Изохинолины, способ их получения и фармацевтическая композиция на их основе

Изохинолины, способ их получения и фармацевтическая композиция на их основе

Реферат

 

Изохинолины формулы I где R - этильная или н-пропильная группа, или их физиологически гидролизуемые и приемлемые сложные эфиры или кислотноаддитивные соли таких соединений или сложных эфиров, обладают противовоспалительными, снижающими гиперреактивность дыхательных путей, а также бронхорасширяющими свойствами. 3 с. и 3 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение касается новых изохинолинов, способа их получения, их применения в качестве фармацевтических средств, а также фармацевтических составов, содержащих указанные изохинолины.

Конкретно, одним из аспектов настоящего изобретения является соединение, соответствующее формуле (I) в которой R является этильной или н-пропильной группой, или его физиологически гидролизуемый и приемлемый эфир, а также соль, образующаяся в результате добавления кислоты к указанному соединению или эфиру.

В предпочтительном случае R в формуле (I) является этильной группой.

Под термином "физиологически гидролизуемый и приемлемый эфир" в настоящем описании подразумевают эфир, представляющий собой соответствующее формуле (I) соединение, этерифицированное по его гидроксильной группе и гидролизуемое при физиологических условиях с получением кислоты, физиологически приемлемой в необходимых для применения количествах. Таким образом, указанный термин следует понимать как обозначение обычных форм предшественника медикамента. Примерами такого рода эфиров являются, в частности, ацетаты и бензоаты соединений, соответствующих формуле (I).

Как уже было отмечено выше, соединения, соответствующие формуле (I), а также их эфиры существуют как в свободной форме, так и в форме соли, образующейся в результате добавления к ним кислоты. К числу солей, образующихся в результате добавления фармацевтически приемлемых кислот и предназначенных для фармацевтического использования в соответствии с настоящим изобретением, относятся, в частности, гидрохлориды, кислые фумараты, кислые малеаты и кислые оксалаты.

Предусмотренные настоящим изобретением соединения, эфиры и соли подпадают под область рассмотрения изобретения, описанного и определенного в патентах [UK 2213482, US 4980359], а также в соответствующих патентах и заявках различных стран. Соединения, эфиры и соли, предусмотренные настоящим изобретением, являются новыми, а по сравнению с соединениями, эфирами и солями, непосредственно описанными в указанных патентах, неожиданно проявляют более выгодные свойства, в особенности в плане их предполагаемого фармацевтического применения, в частности, описанного ниже.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения соединения, соответствующего формуле (I), или его физиологически гидролизуемого и приемлемого эфира, а также соли, образующейся в результате добавления кислоты к указанному соединению или эфиру, при котором а) для получения соединения, соответствующего формуле (I), проводят снятие защиты и/или дегидрогенирование соединения, описываемого формулой (II) в которой X обозначает атом водорода, а R₁ и R₂ представляют собой дополнительную связь, изображенную в виде пунктирной линии, или X соответствует группе, защищающей гидроксильный радикал, а каждая из групп R₁ и R₂ представляет собой атом водорода или вместе обозначают дополнительную связь, изображенную в виде пунктирной линии; б) для получения физиологически гидролизуемого и приемлемого эфира соединения, соответствующего формуле (I), проводят этерификацию соответствующего формуле (I) соединения и выделяют продукт этапа а) или б) в свободной форме или в форме соли, образованной в результате добавления к нему кислоты.

В соответствии с этапом а) удаление группы, защищающей гидроксильный радикал, или дегидрогенирование может быть осуществлено с помощью хорошо известных способов. Удобный вариант этапа а) предусматривает как снятие защиты, так и дегидрирование, например, используя соединение, соответствующее формуле (II), в которой X обозначает бензильную защитную группу, а каждый из радикалов R₁ и R₂ представляет собой атом водорода, и обеспечивая отщепление бензильной группы и дегидрирование в ходе реакции, осуществляющейся в одном сосуде, например, при помощи обработки палладиево-угольным катализатором при повышенной температуре в инертной атмосфере, в инертном растворителе или разбавителе, например, как это описано ниже в Примере 1.

В соответствии с этапом б) этерификацию также можно проводить с помощью стандартных способов, например, путем приведения соединения, соответствующего формуле (I), во взаимодействие с галогенидом или ангидридом приемлемой кислоты в присутствии основания, в том числе амина или карбоната щелочного металла. Реакцию удобно проводить в инертном растворителе или разбавителе, например, при температуре от 0 до 120^oC в условиях инертной атмосферы.

Исходные вещества для этапа а) описанного выше способа могут быть получены в соответствии со схемой реакции, приведенной в конце описания, в которой X¹ представляет собой группу, защищающую гидроксильиый радикал, например, бензильную группу, а каждый из радикалов Y¹ и Y² обозначает отщепляемую группу. Удобными отщепляемыми радикалами Y¹ могут служить атом иода или тозильная группа, причем тозильная группа является предпочтительной в случае более масштабного производства. Удобным радикалом Y² служит атом хлора. Этапы в) - ж) могут быть осуществлены в соответствии со стандартными способами, например, описанными в прилагающихся Примерах. Снятие защиты с соединений, отвечающих формуле (IIа), приходит к образованию соединений, описываемых формулой (II), в которой X представляет собой атом водорода. Дегидрирование соединений, соответствующих формуле (IIа), приводит к образованию соединений, отвечающих формуле (II), в которой радикалы R₁ и R₂ вместе обозначают дополнительную связь.

Соединения, соответствующие формулам (IlIa), (IIIб) и (VII), являются коммерчески доступными, хорошо известными веществами, или их можно получить по аналогии с известными соединениями. Подобные вещества, соответствующие формуле (VII), можно получить на основе метилового эфира 2,5-дигидрокси бензойной кислоты посредством его алкилирования изопропил иодидом в присутствии основания, такого как K₂CO₃, с использованием метил-этилкетона в качестве растворителя, гидролиза полученного метилового эфира 3,5-ди-изопропокси бензойной кислоты, например, с помощью обработки NaOH в метаноле в качестве растворителя, и, наконец, превращения полученной 3,5-ди-изопропокси бензойной кислоты в, например, соответствующий галоидангидрид, в частности, в хлорангидрид кислоты с помощью взаимодействия с SOCl₂.

Следующие Примеры иллюстрируют предусмотренный настоящим изобретением способ.

Пример 1.

Получение 1-(3,5- диизопропоксифенил)-3-этил- 6-(2-гидроксиэтокси)-7-метокси-изохинолина (Формула I: R = - C₂H₅) 1) Этап а) предусмотренного настоящим изобретением способа - снятие защиты и дегидрирование 13,5 г 6-бензилоксиэтокси-1-(3,5-диизопропоксифенил)-3- этил-7-метокси-3,4-дигидро-изохинолина (Формула IIа: X¹ = бензильная группа, R = этильная группа), 1,3 г 10%-го палладиево-угольного катализатора и 500 мл декагидронафталина перемешивают в течение 5 часов при 200^oC в атмосфере аргона. Полученную реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через Hyflo и промывают этилацетатом. Проводят отгонку декагидронафталина при 50^oC в вакууме, а полученный продукт реакции очищают с помощью хроматографии на силикагеле ( 0,04-0,06 мм) с получением искомого соединения: т.пл. свободного основания = 116-118^oC.

гидрохлорида 218-222^oC кислого фумарата = 82,5^oC кислого оксалата = 106-107^oC кислого малеата = 87-96^oC Исходные вещества для указанного способа можно получить следующим образом: 2) 3-(2-Бензилоксиэтокси)-4-метокси- бензальдегид (формула IV: X¹ = бензильная группа) 20 г изованиллина (формула IlIa), 41,3 г 2-бензилоксиэтил иодида (формула IIIб) и 21,8 г карбоната калия в 200 мл этилметилкетона перемешивают в течение 12 часов в условиях дефлегмации. Полученную суспензию охлаждают до комнатной температуры, отфильтровывают образующийся осадок, промывают ацетоном и выпаривают. Остаток отбирают в этилацетат, трижды экстрагируют водой и один раз - насыщенным раствором соли. Органическую фазу высушивают, фильтруют и выпаривают с получением искомого соединения в виде масла.

3) 3-(2-Бензилоксиэтокси)-4- метоксибензилэтилкетон (формула V: X¹ = бензильная группа, R = этильная группа) 24 г продукта, получаемого в результате этапа 2), 21,5 г этилового эфира бромбутировой кислоты и 30 мл т-бутил-метилового эфира добавляют по каплям в течение 50 мин при 5^oC к заранее приготовленной суспензии метилата натрия в 25 мл т-бутил-метилового эфира. Реакционную смесь перемешивают в течение 45 мин при температуре приблизительно 5^oC, после чего перемешивают в течение еще 12 ч при комнатной температуре. Добавляя ледяную уксусную кислоту, доводят pH до 5, а полученную суспензию разбавляют водой и трижды экстрагируют т-бутил-метиловым эфиром. Органическую фазу экстрагируют NaHCO₃, затем насыщенным раствором соли, после чего выпаривают до объема, приблизительно равного 100 мл. По каплям добавляют 13,5 мл 50%-ного водного NaOH и перемешивают полученную смесь в течение 2 ч при 40^oC, затем разбавляют 50 мл воды и перемешивают в течение еще 30 мин при комнатной температуре. Отделяют органическую фазу, pH водной фазы доводят до 1 с помощью 15 мл концентрированной HCl при температуре не выше 40^oC. Полученную реакционную смесь перемешивают при 40^oC в течение еще 1,5 ч, охлаждают до комнатной температуры и экстрагируют толуолом. Органическую фазу промывают NaHCO₃ и насыщенным раствором соли, высушивают над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают с получением искомого соединения в виде масла.

4) 1-[3-(2-Бензилоксиэтокси)-4-метоксифенил] -2-аминобутан (формула VI: X¹ = бензильная группа, R = этильная группа) 20,6 г продукта, получаемого в результате этапа в), 48,4 г ацетата аммония и 3,9 г цианоборогидрида натрия в 235 мл CH₃OH в присутствии 12,1 г молекулярного сита 0,4 мм перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в инертной атмосфере. Полученную реакционную смесь фильтруют через Hyflo и промывают CH₃OH. Концентрируют фильтрат, остаток отбирают в этиловый эфир и экстрагируют 15%-ным NaOH, водой и водным раствором соли. Органическую фазу высушивают над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают с получением искомого соединения в виде масла.

5) N-(3, 5- Диизопропоксибензоил)-1-[3-(2-бензилоксиэтокси)-4-метоксифенил] - 2-аминобутан (Формула VIII: X¹ = бензильная группа, R = этильная группа) 19,9 г 3,5-диизопропокси бензоил хлорида в 100 мл CH₂Cl₂ добавляют по каплям в течение 1,5 ч к 17,0 г продукта, получаемого в результате этапа 4), 15,6 г триэтиламина и 630 мг N,N-диметиламинопиридина в 150 мл CH₂Cl₂ и перемешивают реакционную смесь в течение 12 ч при температуре в пределах от 0^oC до комнатной. Концентрируют полученную смесь, остаток отбирают в этилацетат и экстрагируют 1N соляной HCl, 10%-ным раствором NaHCO₃ и насыщенным раствором соли. Органическую фазу высушивают над Na₂SO₄, фильтруют и концентрируют. Начинающий кристаллизоваться остаток разбавляют этиловым эфиром и фильтруют с получением искомого соединения. Его используют в следующей реакции без дополнительной очистки.

6) 6-Бензилоксиэтокси-1-(3, 5-диизопропоксифенил)-3-этил-7-метокси- 3,4-дигидроизохинолин 15,3 г продукта, получаемого в результате этапа 5), и 12,4 г POCl₃ в 250 мл ацетонитрила перемешивают в течение 5 ч в условиях дефлегмации. Концентрируют реакционную смесь, остаток отбирают в этилацетат и экстрагируют раствором Na₂SO₄ и насыщенным раствором соли. Органическую фазу высушивают над Na₂SO₄, фильтруют и выпаривают, а остаток очищают с помощью хроматографии на силикагеле ( 0,04-0,06 мм) с получением искомого соединения в виде масла.

Пример 2 Получение 1-(3, 5-диизопропоксифенил)-6-(2- гидроксиэтокси)-7-метокси-3-н-пропил-изохинолина (Формула I: R = н-пропил) Искомое соединение получают аналогично Примеру 1: свободное основание получают в виде пены: т.пл. кислого оксалата = 154-156^oC.

Соединения, соответствующие формуле (I), их физиологически гидролизуемые и приемлемые эфиры, а также фармацевтически приемлемые соли, образующиеся в результате добавления кислоты к указанным соединениям или эфирам (в дальнейшем совокупно называемые предусмотренными настоящим изобретением агентами) проявляют фармакологическую активность и рекомендуются к использованию в качестве фармацевтических средств, в том числе в терапевтических целях при лечении заболеваний и симптомов, перечисляемых ниже.

Конкретно, предусмотренные настоящим изобретением агенты обладают активностью, ингибирующей изофермент циклическую нуклеотидфосфодиэстеразу (ФДЭ), оказывающей избирательный эффект по отношению к IV типу изофермента, а также проявляющей существенно и неожиданно большую специфичность по отношению к изоферменту IV типа, нежели известные соединения, например, описанные в вышеупомянутых патентах [VK, 2213482, US, 4980359].

Предусмотренные настоящим изобретением агенты обладают противовоспалительными, снижающими гиперреактивность дыхательных путей, а также бронхорасширяющими свойствами. Кроме того, они проявляют иммуносупрессивную, подавляющую секрецию TNF и прочие фармакологические активности, что можно продемонстрировать стандартными тестовыми методами, в частности, следующими.

(Все описываемые ниже эксперименты адекватно проведены с использованием кислой щавелевокислой соли тестируемого соединения, например, соединения из Примера 1. В случае соединения из Примера 1 можно приготовить стабильный 30 мМ сток-раствор с 10%-ным Tween в 80%-ном C₂H₅OH. Для использования в фармакологических экспериментах его следует разбавлять по меньшей мере в соотношении 1:10000.) ИНГИБИРОВАНИЕ ИЗОФЕРМЕНТА ФДЭ Тест A: Тест на ингибирование изофермента ФДЭ человека Все препараты изоферментов получены из человеческих тканей. Препараты изоферментов III и IV типа получены с помощью перечисленных ниже способов, используя преобладание изофермента III типа в тромбоцитах, а изофермента IV типа - в нейтрофилах.

Клетки и ткани гомогенизируют на ледяной бане в 10 мМ трис-HCI (pH 7,4), содержащем сахарозу (250 мМ), ЭДТА (1 мМ), дитиотрейтол (1 мМ), лейпептин и пепстатин (по 1 мкг/мл каждого) и фенил-метил-сульфонил фторид (ФМСФ, 0,17 мг/мл, добавляют непосредственно перед гомогенизацией). Нейтрофилы (тип IV) и тромбоциты (типы II и III) получают из крови человека и гомогенизируют под действием ультразвука (Branson probe, 4х15 сек). Легкое человека (типы I и V) получают от больных, претерпевающих хирургическое вмешательство, и гомогенизируют с помощью гомогенизатора Polytron (две обработки по 30 сек).

Препараты изоферментов: препараты ФДЭ III и IV (субстрат -1 мкМ цАМФ) состоят из низкоскоростных супернатантов соответственно тромбоцитов и нейтрофилов. Изоферменты типа 1 (субстрат - 1 мкМ цАМФ, 0,5 мМ Ca²⁺, 125 нМ кальмодулин), II (100 мкМ цАМФ) и V (1 мкМ цГМФ) разделяют с помощью анион-обменной хроматографии (Q-Сефароза) с использованием градиента NaCI в буфере для гомогенизации, не содержащем сахарозы и ФМСФ (0-0,1 М NaCI в 2,5 объемах колонки, 0,1 - 0,45 М в 24 объемах колонки). ФДЭ 1: фракции, в которых гидролиз 1 мкМ цАМФ можно стимулировать смесью Ca²⁺ кальмодулин (0,5 мМ и 125 нМ, соответственно); элюция при 0,17- 0,18 М NaCI. ФДЭ II: фракции, в которых существенная активность, гидролизующая цАМФ, наблюдается при 100 мкМ, но не 1 мкМ субстрата: элюция при 0,31-0,32 М NaCl. ФДЭ V: фракции, избирательно гидролизующие 1 мкМ цГМФ, а не 1 мкМ цАМФ; элюция при 0,20-0,24 М NaCl.

Активность ФДЭ определяют в присутствии или в отсутствие тестируемого вещества в различных концентрациях с помощью метода ионно-обменной колонки, описанного Томпсоном с соавторами [Nucleotide Res., 10, 69-92, 1979], с использованием в качестве субстрата 1 мкМ [³H]-циклического АМФ.

В этом тестовом методе предусмотренные настоящим изобретением агенты преимущественно ингибируют тизоферменты III, IV и V типов, оказывая сравнительно слабое влияние на изоферменты I и II типов. В пределах группы изоферментов III, IV и V типов предусмотренные настоящим изобретением агенты обладают заметно повышенной избирательностью ингибирования IV типа изоферментов ФДЭ по сравнению с другими известными ингибиторами изоферментов ФДЭ и могут быть охарактеризованы как специфичные по отношению к изоферментам IV типа. Так, в одном из проведенных тестов показано, что соединение из Примера 1 в форме кислой щавелевокислой соли проявляет по меньшей мере в 180 раз большую ингибирующую активность по отношению к изоферменту IV типа, нежели к другим исследованным препаратам изофермента.

ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ Тест Б: Подавление активации эозинофилов формил-метионин- лейцин-фенилаланином (ФМЛФ) Очищенные эозинофилы человека (10⁴/лунку в 0,2 мл HBSS) стимулируют с помощью ФМЛФ (1 мкМ) в присутствии люцигенина (25 мкМ). Подавление всплеска окисления (измеряемого по изменениям в хемолюминисценции) определяют на основании кривых дозового ответа с помощью логистического уравнения.

Предусмотренные настоящим изобретением агенты проявляют активность в вышеупомянутом тестовом методе в концентрациях порядка 0,001- 0,5 мкМ.

г) Тест В: Подавление секреции ТNF- 900 мкл клеток ТНР-1 (0,5х10⁶ клеток вместе с 100 Ед. -интерферона/0,9 мл) раскапывают в 24-луночные планшеты для культивирования, после чего добавляют 100 мкл тестируемого вещества. Через 3 часа инкубирования при 37^oC в атмосфере 5% CO₂ и 95% воздуха добавляют 10 мкл LPS в концентрации 5 мкг/мл и продолжают инкубирование в течение еще 40 часов. Кроме того, проводят необходимые контроли. Затем отбирают полученную среду и проводят осаждение с помощью центрифугирования при 1000 g в течение 10 мин. К лункам добавляют по 1,0 мл 0,01%-ного дигитонина для лизирования клеток, разрыхленных путем растирания резиновым скребком, и оставляют при 4^oC на 10 минут. Непосредственно вслед за этим измеряют активность лактат дегидрогеназы, после чего хранят образцы при -20^oC до тех пор, пока не станет возможным провести другие определения. Исследуемыми пробами являются: IL-1 (среда), TNF- (среда) и ДНК (лизаты). Пробы на IL-1 и TNF- осуществляют с использованием коммерчески доступных наборов для ELISA.

Для исследования ДНК используют метод Капусцинского с соавторами [Anal. Biochem. 83, 252-257, 1977]. Образцы клеточных лизатов в 0,01%-ном дигитонине объемом 300 мкл смешивают с 750 мкл трис-HCl буфера pH 7,0 (содержащего 13,2 мМ Na₂SO₄), 300 мкл воды и 150 мкл 2 мкг/мл ДАФИ (4',6-диамидино-2-фенилиндол2HCl). После этого с помощью флюориметра Perkin Elmer 3000 измеряют флюоресценцию при 372 нм (возбуждение) и 454 нм (эмиссия). Образцы сравнивают со стандартной кривой ДНК тимуса теленка (0,5-10 мкг/мл), исследуемой в это же время.

Тестирование лактат дегидрогеназы проводят следующим образом: образцы объемом 50 мкл (среда или клеточные лизаты в 0,01%-ном дигитонине) вносят в 96-луночные планшеты для микротитрования, после чего добавляют 200 мкл 0,3 мМ НАДН / 1мМ пирувата натрия в натрийфосфатном (62 мМ) буфере pH 7,5. Осторожно покачивают планшет с помощью механического встряхивателя для микротитровальных планшетов и помещают в спектрофотометр Twinreader (Flow Laboratories). В течение 11 минут через каждую минуту автоматически измеряют значения молярной экстинкции при 340 нм и с помощью компьютерной программы автоматически высчитывают активность фермента. Так как ферментативная активность утрачивается при замораживании и оттаивании, тестирование проводят на свежеполученных образцах.

Добавляют тестируемые соединения с -интерферона в различной концентрации и оставляют их с клетками в течение эксперимента.

В описанном выше тестовом методе предусмотренные настоящим изобретением соединения оказывают мощное подавление секреции TNF- , находясь в концентрациях порядка 0,001 - 0,5 мкМ. Подавление секреции интерлейкина-1 наблюдается при существенно более высоких концентрациях.

Тест Г: Подавление образования лейкотриена (SRS-A) За 24 ч до эксперимента морских свинок пассивно иммунизируют путем внутривенного введения 1 мл гомологичной анти-овальбуминовой антисыворотки. Перед применением антигена тестовым животным предварительно внутривенно вводят 0,32 мг/кг пропанола (ингибирование эндогенных катехоламинов), 3,2 мг/кг мепирамина (антагонист рецептора H1) и 3,2 мг/кг индометацина (ингибирование цикло-оксигеназы). Воздействие аллергеном осуществляют путем внутривенного введения 32 мкг/кг овальбумина, наблюдаемый в результате этого ответ сужающей мышцы на устойчивость дыхательных путей используют в качестве функционального показателя активности лейкотриена. Отдельные тестируемые группы получают 10 мг/кг FLP 55712 (антагонист рецептора LTD₄) внутривенно за 1 минуту до воздействия или различные концентрации тестируемого вещества путем внутривенного вливания, начинаемого за 16 минут до воздействия. Группы, получившие FLP 55712, проявляют отсутствие сужения бронхов, что подтверждает участие лейкотриена в качестве посредника в рассматриваемом ответе.

В вышеописанном тестовом методе предусмотренные настоящим изобретением агенты подавляют продукцию лейкотриена, что видно из ослабления ответа сужающей мышцы при внутривенном вливании доз в пределах от 5 до 100 мкг/кг/мин.

Тест Д: Летальный эффект, индуцированный у морских свинок бактериальным эндотоксином (LРS).

Морских свинок анестезируют посредством внутрибрюшинной инъекции фенобарбитона натрия (100 мг/кг) с добавкой пентобарбитона натрия (30 мг/кг) и парализуют с помощью внутримышечной инъекции галламина (10 мг/кг). Животным осуществляют искусственное дыхание через трахейную канюлю смесью воздуха и кислорода (объемное соотношение 40:60; 8 мл/кг, 1 Гц). За протеканием искусственного дыхания ведут наблюдение с помощью пневмотахографа, соединенного с передатчиком дифференциального давления. Соответствующие изменения давления внутри грудной клетки измеряют через грудную канюлю с использованием передатчика дифференциального давления таким образом, что разницу давления между трахеей и грудной клеткой можно измерять и выводить на дисплей. Данные о кровяном давлении и частоте сердечных сокращений снимают с сонной артерии с помощью передатчика давления, а также вводят канюлю в правую яремную вену для обеспечения внутривенного вливания тестируемого вещества как за минуты до, так и сопутствующего вливанию LPS, производимого с постоянной скоростью (3,0 мл/ч с получением конечной концентрации 10 мг/кг/ч) через вливающий насос. В левую яремную вену вставляют канюлю для введения () пропанолола (1 мг/кг), инъецируемого во внутривенный просвет. На основании измерений потока воздуха и легочного давления после каждого дыхательного цикла рассчитывают значения R_L и C_dyn с использованием цифровой электронной системы слежения за дыханием, представляющей данные о кровяном давлении, давлении внутри грудной клетки и воздушном потоке, а также вычисляющей для настоящего времени значения R_L и C_dyn, предназначенные для выведения на визуальный дисплей. Полученные в экспериментах данные последовательно сохраняют, а по окончании эксперимента вычерчивают экспериментальные кривые или обработанные данные.

Вливание [() пропанолола] подтверждает четкую чувствительность к LPS. У анестезированных животных, предварительно обработанных () пропанололом, вливание LPS в рассматриваемой модели вызывает прогрессивное затруднение дыхания. Смерть в результате эндотоксинового шока обычно наступает в течение приблизительно 1 ч после прекращения вливания LPS.

В вышеописанной тестовой модели предусмотренные настоящим изобретением агенты при внутривенном введении в дозах порядка 1 - 500 мг/кг/мин предохраняют животных от затруднения дыхания, вызванного эндотоксином (LPS) в течение эксперимента, а также от вызванного LPS летального эффекта, Тест Е: Контактный дерматит, вызванный у мышей раздражителем в виде арахидомовой кислоты Самкам мышей линии NMRI (вес тела приблизительно 30 г) производят локальную обработку наружной и внутренней частей правого уха смесью диметилсульфоксида, ацетона и этанола (в соотношении 2:4:4), содержащей различные концентрации тестируемого соединения. По прошествии 30 минут правое ухо локально обрабатывают с обеих сторон 1 мг арахидоновой кислоты в 10 мкл ацетона. Через 30 минут животных умервщляют, удаляют уши по линии хряща и проводят их взвешивание. Высчитывают разницу в весе между левым и правым ушами и определяют процент подавления раздражения по сравнению с контрольной группой, обработанной только арахидоновой кислотой.

Предусмотренные настоящим изобретением агенты подавляют развитие контактного дерматита в вышеописанной тестовой модели, находясь в концентрации порядка 3,0-300 мМ.

БРОНХОРАСШИРЯЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ Тест Ж: Расслабление бронха человека Образцы человеческого легкого, удаленного в ходе хирургического лечения рака, получают в течение трех дней с момента удаления. Отделяют мелкие бронхи (внутренний диаметр приблизительно 2-5 мм), разрезают на сегменты и помещают в ампулы для хранения жидкого азота емкостью 2 мл, заполненные фетальной телячьей сывороткой (ФТС), содержащей 1,8 М диметилсульфоксид (ДМСО) и 0,1 М сахарозу в качестве криопротекторов. Указанные ампулы помещают в полистирольную коробку (размером 11х11х22 см) и медленно замораживают со средней скоростью охлаждения приблизительно 0,6^oC/ мин в морозильнике, поддерживающем температуру -70^oC. Через 3 - 15 ч ампулы переносят в жидкий азот (-196^oC), где их хранят до момента использования. Перед использованием ткани выдерживают в течение 30-60 мин при температуре -70^oC, после чего проводят их оттаивание, помещая ампулы на 2,5 мин в водяную баню с температурой 37^oC. В дальнейшем бронхиальные сегменты ополаскивают, помещая их в чашку, содержащую раствор Кребса- Генслейта (состав в мМ: NaCl - 118; KCl - 4,7; MgSO₄ - 1,2; CaCl₂ -1,2; KH₂PO₄ - 1,2; NaHCO₃ - 25, глюкоза - 11; ЭДТА -0,03) при 37^oC, нарезают на кольца и суспендируют в ванночках для органов емкостью 10 мл с целью регистрации изометрического растяжения в условиях предварительной нагрузки приблизительно в 1 г. Кривые "доза-эффект" получают путем кумулятивного добавления, каждую концентрацию добавляют по достижении максимального эффекта, вызываемого предыдущей концентрацией. По окончании снятия кривой "доза-эффект" добавляют папаверин (300 мкМ) для индукции полного расслабления бронхиальных колец. Получаемый при этом результат рассматривают в качестве 100%-ного расслабления.

В вышеописанной тестовой модели предусмотренные настоящим изобретением агенты вызывают зависимое от концентрации расслабление препаратов бронхиальных колец человека, находясь в концентрации от 0,001 до 1,0 мкМ.

Тест 3: Подавление сужения бронхов, вызванного лейкотриеном Морских свинок (самцов линии Dunkin-Hartley, весом 400-600 г) анестезируют путем внутрибрюшинного введения фенобарбитала (100 мг/кг) и пентобарбитала (30 мг/кг) и парализуют с помощью внутримышечной инъекции галламина (100 мг/кг). Через трахейную канюлю животным осуществляют искусственное дыхание смесью воздуха и кислорода (объемное соотношение 45:55, 8 мл/кг, 1 Гц). Данные о кровяном давлении и частоте сердечных сокращений снимают с сонной артерии. Наблюдение за искусственным дыханием проводят с помощью передатчика потока Флейша, подсоединенного к дыхательному кругу. При измерении потока соответствующие изменения давления в грудной клетке регистрируют непосредственно через внутригрудной троакар, что позволяет выявлять связанное с трахеей дифференциальное давление. На основании этой информации, исходя из данных о потоке и дифференциальном давлении, с помощью цифрового анализатора дыхания рассчитывают показатели устойчивости (R₁) и лабильности (C_dyn) для каждого дыхательного цикла.

За 24 часа до тестирования подопытных животных пассивно иммунизируют путем внутривенного введения гомологичной анти- овальбуминовой антисыворотки (1 мл). Перед применением аллергена животным предварительно внутривенно вводят пропанолол (0,32 мг/кг) для ингибирования эндогенных катехоламинов, мепирамин (3,2 мг/кг) для блокирования рецепторов H1 гистамина, а также индометацин (3,2 мг/кг) для ингибирования циклооксигеназы. Воздействие аллергеном осуществляют путем введения овальбумина (ОА), а наблюдаемый в результате этого ответ сужающей бронх мышцы используют в качестве функционального показателя активности лейкотриена.

Проводят два эксперимента: 1) В первом эксперименте животным внутривенно вводят ОА (32 мг/ кг) и исследуют эффекты, производимые внутривенной инъекцией лейкотриена FLP 55712 (антагонист рецептора D₄, 10 мг/кг за 1 минуту до введения ОА) и внутривенным вливанием тестируемого соединения (1, 10 и 100 мг/кг/мин с началом за 15 минут до введения ОА).

2) Во втором эксперименте животных обрабатывают ОА (1,0 или 1,8 мг/мл, ингалируемые в течение 60 дыханий) и измеряют эффект, производимый тестируемым соединением, вводимым в разных концентрациях в легкое путем покапельного вливания через трахею.

В первом эксперименте эффект сужения бронха под действием ОА снимается последующим применением FLP 55712, что хорошо согласуется с посреднической ролью лейкотриена в контроле рассматриваемого ответа. Предусмотренные настоящим изобретением агенты вызывают зависящее от дозы подавление сужающего бронх ответа.

Во втором эксперименте предусмотренные настоящим изобретением агенты проявляют ингибирующую активность в дозах порядка 0,001-10 мг/кг/мин, вводимых путем покапельного закапывания через трахею.

Тест И: Подавление вызванного бомбезином сужения бронхов Животных (морских свинок) подготавливают так же, как это описано выше для Теста 3. Бомбезин вводят путем равномерного внутривенного вливания с интенсивностью 100 мг/кг/мин, вызывая тем самым устойчивый спазм бронхов. Тестируемое вещество вводят внутривенно с физиологическим раствором или внутрикожно с физиологическим раствором, содержащим этанол (1 объемный процент по отношению к весу). Эффект расширения бронхов измеряют через 1 и 3 мин после внутривенного введения или через 16 и 64 мин после внутрикожного введения и выражают в виде процента подавления исходного ответа с использованием показателя R_L в качестве характеристики функционирования легкого.

В вышеописанной тестовой модели предусмотренные настоящим изобретением агенты проявляют заметную бронхорасширяющую активность при внутривенном введении в дозах порядка 0,001-0,1 мг/кг или при внутрикожном введении в дозах порядка 0,1-5,0 мг/кг.

Тест К: Подавление вызванного метахолином (MeX) сужения бронхов у макаки-резус Самцов макаки-резус (вес тела 10,3-13,2 кг) исходно анастезируют с помощью внутримышечной инъекции кетамина (20 мг/кг), а в ходе эксперимента поддерживают анестезию путем внутривенного введения тиопентала (8 мг/кг/ч) через катетер, вживленный в левую подкожную вену. Животным позволяют произвольно дышать и укладывают их в лежачее положение на левый бок. Анестезируют гортань, надгортанник и глотку местным введением ксилокаина, что позволяет ввести и разместить оснащенную манжетой педиатрическую эндотрахейную трубку диаметром 4,5 мм.

MeX применяют в виде аэрозоля (физиологический раствор в качестве носителя: аэрозоль создают пульверизатором, работающим при воздушном потоке 6 л/мин; средний размер частиц 3,5 мкм) с 2-минутной экспозицией при вдохах и выдохах. Во всех тестах используют раствор, содержащий 0,6 мг/мл Мех или 2,5 мг/мл MeX в случае слабого ответа конкретных особей. Тестирования обусловленного MeX сужения бронхов производят через получасовые промежутки времени, за 15 минут до воздействия MeX вводят исследуемое соединение (в составе 1 мл суспензии на основе лактозного носителя [1 мг/мл], применяемой в условиях бронхоскопического контроля, на расстоянии 1 см выше киля).

Исследуемые соединения применяют кумулятивным способом. Бронхорасширяющую активность оценивают как процент подавления ответа, заключающегося в сужении бронхов в результате действия MeX, по отношению к резистентности.

Предусмотренные настоящим изобретением агенты активны в вышеописанной тестовой модели при использовании в дозах порядка 10-500 нг/кг.

ПОДАВЛЕНИЕ ГИПЕРРЕАКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ Тест Л: Гиперреактивность, вызываемая у морских свинок иммунным комплексом Морских свинок анестезируют и подготавливают к регистрации легочной функции, как в случае описанного выше Теста Е. Аллергическую реакцию вызывают с помощью трехкратного внутривенного введения предварительно образованных иммунных комплексов (полученных путем добавления 30 мкг -глобулина быка в составе 0,05 мл физиологического раствора к 0,05 мл антисыворотки, вырабатываемой у морской свинки в ответ на -глобулин быка) с интервалами 10 минут. Последующее внутривенное введение гистамина (1-3,7 мкг/кг с интервалами в 10 минут) позволяет определить чувствительность дыхательных путей до и после введения иммунного комплекса. Гиперреактивность дыхательных путей выражается в виде пoпарной разницы между максимальными значениями R_L в ответ на гистамин до и после введения иммунного комплекса. Тестируемые соединения в различных концентрациях вводят через трахею вслед за индукцией гиперреактивности.

Предусмотренные настоящим изобретением агенты проявляют активность, снимающую или снижающую гиперреактивность дыхательных путей в вышеописанном тестовом методе, при их введении через трахею в дозах порядка 0,5-50,0 мкг/кг.

ИММУНОСУПРЕССОРНАЯ АКТИВНОСТЬ Тест М: Реакция смешанных лимфоцитов мыши Приблизительно 0,5х10⁶ лимфоцитов, выделенных из селезенки самок мышей (8-10 недель) линии Balb/c, инкубируют в течение 5 дней в 0,2 мл среды для роста клеток, содержащей приблизительно 0,5х10⁶ лимфоцитов, выделенных из селезенки самок мышей (8-10 недель) линии CBA. К среде добавляют различные концентрации тестируемого вещества. О наличии активности судят по способности подавлять связанный с пролиферацией синтез ДНК, выявляемый по включению радиоактивно меченного тимидина.

Предусмотренные настоящим изобретением агенты подавляют включение тимидина при их использовании в концентрациях порядка 0,1-50,0 нМ.

Кроме того, показано, что предусмотренные настоящим изобретением агенты подавляют in vitro пролиферативные ответы мононуклеарных клеток периферической крови человека, например, по отношению к туберкулину, и, в частности, проявляют синергический эффект подавления при совместном использовании с агентами, обладающими иммуносупрессивной активностью, например, с иммуносупрессивными циклоспоринами, такими как циклоспорин A, а также кортикостероидами.

В дополнение к вышесказанному общее фармакологическое тестирование, свидетельствует о том, что по сравнению с ранее известными соединениями предусмотренные настоящим изобретением агенты обладают ощутимыми и неожиданно более выгодными свойствами в плане предлагаемого ниже терапевтического использования, например, пониженным влиянием на поведенческую реакцию и/или, в частности, пониженным кардиоваскулярным эффектом в отношении гемодинамических параметров (влияния на частоту сердечных сокращений, индукции сужения сосудов и т.д.).

Так, в сериях экспериментов с использованием теста Допплера по определению аортного потока у кроликов показано, что соединение из Примера 1 в форме кислой щавелевокислой соли, образующейся в результате добавления кислоты, не вызывает побо