Способы использования фибринового герметика, способ получения состава, составы, наборы

Способы использования фибринового герметика, способ получения состава, составы, наборы

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к получению и использованию фибриновых герметиков. Применяют фибриновый герметик, а именно состав, свободный от фермента в виде тромбина, который содержит мономер фибрина или состав, содержащий не образующий поперечные связи фибрин. При использовании осуществляют контактирование нужного участка с составом, свободным от фермента в виде тромбина, при этом осуществляют превращение этого мономера в полимер фибрина, образуя тем самым фибриновый герметик. Водный состав, свободный от фермента в виде тромбина и содержащий не образующий поперечные связи мономер фибрина, используют в концентрации от 10 до 200 мг/мл. Данный фибриновый герметик обеспечивает использование его без риска вирусного заражения пациента или других вредных воздействий. 10 с. и 60 з.п.ф-лы, 2 табл., 1 ил.

Изобретение относится к фибриновым герметикам, более определенно, к использованию фибринового герметика, отличающегося тем, что состав, включающий фибриновый мономер или состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин, используется в качестве компонента фибринового герметика.

Одним из механизмов гемостаза у млекопитающего, т.е. предупреждения потери крови, является образование кровяного сгустка. Образование сгустка у человека, т. е. свертывание крови, достигается целым комплексом реакций, в результате которых осуществляется превращение фибриногена - мономера - посредством тромбина, ионов кальция и активированного фактора XIII с целью образования крайне полифункционального полимера фибрина II, являющегося фибриновым сгустков.

Образование полимера фибрина II, образующего поперечные связи, осуществляется с помощью фибриногена, превращенного тромбином в мономер фибрина I, фибриноген самопроизвольно полимеризуется для образования полимера фибрина I, иногда выступающего в роли растворимого фибрина I, т.к. путем обработки соответствующими химическими средствами полимер фибрина I может быть вновь превращен в мономер фибрина I.

Полимер фибрина I затем превращается тромбином в полимер фибрина II, который иногда принимается за растворимый фибрин II, т.к. путем обработки соответствующими химическими средствами полимер фибрина II может быть превращен в мономер фибрина II. Под влиянием фактора XIIIa, известного как активированный фактор XIII, полимер фибрина II затем связывается поперечными связями с целью образования поперечно связанного фибрина II, представляющего фибриновый сгусток.

Фактор XIII активируется тромбином в присутствии ионов кальция. Связанный поперечными связями фибрин II иногда представлен как нерастворимый фибрин II, т.к. он не может быть превращен в мономер фибрина II.

Следует отметить, что тромбин образуется из протромбина. Протромбин превращается в тромбин с помощью фактора Xa в присутствии кальция и других вспомогательных веществ.

Фибриноген представляет около 2-4 г/л протеина плазмы крови. Фибриноген является мономером, состоящим из трех пар полипептидных цепей связанного дисульфида, обозначенных (Aa)₂, (B)₂, ₂. "A" и "B" представляют два небольших пептида с конечным амином, известных как фибринопептид A и фибринопептид B, соответственно.

Отделение фибринопептидов A от фибриногена в процессе превращения фибриногена с помощью тромбина имеет место в смеси фибрина I, и последующее отделение фибринопептидов B имеет место в смеси фибрина II. Такое отделение фибринопептидов A и B уменьшает молекулярный вес фибриногена на очень малое количество, около 6,000 из 340,000 дальтонов, но зато открывает участки полимеризации.

Для обзора механизмов свертывания крови и структуры фибриногена см. C.M. Jackson, Ann. Rev. Biochem., 49:765-811 (1980) и B. Furie и B.C. Furie, Cell, 53: 505-518 (1988).

Фибриновый герметик представляет собой биологический адгезив, чье действие имитирует конечные стадии свертывания, в результате чего образуется фибриновый сгусток. Традиционные фибриновые герметики состоят из концентрированного человеческого фибриногена, бычьего апротинина и фактора XIII в качестве первого компонента и бычьего тромбина и хлорида кальция в качестве второго компонента.

Применение обычно осуществляется двухсекционным шприцем, который позволяет применять одновременно оба компонента на участке, где желательно образование фибринового сгустка. Апротинин является фибринолитическим ингибитором, добавляемым для обеспечения стабильности фибриновых герметиков.

Фибриногенный компонент фибринового герметика приготавливается из консервированной человеческой плазмы. Фибриноген может быть законсервирован из человеческой плазмы путем осаждения в условиях низких температур и осаждения с применением различных реагентов, например полиэтиленгликоля, эфира, этанола, сульфата аммония или глицина.

Для полного обзора фибриновых герметиков см. M.Brennan, Blood Reviews, 5: 240-244. (1991); J.W.Gibble и P.M.Ness, Transfusion, 30: 741-747 (1990); H. Matras, J.Oral Maxillofac Surg., 43:605-611 (1985) и R.Lerner и N.Binur, J. of Surg. Research, 48:165-181 (1990).

В настоящее время наблюдается интерес к приготовлению фибриновых герметиков, которые используют собственный фибрин. Собственный фибриновый герметик - это фибриновый герметик, отличающийся тем, что фибриногенный компонент фибринового герметика извлекается из собственной крови пациента.

Желательно использовать собственный фибриновый герметик, т.к. он устраняет риск заражения инфекциями, передаваемыми через кровь, например гепатит B, гепатит ни A, ни B и синдром приобретенного иммунодифицита (СПИД), которые могут иначе присутствовать в фибриногенном компоненте, полученном из консервированной человеческой плазмы.

См. : L.E.Silberstein и др., Transfusion, 28:319-321 (1988); K.Laitakari и J.Luotonen, Laryngoscope, 99:974-976 (1989) и A.Dresdale и др., The Annals of Thoracic Surgery, 40:385-387 (1985).

Инфекция может быть передана фибриновым герметиком не только с помощью фибриногена, но также посредством бычьего апротинина и компонентом бычьего тромбина. Известно, что бычий тромбин является носителем инфекционного фактора бычьего губчатого энцефалита (B E) и других вирусов, присущих млекопитающим. Более того, бычий тромбин является сильно действующим антигеном, который может вызвать реакции иммунного характера у человека.

Следовательно, применение бычьего тромбина может оказать вредное действие на получателя. См.: D.M.Taylor, J. of Hospital Infection, 18 (Supplement A): 141-146 (1991), S.B.Prusiner и др., Cornell Vet, 81 N 2:85-96 (1991) и D.Matthews, J. Roy, Soc. Health, 3-5 (February 1991).

Исходя из этого, возникает необходимость в фибриновом герметике, который может быть использован без риска вирусного заражения пациента или других вредных воздействий.

Предмет изобретения относится к способу применения фибринового герметика, который включает: (а) контактирование нужного участка составом, включающим фибриновый мономер; и (б) превращение указанного фибринового мономера в фибриновый полимер одновременно с этапом контактирования, тем самым образуя фибриновый сгусток.

Предмет изобретения относится также к способам приготовления такого состава и составов и наборов, включающих такой мономер фибрина.

Другим аспектом предмета изобретения является способ применения фибринового герметика, который включает: (а) контактирование нужного участка составом, включающим фибрин, не образующий поперечных связей; и (б) превращение этого не образующего поперечных связей фибрина в фибрин, образующий поперечные связи одновременно, с этапом контактирования, в результате чего образуется фибриновый сгусток.

Предмет изобретения также предлагает способы приготовления такого состава и составов и наборов, включающих не образующий поперечных связей в фибрин.

Согласно предмету изобретения используются следующие определения: Фибрин. Фибрин обозначает любую форму фибрина. Неограниченные примеры фибрина включают фибрин I, фибрин II и ВВ фибрин.

Фибрин может быть в мономерной или полимерной форме, где полимерная форма или образует поперечные связи или нет.

Мономер фибрина. Мономер фибрина включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин находится в мономерной форме или олигомерной форме, которая может быть растворена в составе, включающем мономер фибрина, и где мономер фибрина может быть превращен в полимер фибрина.

Полимер фибрина. Полимер фибрина включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин находится в полимерной форме, образующей поперечные связи или нет.

Фибрин, не образующий поперечный связей. Фибрин, необразующий поперечных связей, включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин не образует поперечных связей, но может быть превращен в фибрин, образующий поперечные связи.

Не образующий поперечных связей фибрин может быть мономером фибрина или же не образующим поперечные связи полимером фибрина.

Фибрин, образующий поперечные связи. Фибрин, образующий поперечные связи, включает любую форму фибрина, например фибрин I, фибрин II или ВВ фибрин, где фибрин является полимером фибрина, образующего поперечные связи.

Состав, включающий мономер фибрина Согласно предмету изобретения, фибриновый состав, включающий мономер фибрина, это состав, который содержит любую форму мономера фибрина, который может быть превращен в полимер фибрина.

Неограниченные примеры мономера фибрина включают мономер фибрина I, мономер фибрина II или мономер ВВ фибрина, при этом предпочтение отдается мономеру фибрина I. Конечно, могут присутствовать смеси мономера фибрина.

Целью настоящего изобретения является полимер фибрина, который включает любой полимер, полученный в результате полимеризации мономера фибрина. Так, например, превращение мономера фибрина I в полимер фибрина может получиться в полимере фибрина I, образующего поперечные связи или не образующего, и/или в полимере фибрина II, образующего поперечные связи или не образующего, и/или в полимере фибрина II, образующего поперечные связи или не образующего, в зависимости от того, как проходит этап превращения.

Предпочтение отдается мономеру фибрина I, так как, в противоположность фибриногену, он может быть легко превращен в полимер фибрина без применения тромбина или фактора XIII. Действительно, мономер фибрина I может самопроизвольно образовать полимер фибрина I, который может действовать как фибриновый сгусток, несмотря на то, образует ли полимер фибрина I поперечные связи или нет, или же будет ли он превращен в полимер фибрина II.

Следовательно, так как образование полимера фибрина I из мономера фибрина I происходит самопроизвольно, полимер фибрина I может быть образован без тромбина и фактора XIII, тем самым избегая проблем, связанных с тромбином крупного рогатого скота. (Следует отметить, что если мономер фибрина I используется таким образом, что и мономер фибрина I контактирует с кровью пациента, например, в ране, тромбин пациента и фактор XIII могут превратить полимер фибрина I в полимер фибрина II, образующий поперечные связи).

Состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин, это состав, который содержит любую форму фибрина, не образующего поперечных связей. Неограниченными примерами не образующего поперечных связей фибрина являются не образующий поперечных связей фибрин I, не образующий поперечных связей фибрин II и ВВ фибрин, причем предпочтение отдается не образующему поперечных связей фибрину I.

Конечно, могут присутствовать смеси не образующего поперечных связей фибрина. К тому же, в целях настоящего изобретения, "образующий поперечные связи" фибрин включает любую форму фибрина, полученную в результате превращения не образующего поперечных связей фибрина I в фибрин, образующий поперечные связи.

Следовательно, образующий поперечные связи фибрин, например, полученный в результате превращения не образующего поперечных связей фибрина I в фибрин, образующий поперечные связи, может быть образующим поперечные связи фибрином I и/или образующим поперечные связи фибрином II, в зависимости от того, как проходит этап превращения.

Предпочтение отдается не образующему поперечных связей фибрину I, так как он может легко превращен в образующий поперечные связи фибрин по сравнению с фибриногеном. В действительности, считается, что фибрин I может образовать образующий поперечные связи фибрин I, который может действовать как фибриновый герметик.

Следовательно, образование образующего поперечные связи фибрина I из не образующего поперечных связей фибрина I может проходить без тромбина, чем устраняются проблемы, связанные с бычьим тромбином, хотя активированный фактор XIII может быть необходимым. (Следует отметить, что если не образующий поперечных связей фибрин I применяется таким образом, что не образующий поперечных связей фибрин I контактирует с кровью пациента, например, в ране, тромбин человека и фактор XIII могут превратить фибрин I в образующий поперечные связи фибрин II).

Также не образующих поперечных связей фибрин может быть полимером, олигомером или мономером, хотя предпочтение отдается олигомеру или мономеру, т. е. мономеру фибрина. Это связано с тем, что не образующий поперечных связей фибрин в полимерной форме является обычно гелем, и, следовательно, очень трудно привести его в контакт с нужным местом и обеспечить тесный контакт с клетками нужного участка.

Напротив, полученный не образующий поперечных связей фибрин в олигомерной или мономерной форме является растворимым и, следовательно, может быть легко доставлен к нужному участку и иметь тесный контакт с клетками. Разумеется, состав может содержать смесь таких форм не образующего поперечных связей фибрина.

Источником состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, может быть любой известный источник или тот, который может быть получен, пока мономер фибрина может превращаться в полимер фибрина или же не образующий поперечных связей фибрин может превращаться в фибрин, образующий поперечные связи.

Неограниченными источниками составов, включающих мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, являются: кровь, желательно кровь млекопитающего, еще лучше кровь человека, клеточные структуры, выделяющие фибриноген и рекомбинирующий фибриноген, при этом предпочтение отдается крови. Кровь может быть представлена любой формой, включая всю кровь или приготовленные фибриногенные композиции. Кровь может быть использована для приготовления собственного фибринового герметика.

Замечено, что состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин I, или мономер фибрина I, или полимер фибрина I, приготовленные из всей крови, как описано ниже, может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин II без добавления тромбина, фактора XIII и других необходимых компонентов для свертывания крови.

Считается, что это факт связан с тем, что состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин I, полученный из всей крови, сохраняет достаточные количества протромбина, фактора XIII и такие другие необходимые вещества из плазмы, что не образующий поперечных связей фибрин I может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин II без добавления экзогенного тромбина и фактора XIII.

Эндогенный протромбин и фактор XIII могут быть использованы в фибриновом герметике, согласно предмету изобретения, как компоненты состава, включающего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин.

Однако следует отметить, что не сохраняются достаточные количества этого эндогенного тромбина и фактора XIII, необходимые для превращения фибриногена в образующий поперечные связи фибрин II, при скорости реакции, пригодной для фибринового герметика. Считается, что для превращения фибриногена в образующий поперечные связи фибрин II необходимо больше тромбина, чем для превращения не образующего поперечных связей фибрина I в образующий поперечные связи фибрин II при эквивалентной скорости реакции.

Каждый из этих трех источников содержит фибриноген, который может быть превращен в мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин.

Кроме этого этапа превращения, полученный состав, который содержит мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, должен быть в концентрированной форме. Желательно, чтобы концентрация мономера фибрина была не меньше, чем примерно 10 мг/мл, предпочтительно - от примерно 20 мг/мл до 200 мг/мл, более предпочтительно - от 20 мг/мл до 100 мг/мл и наиболее предпочтительно - от 25 мг/мл до 50 мг/мл.

Кроме того, предпочитается, чтобы мономер фибрина или не образующих поперечных связей фибрин были нединамичными. В настоящем изобретении нединамичный состав, включающий не образующий поперечных связей фибрин, обозначает то, что не образующий поперечных связей фибрин в таком составе не образует поперечных связей в течение по крайней мере 1,5 минут, желательно - в течение примерно 3 минут и более желательно - в течение по крайней мере примерно 30 минут после получения такого состава. Нединамичный состав, содержащий мономер фибрина, обозначает то, что мономер фибрина в таком составе не полимеризуется в течение по крайней мере примерно 1,5 минут, предпочтительно - около 3 минут, более предпочтительно - около 30 минут и наиболее предпочтительно - в течение по крайней мере около 2 часов после получения состава.

Фактически, следует отметить, что состав, содержащий мономер фибрина, может быть нединамичным в течение по крайней мере нескольких дней, т.е. около 72 часов после его приготовления.

Состав, включающий мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, может быть получен из крови. Способ может привести к полимеру фибрина, связанного водородом, который представляет собой форму не образующего поперечных связей фибрина. Затем такой полимер может быть использован в качестве компонента фибринового герметика или же быть превращенным в мономер фибрина посредством способа, называемого повышением растворимости; эти способы будут описаны ниже.

Также желательно, чтобы состав, содержащий мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, приготавливался в стерильных условиях.

Составы, содержащие мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин, могут быть получены из всей крови путем взятия ее у донора и желательно в присутствии антикоагулянта. Может быть использован любой антикоагулянт. Неограниченными примерами антикоагулянтов являются гепарин, гирудин, цитрат или любой другой агент, который может прямо или косвенно предотвратить образование тромбина, при этом предпочтение отдается цитрату.

Плазма, содержащая фибриноген, затем отделяется от всей крови. Может быть использована любая технология отделения, например осаждение, центрифугирование или фильтрация. Центрифугирование может осуществляться при скорости 3,000 г в течение 10 минут.

Однако, если нужно получить плазму, богатую пластинами, центрифугирование может проводиться при более низких скоростях, например 500 г в течение примерно 20 минут. Образовавшаяся на поверхности жидкость, содержащая плазму, может быть удалена по стандартной технологии.

Фильтрация может проводиться с помощью пропускания всей крови через подходящий фильтр, который отделяет кровяные клетки от плазмы. Желательно, чтобы фильтр представлял собой микропористую мембрану, обеспечивающую хорошую проницаемость для протеина.

Полученная плазма затем перерабатывается, чтобы преобразовать фибриноген в мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин. Это преобразование может быть проведено по любой из известных технологий или предназначенных для дальнейшего развития.

Предпочитаемым способом производства мономера фибрина является способ с помощью фермента в виде тромбина, включающего тромбин. Фермент в виде тромбина - это любой фермент, который может служить катализатором образования фибрина из фибриногена. Известным источником ферментов в виде тромбина являются змеиные яды. Желательно, чтобы фермент в виде тромбина был очищен от змеиного яда.

В зависимости от выбора фермента в виде тромбина, такой фермент может выделять фибринопептид A, который образует фибрин I, фибринопептид B, который образует ВВ фибрин, или же и фибринопептид A и B, которые образуют фибрин II. Следует отметить, что те ферменты в виде тромбина, которые выделяют фибринопептид A и B, делают это на различных скоростях.

Так, полученный состав может быть, например, смесью фибрина II и фибрина I или смесью фибрина II и ВВ фибрина.

В таблице 1 представлен неограниченный список источников змеиных ядов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, название фермента в виде тромбина и какой(-ие) фибринопептид(ы) выделяется (-ются) при обработке этим ферментом.

Для обзора ферментов в виде тромбина из змеиных ядов см.: H.Piekle и K. Stocker, Thrombosis and Haemostasis, 65(4): 444-450 (1991).

Предпочитаемыми ферментами в виде тромбина являются Батроксобин, особенно из: B. Moojeni, B.Maranhao и B.atrox и Анкрод, особенно из A.rhodostoma.

Мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин могут быть получены контактированием плазмы с ферментом в виде тромбина, позволяя тем самым фибриногену в плазме превращаться в мономер фибрина. Однако полученный мономер фибрина спонтанно полимеризуется для образования связанного водородом полимера в форме геля. Представляющий собой раствор полимер отделяется от остающейся сыворотки. Гель является формой состава, содержащего не образующий поперечных связей фибрин.

Этот гель не образующего поперечных связей фибрина может быть собран, например, с помощью центрифугирования (3,000 г за 10 минут), прямым отделением вручную не образующего поперечных связей фибрина от сыворотки, фильтрацией, прямой или под давлением, после чего удаляется отделенная сыворотка. (Может быть использован фильтр с размерами отверстий от 1 до 100 микрон, например, керамический полипропиленовый микрофильтр с размером отверстий 20 микрон фирмы Porex, Inc., тефлоновый микрофильтр с размером отверстий 20-70 микрон фирмы Fluorotechniques, Inc. или же микрофильтр из нейлона 66 с размером отверстий 22-46 микрон фирмы Costar, Inc.).

Такая процедура отделяет не образующий поперечных связей фибрин, представляющий собой раствор, от сыворотки и тем самым концентрирует гель не образующего поперечных связей фибрина по отношению к плазме.

Следует отметить, что гель не образующего поперечных связей фибрина сохраняет по крайней мере некоторое количество протромбина, фактора XIII и других необходимых веществ из плазмы, так что не образующий поперечных связей фибрин I может быть превращен в образующий поперечные связи фибрин II без добавления экзогенного тромбина или фактора XIII. Этот эндогенный протромбин и фактор XIII могут быть использованы в фибриновом герметике, согласно предмету настоящего изобретения, в качестве компонентов состава, содержащего мономер фибрина или не образующий поперечных связей фибрин.

Сила центрифугирования и величина давления при фильтрации в ходе отделения будут определять количество сыворотки, удаленной из геля не образующего поперечных связей фибрина, при этом чем больше будут сила и давление, тем выше будет концентрация геля, не образующего поперечных связей фибрина.

Однако желательно, чтобы сила и давление не были слишком высокими для удаления протромбина и фактора XIII из геля, не образующего поперечных связей фибрина.

Теперь гель, не образующий поперечных связей фибрина, готов для применения в качестве компонента фибринового герметика как форма состава, содержащая не образующий поперечных связей фибрин. Замечено, что когда такой состав приготавливается из всей крови, примерно от 60% до 90% первоначального фибриногена присутствует в составе, но, естественно, в форме не образующего поперечных связей фибрина.

Состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, может быть использован сразу же после того, как он получен. Наиболее желательно использовать такой состав сразу же после его получения, когда состав является собственным. Если состав не используется сразу же после получения, его можно хранить.

Хранение состава требует, например, его замораживания или лиофилизации, или содержания его при температуре 4^oC. Состав в замороженной или лиофильной форме будет стабильным несколько месяцев. Если состав содержит при 4^oC, считается, что состав стабильный по крайней мере в течение нескольких дней.

Если состав заморожен, он должен быть разморожен перед применением. Этот способ, в результате которого происходит образование геля не образующего поперечных связей фибрина, превращает фибриноген в гель не образующего поперечных связей фибрина и концентрирует этот гель обязательно за один этап.

Альтернативно, но менее желательно, можно добиться концентрации фибриногена традиционными способами, например, с помощью криогенного осаждения и осаждения с применением различных реагентов, например, полиэтиленового гликоля, эфира, этанола, сульфата аммония или глицина.

Концентрированный фибриноген затем может быть превращен в гель не образующего поперечных связей фибрина описанными выше способами или, предпочтительно, если фибриноген уже в концентрированной форме, он может быть превращен в состав, содержащий мономер фибрина, без необходимости образовать прежде гель не образующего поперечных связей фибрина. Это может быть выполнено путем контакта концентрированного фибриногена с хаотропным агентом для получения раствора фибриногена.

Хаотропный агент необходим для предупреждения самопроизвольной полимеризации мономера фибрина, образованного от контакта фибриногена с ферментом в виде тромбина. Хаотропный агент смешивается с таким фибриногенным составом и затем взбалтывается в течение около 1-2 минут для образования раствора фибриногена. Фибриноген может затем превратиться в мономер фибрина, например, с помощью фермента в виде тромбина, как описано выше, или же с помощью фермента в виде тромбина, зафиксированного на носителе, как описано ниже.

Пригодные хаотропные агенты включают мочевину, бромид натрия, гидрохлорид гуанидина, KCNS, иодид калия и бромид калия. Предпочитаемая концентрация хаотропного агента составляет примерно от 0,2 до 6,0 моляр, и наиболее предпочитаемая - примерно от 0,3 до 2,0 моляр. Желательно применять как можно малое количество хаотропного агента, способного предотвратить спонтанную полимеризацию мономера фибрина.

Следует отметить, что желательно не добавлять источник ионов кальция к хаотропному агенту, пока нужно преобразовать мономер фибрина в полимер фибрина, как описано ниже. Это гарантирует то, что мономер фибрина не будет образовывать поперечные связи, благодаря активности любых эндогенных факторов, влияющих на свертываемость крови.

В предпочтительном варианте изобретения фирмент в виде тромбина фиксируется и на носителе. Предпочтение отдается такому варианту, потому что можно легко отделить фиксированный фермент от плазмы, тем самым предохраняя состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, от загрязнения ферментом.

Согласно настоящему изобретению, может быть использован любой носитель, к которому может прикрепляться фермент в виде тромбина. Неограниченными примерами пригодных носителей являются целлюлоза, полидекстраны, агароза, полистиролы, двуокись кремния, полиакриловые кислоты, полиакриламиды, поливиниловые спирты, стеклянные шарики, политетрафторэтилен, поликарбонат, коллаген, производные целлюлозы, тефлон и их композиты, при этом предпочтение отдается двуокиси кремния, полистиролу и агарозе, наибольшее предпочтение отдается агарозе.

В другом предпочтительном варианте фермент в виде тромбина закрепляется к носителю, представленному фильтром, или на одной стороне фильтра и закрепляется к другому носителю, например, шарику. Другими словами, фермент в виде тромбина пройдет через фильтр.

Следовательно, размер отверстий фильтра должен быть таким, чтобы фиксированный фермент в виде тромбина не смог пройти через фильтр, а не образующий поперечных связей фибрин - смог. Не образующий поперечных связей фибрин получается с помощью контактирования плазмы с ферментом в виде тромбина на одной стороне фильтра для образования мономера фибрина, который вместе с оставшейся плазмой проходит через фильтр.

Таким образом, полученный состав, содержащий не образующий поперечных связей фибрин, обязательно отделяется от фермента в виде тромбина. Мономер фибрина, сразу же после прохождения фильтра самопроизвольно полимеризуется для образования не образующего поперечных связей фибрина.

Чтобы зафиксировать фермент в виде тромбина к носителю, последний должен быть активирован. Это может быть выполнено любым подходящим способом. Например, различными активными химическими составами, пригодными для образования производных, являются: группы диазония, группы изоцианата, группы хлорангидрида кислоты, группы ангидрида кислоты, группы сульфонилхлорида, группы динитрофторфенила, группы изотиоцианата, гидроксильные группы, аминогруппы, группы n-гидроксисукцинимида, группы триазина, гидразиногруппы, группы карбодимида, группы силана и бромид циана.

См.: (а) Пентафарм Патент DT 2440 254 Al; (б) P. D. G. Dean, W.S.Johnson и F.A.Middle (Издатели) (1991) IRL Press Oxford - Хроматография сродства - Практический подход- - глава 2 - Способы активации, выдержки из которых приведены здесь в качестве ссылки.

Предпочитаемый способ химической активации осуществляется с помощью группы гидразида. Применение носителя, активированного гидразидом, вытекает из максимальной процентной концентрации (по крайней мере, примерно от 30 до 50%, как измерено в анализе S2238 - См. Axelsson G. и др. Thromb. Haemost., 36: 517 (1976)) фермента в виде тромбина, задерживающего его активность, главным образом, без выщелачивания фермента. К тому же, низкие значения pH, например pH 4-6, могут быть использованы для связывания фермента в целях предупреждения его разрушения.

Обычно активация носителя осуществляется с помощью высокореактивного соединения, затем носитель вступает в реакцию с функциональной группой лиганда, например -OH, -NH₂, -SH, -COOH, -CHO для образования ковалентной связи.

Предпочитаемыми активирующими средствами, используемыми в настоящем изобретении, являются: (а) с помощью группы триазина и предпочтительно групп триазингалогенида; (б) с помощью трезилхлоридной группы; (в) с помощью карбонилдиимидазольной группы; (г) с помощью цианобромидной группы; и (д) с помощью гидразидной или амминной группы.

В пунктах (а)-(г) протеин соединяется посредством реакции с группами -NH₂, -SH или -OH, тогда как в пункте (д) протеин связывается посредством окисленной углеводной части, т.е. -с -CHO.

Применение этих химических соединений обусловлено максимальной процентной концентрацией (по крайней мере, примерно от 30 до 50%, как измерено в анализе 2238) фермента в виде тромбина, сдерживающего его активность, главным образом, без выщелачивания фермента.

Для активации триазином использовали два различных способа. Первый способ заключается в связывании триазинового кольца непосредственно с поверхностными группами OH. Это похоже на применяемый способ активации CNBr, где поверхностные диодовые группы вступали в реакцию с CNBr. При активации триазином группы OH агарозы вступали в реакцию с триазином (цианурхлоридом).

Обычно носитель активируется высоко реактивным соединением, затем он вступает в реакцию с функциональной группой лиганда, т.е. -OH, -NH₂, -SH, -CHO для образования ковалентной связи. Оставшиеся активные группы, не имеющие присоединенного фермента в виде тромбина, могут быть, но не обязательно, блокированы нереактивными соединениями, такими, как этаноламин, уксусный ангидрид или глицин.

Предпочитаемыми способами активации, применяемыми в настоящем изобретении, являются следующие: (а) активация цианобромидом, за которой следует прямое соединение фермента посредством -NH₂ групп на протеине; (б) активация носителя монохлортриазином, за которой следует соединение фермента посредством групп -NH₂, -OH или -SH; (в) активация носителя дихлортриазином, за которой следует соединение фермента посредством групп -NH₂, -OH или -SH; (г) активация носителя трезилхлоридом, за которой следует соединение фермента посредством групп -NH₂, -OH или -SH; (д) активация носителя гидразином адиминовой кислоты или гидразином, за которой следует соединение окислительного фермента посредством групп -CHO; (е) активация носителя аминолигандом, за которой следует соединение окислительного фермента посредством групп -CHO.

Во всех перечисленных выше предпочитаемых способах в качестве носителя используется агароза, однако возможно применять двуокись кремния.

При использовании этого носителя предпочитаемыми способами активации являются следующие: (а) активация гамма-глицидоксипропилтриметоксисиланом с прямым соединением фермента в виде тромбина посредством групп NH₂ на протеине; (б) активация цианобромидом, за которой следует прямое соединение фермента посредством групп -NH₂ на протеине; (в) активация гамма-глицидокситриметоксиланом, за которой следует разрыв эпоксидного кольца для образования диоловой группы, которая затем может быть активирована цианобромидом. Прямое соединение фермента может быть достигнуто посредством групп -NH₂ на протеине; (г) активация гамма-глицидоксипропилтриметоксисиланом, за которой следует получение аминодвуокиси кремния путем обработки раствором аммиака.

Далее аминодвуокись кремния может быть активирована цианурхлоридом (триазином) и фермент соединен с помощью групп -NH₂, -OH или -SH.

Соединение фермента с активированным носителем может быть амортизировано на некотором значении pH с целью получения оптимального ферментного связующего вещества. Обычно со стандартными способами активации, такими, как гамма - глицидоксипропилтриметоксисилановое соединение фермента с активированным носителем и цианобромидом, соединение любого протеина с активными группами требует буферного действия при значениях pH на 1-2 единицы выше, чем pН (показатель кислотности) первичных и вторичных аминов ферментов.

Однако применение цианурхлорида в качестве активатора дает возможность использовать буферы с намного низким значением pH (оптимальное соединение pH составляет 4-6).

Другой способ соединения гликопротеинов, таких как батроксобин, с инертным носителем осуществляется посредством их углеводных частей. Это влечет за собой прежде всего окисление сахарной группы до групп -CHO, за которым следует прямое соединение при кислотном pH до аминогруппы, такой как гидразид. Можно применять большое количество соединяющих буферов.

Например, см. таблицу 2.

После активации носитель будет иметь больше активных зон, чем требуется для соединения фермента. Эти зоны, если они не дезактивированы, могут ковалентно связывать примеси протеина, которые способны повлиять на биологическую функцию фиксированного фермента.

Лишние группы могут быть дезактивированы ковалентным соединением небольших, неинтерферентных аминов, таких как этаноламин.

Если применяются носители, активированные гидразидом или амином, блокирование остаточных реактивных групп, следующих за соединением фермента, может быть достигнуто с помощью уксусного ангидрида.

В зависимости от способа фиксации и носителя дезактивация фермента осуществляется в течение процесса фиксации. При применении носителя двуокиси кремния с наиболее желательным веществом активации (например, цианобромидом) теряется до 80-90% активности фермента. Однако применение агарозы в качестве носителя при активации цианурхлоридом дает меньшую потерю активности фермента.

Чтобы охарактеризовать эффективность фиксированного фермента на носителе могут быть использованы два способа для определения количества активного фермента, зафиксированного на носителе: анализ на время образования сгустка - Clauss A., Acta Haematol., 17:237 (1957) и анализ S2238 - См. Axelsson G. и др., Thromb. Haemost., 36: 517 (1976).

Для определения выщелачивания фермента с носителя может быть использовано следующее испытание.

Выщелачивание может быть определено с помощью отметки радиоактивным изотопом фермента в виде тромбина, например, батроксобином 1¹²⁵. Однако, прежде чем выполнять испыт