11. Схематическое изображение бинарного вектора pMOG802.

Предпочтительный вариант настоящего изобретения включает растение картофеля, способное продуцировать в своих клубнях трегалозу в связи с наличием в упомянутом растении картофеля экспрессируемого в растении гена, который включает в своей последовательности: (а) регион инициации транскрипции, привнесенный от 35S РНК CaMV, фланкированный в верхнем направлении двойным энхансером, (б) последовательность ДНК, кодирующую трегалозо-фосфат-синтазу в гене otsA, локализованном на ots BA опероне E.coli, (в) последовательность терминации транскрипции, полученную на основе нопалинсинтазного (nos) гена из Agrobacterium. Клубни трансгенных растений, содержащих экспрессируемый в растениях ТФС-ген, продуцируют трегалозу, тогда как контрольные растения, не имеющие такого гена, ее не образуют. Очевидно, что трегалозо-фосфат, образуемый трансгенными клубнями, превращается затем в трегалозу. Очевидно также, что нет необходимости во введении извне трегалозо-фосфат-фосфатазной активности, поскольку она, по всей видимости, имеется в растениях картофеля.

На фиг. 1 также проиллюстрирован подход, примененный для улучшения доступности субстрата для ТФС. При этом два гена, оказывающие влияние на доступность глюкозо-6-ф (Г-6-Ф) и УДФГ, подвергли клонированию вместе с антисмысловым СФС геном и антисмысловой АФГ-азой под контролем 35S промотора CaMV с целью экспрессии в растении-хозяине. При введении его в растение-хозяин, содержащее в соответствии с настоящим изобретением экспрессируемый в растении ТФС ген, повышается доступность субстрата для ТФС, а отсюда также увеличивается уровень синтеза трегалозы. Для любого специалиста со средним уровнем знаний в данной области очевидно, что другие антисмысловые гены также могут находить применение для блокирования синтеза сахарозы или крахмала, с целью улучшения доступности субстрата.

Несмотря на то, что изобретение содержит подробное описание применительно к растениям картофеля, которые содержат экспрессируемый в растении ген трегалозо-фосфат-синтазы из E. coli под контролем 35S промотора CaMV, выполняющего функцию региона инициации транскрипции, каждому специалисту со средним уровнем знания в данной области ясно, что и другие семенные растения-хозяева так же подходят для целей продуцирования трегалозы. Среди семенных растений предпочтительными являются Angiospermae, а именно Dicotyledoneae, включающие в том числе в качестве репрезентативного семейства Solanaceae, а также Monocotyledoneae включающие в том числе Graminae в качестве репрезентативного семейства. К подходящим растениям-хозяевам относятся в контексте настоящего изобретения растения (а также части и клетки упомянутых растений) и их потомство, генетически модифицированные с применением техники рекомбинантной ДНК с целью индукции или повышения до нужного уровня продукции трегалозы в том или ином растении или органе растения; эти растения могут быть использованы либо непосредственно (в случае тех видов растений, которые продуцируют ее в съедобных частях), либо после очистки трегалозы из упомянутого растения-хозяина (которая может быть выделена как из съедобных, так и несъедобных растений-хозяев). Зерновые со съедобными частями включают в соответствии с настоящим изобретением те растения, которые имеют в качестве съедобных частей цветы, такие как подсолнечник (Brassica oleraceae), артишок (Cynara scolymus), фрукты, такие как яблоки (Malus, в т.ч. domestica), бананы (Musa, в т.ч. acuminata) ягоды (такие как смородина, Rikes, в т. ч. rubrum), вишни (такие как черешня, Prunus, в т.ч. avium), огурцы (Cucumis, в т.ч. sativus), виноград (Vitis, в т.ч. vinifera), лимоны (Citrus limon), дыня (Cucumis melo), орехи (такие как грецкий орех, Juglans, в т.ч. regia; арахис, Arachis hupogeae), апельсины (Citrus, в т.ч. maxima), персики (Prunus, в т.ч. persica), груши (Pyra, в т.ч. communis), перец (Solanum, в т. ч. capsicum), сливы (Prunus, в т.ч. domestica), земляника (Fragaria, в т. ч. moschata), томаты (Lycopersicon, в т.ч. esculentus), листья, такие как люцерна (Medicago sativa), капуста (такие как Brassica oleracea), цикорный салат (Cichoreum, в т.ч. endivia), лук-порей (Allium porrum), латук (Lactuca sativa), шпинат (Spinacia oleraceae), табак (Nicotiana tabacum), корни, такие как маранта (Maranta arundinacea), свекла (Beta vulgaris), морковь (Daucus carota), маниок (Manihot esculenta), репа (Brassica rapa), редис (Raphanus sativus), ямс (Dioscorea esculenta), батат (Ipomoea batatas) и семена, такие как бобы (Phaseolus vulgaris), горох (Pisum sativum), соя культурная (Glycin max), пшеница (Triticum aestivum), ячмень (Hordeum vulgare), кукуруза (Zea mays), рис (Oryza sativa), клубни, такие как кольраби (Brassica oleraceae), картофель (Solanum tuberosum) и др. Съедобные части растений могут быть сохранены высушиванием в присутствии повышенных количеств трегалозы, образованной в них в связи с наличием экспрессируемого в растении гена трегалозо-фосфат-синтазы.

Это может быть использовано для продуцирования повышенных уровней трегалозы посредством подведения ДНК, кодирующей активность ТФС, под контроль промотора, специфичного для органа или ткани растения; при этом выбор метода такого введения может быть легко сделан любым специалистом, обладающим средним уровнем знаний в данной области.

При этом может быть использован любой ген трегалозо-фосфат-синтазы, функционирующий под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии ДНК, специфической или конститутивной, в растительных клетках, главное, что должно приниматься во внимание, это способность продуцировать активный фермент трегалозо-фосфат-синтазу. Нуклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты представлена на SEQID NO : 2, при этом любая открытая рамка считывания в соответствии с настоящим изобретением может быть изменена, что не сопровождается обязательными изменениями в аминокислотной последовательности кодируемого белка. Этот факт объясняется вырожденностью генетического кода. Так, открытая рамка считывания, кодирующая активность трегалозо-фосфат-синтазы, может быть адаптирована к выбору используемого в растении-хозяине кодона.

Для идентификации активности трегалозо-фосфат-синтаз в других организмах и далее для выделения этих ферментов может быть также использована нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена на SEQID NO: 2, при этом для упомянутого выделения используется техника гибридизации ДНК из таких источников с ДНК- или РНК фрагментом, выделенным из гена Е.соli. Предпочтительно провести скрининг таких последовательностей ДНК в ходе гибридизации при строгом соблюдении определенных условий (таких, как температура и ионная сила гибридизационной смеси). Природа гибридизации (т.е. состав смеси: ДНК: ДНК, или ДНК: РНК, или РНК: РНК), а также длина наименьшего вводимого в гибридизационную смесь фрагмента определяют, есть ли необходимость в поддержании в ходе нее строгого режима. При этом каждый специалист со средним уровнем знаний в данной области может без труда установить необходимый для каждого конкретного случая режим гибридизации.

В качестве источника для выделения активной трегалозо-фосфат-синтазы могут использоваться микроорганизмы (бактерии, дрожжи, грибы), растения, животные и др. Выделенные из других источников последовательности ДНК, которые кодируют трегалозо-фосфат-синтазную активность, могут быть использованы аналогичным образом с применением метода продуцирования трегалозы в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение также включает в свои рамки те последовательности нуклеиновых кислот, которые были получены в результате модификации последовательности нуклеиновой кислоты, отображенной на SEQIDNO: 2 за счет мутации одного или более кодонов, что приводит к изменению аминокислотной последовательности в кодируемом белке, если только такая мутация, затрагивающая аминокислотную последовательность, не устраняет полностью активность трегалозо-фосфат-синтазы.

В принципе по методу настоящего изобретения может быть использовано любое растение-хозяин в сочетании с любым экспрессируемом в растении геном трегалозо-фосфат-синтазы. При доступности в других источниках трегалозных генов эти источники также могут использоваться для получения описываемой комбинации их с экспрессируемым в растении трегалозо-фосфат-синтазным геном.

Приведенные в примерах настоящего изобретения результаты ингибирования эндогенного гена сахарозо-фосфат-синтазы и гена АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы показывают, что ингибирование эндогенных генов с целью повышения доступности субстрата может быть проведено с использованием большого числа способов, выбор которых не представляется существенным для настоящего изобретения. Предпочтительным способом для достижения ингибирования гена является так называемый "антисмысловой подход". В этом случае на основе последовательности ДНК получают РНК, которая хотя бы частично комплементарна той РНК, которая кодирует ту энзиматическую активность, которую предстоит блокировать (т.е., в наших примерах, АГФ-азу или СФС). При этом предпочтительно использовать гомологичные антисмысловые гены, поскольку они более эффективны, чем гетерологичные гены. Выделение антисмыслового СФС гена из картофеля с использованием последовательности СФС-гена из кукурузы в качестве пробы дает представление о применимости этой стратегии. При этом не следует полагать, что для практического применения способа настоящего изобретения необходимы гомологичные антисмысловые фрагменты. Альтернативным способом блокирования синтеза нежелательных энзиматических активностей является введение в геном растения-хозяина дополнительно копии гена, уже имеющегося в растении-хозяине. Нередко отмечалось, что такая дополнительная копия гена заглушает эндогенный ген: это явление известно в литературе как со-супрессивный эффект, или как ко-супрессия.

В принципе, и двудольные, и однодольные растения, поддающиеся трансформации, могут быть модифицированы за счет введения в соответствии с настоящим изобретением в реципиентную клетку экспрессируемого в растении гена и выращивания нового растения, которое несет в себе и экспрессирует данный ген. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными являются те растения, которые способны осуществлять превращение трегалозо-фосфата в трегалозу и которые либо вовсе не содержат, либо содержат на очень низком уровне деградирующую активность в отношении трегалозы. Тем не менее, растения, которые не обладают способностью превращать трегалозо-фосфат в трегалозу, также входят в рамки настоящего изобретения. Эти растения могут быть далее модифицированы за счет введения дополнительных генов, которые кодируют фосфатазы и которые, в свою очередь, осуществляют превращение трегалозо-фосфата в трегалозу. В принципе, настоящее изобретение относится также к растениям, содержащим трегалазы, поскольку такие растения могут представлять удобную возможность для продуцирования трегалозы посредством ингибирования активности таких ферментов, например, за счет ингибирования экспрессии генов, кодирующих трегалазы, с использованием "антисмыслового подхода".

Способ введения в реципиентную растительную клетку экспрессируемого в растении гена трегалозо-фосфат-синтазы не важен для настоящего изобретения, существенно только, чтобы при этом произошло стабильное включение гена в геном упомянутого растения. Кроме использования штаммов рода Agrobacterium применима также другая техника для целей введения ДНК в растительные клетки, в частности трансформация протопластов с помощью кальций/полиэтиленгликолевого метода, электропорация и микроинъекция, а также бомбардировка частицами (покрытыми оболочкой) (Potrykus, Bio/Technol., 1990, 8, 535-542).

В дополнение к методам так называемой непосредственной трансформации ДНК широко применяются системы трансформации на основе векторов, таких, например, как вирусные векторы [в частности, вектор из вируса табачной мозаики (BTM, CaMV)] и бактериальные векторы (в частности, из бактерий рода Agrobacterium) (Potrykus, Bio/Technol., 1990, 8, 535-542). После проведения селекции и/или скрининга на основе тех клеток или частей растений, которые были трансформированы, может быть регенерировано целое растение, с использованием для этого известных в технике методов (Horsch et al., Science, 1985, 225, 1229-11231).

Было показано, что однодольные растения могут быть трансформированы, и при этом из трансформированных клеток можно получить фертильные трансгенные растения. Развитие систем культур репродуцирующихся тканей для таких растений в совокупности с имеющимися мощными методами введения генетического материала в растительные клетки позволили упростить процесс трансформации. В настоящее время среди методов трансформации однодольных растений предпочтение отдается бомбардировке микрочастицами эксплантата или суспензии клеток, а также непосредственному введению ДНК или электропорации (Shimamoto, et al., Neture, 1989, 338, 274 - 276). Так, трансгенные растения кукурузы были получены при введении bar-гена Streptomyces hydroscopicus, который кодирует фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (фермент, инактивирующий гербицид фосфинотрицин) в эмбриогенные клетки культуральной суспензии клеток кукурузы в случае бомбардировки их микрочастицами (Gordon-Kamm, Plant Cell, 1990, 2, 603 - 618). В литературе уже имеются сообщения о введении генетического материала в алейроновые протопласты других однодольных растений, таких как пшеница и ячмень (Lee, Plant Mol. Biol., 1989, 13, 21 - 30). Растения пшеницы были регенерированы из эмбриогенной культуральной суспензии за счет отбора только постаревших тканей компактного и узелкового каллюса с целью получения эмбриогенных суспензионных культур (Vasil, Bio/Technol., 1990, 8, 429 - 434). При сочетании их с соответствующими системами трансформации для этих культур возможно применение настоящего изобретения к однодольным растениям. Кроме того, эти методы применимы также для целей трансформации и регенерации двудольных.

Однодольные растения, включающие коммерчески важные культуры, такие как зерновые, пригодны для использования с целью введения в них ДНК с помощью штаммов Agrobacterium (Европейский патент 159 418 B1; Gould J., Michael D., Hasegama O., Ulian EC, Peterson G., Smith RH, Plant Physiol., 1991, 95, 426 - 434).

Относительно выбора растения-хозяина следует отметить предпочтительность тех видов растений, которые содержат невысокую деградирующую активность в отношении трегалозы, либо вовсе не содержат ее. Однако растения, проявляющие трегалазную активность, не исключаются из числа тех растений-хозяев, которые пригодны для продуцирования трегалозы, но в этом случае, если указанная активность мешает накоплению трегалозы, необходимо добиться ингибирования трегалазы. Такое ингибирование может быть получено с применением известного в технике "антисмыслового подхода", который проиллюстрирован в настоящем описании с различными целями.

Следует отметить, что изобретение не ограничивается использованием только 35S промотора ВТМ в качестве региона инициации транскрипции. Могут также применяться подходящие для целей контроля экспрессируемых в растении генов последовательности ДНК, которые включают, в том числе, гены-маркеры, такие как регионы инициации транскрипции, энхансеры, нетранскрибируемые лидеры и др., которые могут быть получены из любого экспрессируемого в растении гена, таких как, например, эндогенные гены растений, гены, экспрессируемые в растительных клетках в естественных условиях, в частности те, которые локализованы на T-ДНК Agrobacterium дикого типа, гены вирусов растений, а также эукариотические гены, которые включают регион инициации транскрипции, совпадающий с консенсусной последовательностью инициации транскрипции в эукариотических клетках. Изобретение относится также к гибридным промоторам, сочетающим в себе функциональные участки различных промоторов или их синтезированные эквиваленты. Кроме конститутивных промоторов с целью контроля экспрессии экспрессируемых в растении генов в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться индуцибельные промоторы либо промоторы, регулируемые каким-либо иным, т.е. зависимым от времени или специфичным для данных клеток, образом для поддержания соответствующего характера экспрессии, существенным является лишь способность их экспрессироваться в тех частях растений, которые содержат субстрат для ТФС.

Для целей селекции или скрининга трансформированных клеток предпочтительно включать в систему для трансформации ген-маркер, связанный в соответствии с настоящим изобретением с экспрессируемым в растении геном, который переносится в растительную клетку. Выбор подходящего гена-маркера для проведения трансформации растительной клетки представляется делом техники, которое по силам любому специалисту со средним уровнем знаний в данной области; так, например, в качестве примеров таких традиционно используемых в экспериментах по трансформации генов-маркеров можно привести гены неомицинфосфотрансферазы, которые придают клеткам устойчивость к канамицину (EP-B 131 623), ген глютатион-S-трансферазы из печени крыс, который сообщает устойчивость к гербицидам, полученным на основе глютатиона (EP-A 256 223), ген глютаминсинтетазы, который, определяя суперэкспрессию этого фермента, придает устойчивость к ингибиторам глютаминсинтетазы, таким, как фосфинотрицин (WO 87/05327), ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, который придает устойчивость к селективному агенту фосфинотритрицину (EP-A 275 957), ген, кодирующий 5-энолшикимат-3-фосфат-синтазу (EPSPS), придающий толерантность к N-фосфонометилглицину, bar-ген, придающий устойчивость к Bialaphos (WO 91/02071) и др. При этом выбор того или иного гена не существенен, если достигается его функционирование (причем селективное) в сочетании с выбранными растительными клетками.

Ген-маркер и интересующий ген не должен быть обязательно связаны, поскольку показано, что при трансформации растений совместная трансформация несвязанных генов также может проходить успешно (патент США 4 399 216).

Предпочтительным материалом для трансформации, особенно в случае двудольных культур, являются листовые пластинки, которые могут быть легко трансформированы, а, кроме того, характеризуются высокой регенерирующей способностью (Horsch et al., Science, 1985, 227, 1229 - 1231).

В том случае, когда продуцирование трегалозы достигается с применением экспрессируемого в растении трегалозо-фосфат-синтазного гена как единственного гена модификации углеводов, настоящее изобретение иллюстрируется примерами, включающими другие экспрессируемые в растении антисмысловые гены, способные воздействовать в плане повышения доступности субстрата для трегалозо-фосфат-синтазы. В качестве специфических примеров таких генов могут быть названы экспрессируемые в растении антисмысловые гены для СФС из кукурузы и картофеля, а также для АГФ-азы из картофеля. Даун-регуляция ферментов модификации углеводов с использованием антисмыслового подхода не ограничивается приведенными специфическими примерами. Так, например, экспрессируемые в растении антисмысловые гены, частично комплементарные к нужному гену, могут использоваться для ингибирования экспрессии гена-мишени, при этом экспрессируемый в растении антисмысловый ген продуцирует транскрипт, который является в достаточной степени комплементарным к транскрипту гена-мишени и достаточно длинным для целей ингибирования экспрессии упомянутого гена-мишени.

Для настоящего изобретения не существенно, каким образом наличие двух или более генов в одном растении оказывает рассматриваемое воздействие. Это воздействие