Рибозим, способ инактивации рнк-мишени, способ получения рибозима

Рибозим, способ инактивации рнк-мишени, способ получения рибозима

Реферат

 

Изобретение относится к синтетическим однонитевым молекулам РНК, обладающим высокоспецифичной эндонуклеазной активностью. Рибозим содержит гибридизирующуюся и каталитическую области. Гибридизирующаяся область содержит одну или более ветвей однонитевой РНК. Предпочтительный рибозим имеет каталитическую область, включающую последовательность AAGC*GAGXAGUC в шпилечной N₁-*N₂-структуре, где * означает спаривание оснований между комплементарными нуклеотидами, X является любым рибонуклеотидом и N₁ и N₂ представляют собой рибонуклеотиды с комплементарными последовательностями по меньшей мере в части их длины. Рибозим расщепляет РНК-мишень после триплета хUy, где х является любым рибонуклеотидом, U представляет собой урацил и y является аденином, цитозином или урацилом. Получают нуклеотидную последовательность, кодирующую необходимый рибозим, лигируют ее с подходящим вектором переноса, содержащим ДНК, или РНК, или их комбинацию. Транскрибируют лигированную последовательность с использованием РНК-полимеразы. На РНК-мишень внутри клетки воздействуют рибозимом, способным осуществлять специфическое расщепление указанной РНК-мишени в сайте, выбранном таким образом, что указанная РНК-мишень гибридизуется внутри клетки с рибозимом так, чтобы вызвать инактивацию РНК-мишени. Изобретение позволяет получить рибозимы, которые эффективно гибридизируются с широким рядом целевых РНК-последовательностей, не модифицируя при этом расщепленную целевую РНК. 3 с. и 8 з.п.ф-лы, 38 ил., 2 табл.

Изобретение относится к классу молекул синтетических РНК и их производных, а в частности, к рибозимам, обладающим высокоспецифической эндорибонуклеазной активностью.

Ряд встречающихся в природе РНК-молекул, например, таких как вироид "солнечной" пятнистости авокадо /ASBV/, содержащий РНК сателлит вируса кольцевой пятнистости табака /STOBRV/ и вирус проходящего стрика люцерны посевной /SLTSV/, подвержены самокаталиризуемому расщеплению. Очевидно, такое расщепление является основной и единственной частью жизненного цикла этих и других РНК.

Реакции самокатализируемого расщепления РНК требуют наличия двухвалентных ионов металлов и нейтрального или более высокого pH и приводят в результате к продуцированию РНК с концами, имеющими 5'-гидроксильную группу и 2', 3'-циклические фосфатные группы /Prody et al., Science 231: 1577-1580 /1986/ и Buzayan et al., Virology 151: 186-199 /1986//. Реакции расщепления катализируются самими РНК, что, вероятно, обусловлено конформцией мостиковых реакционноспособных групп, находящихся в непосредственной близости. Сайты самокатализируемого расщепления в природных РНК расположены в высоко консервированных областях РНК вторичной структуры /Buzayan et al., Proc. Natl. Acad. Soc. США 83:8859-8862 /1986/ and Forster, A.C. and Symous, R.H. Cell, 50:9-16 /1987//.

Эксперименты настоящего изобретения проводили на содержащем РНК вирусе-сателлите кольцевой пятнистости табака /STORV/, с помощью которого осуществляли построение новых эндорибонуклеаз /называемых в дальнейшем "рибозимами"/, т. е. ферментов, включающих в себя РНК, которые катализуют специфическое расщепление целевых молекул РНК.

Термин "рибозим", используемый в настоящем описании, относится к молекулам, целиком состоящим из РНК для ее производных.

Рибозимы настоящего изобретения отличаются от РНК-эндорибонуклеазы, которая встречается в природе в Tetrahymena Thermophila /известная как IVS или L-19IVS РНК/ и которая подробно описана в работах: Thomas Cech et al., (Zang, A. T. et al. , Science /1984/ 224:574-578; Zang, A.T. и Cech, T.R. Science /1986/ 231:470-475; Zang, A.T., et al., Nature /1986/ 324:429-433; Публикация международной заявки N 88/04300 University Patents Inс/. Эндорибонуклеаза, описанная Cech, имеет активный сайт длиной 8 п.о., который гибридизируется с целевой последовательностью РНК, после чего происходит расщепление целевой РНК, при условии присутствия свободного гуанозина или его производных. Фрагменты, образующиеся в результате расщепления, содержат концевые 5'-фосфатную и 3'-гидроксильную группы. Лимитированное число нуклеотидов, пригодных для осуществления гибридизации с РНК - субстратом, ограничивает эффективность или продуктивность эндорибонуклеазы, описанной Cech. Олигонуклеотиды, содержащие менее 12 нуклеотидов, плохо гибридизируются с целевыми последовательностями. Очевидно также, что некоторое число нуклеотидов в активном сайте Cech-эндорибонуклеазы может потребоваться для сохранения эффективной активности эндорибонуклеазы. Это ограничивает число возможных перестановок последовательностей активных сайтов, которые могли бы быть осуществлены для повышения эффективной гибридизации с целевыми последовательностями, что, в свою очередь, ограничивает число целевых последовательностей РНК, расщепляемых Cech-эндорибонуклеазой. Cech-эндорибонуклеаза также модифицирует РНК путем добавления свободного гуанозинового нуклеотида к 5' - концу расщепленной РНК.

Напротив, рибозимы настоящего изобретения эффективно гибридизируются с широким рядом целевых РНК-последовательностей, не модифицируя при этом расщепленную целевую РНК.

Рибозимы настоящего изобретения включают в себя гибридизирующую область, которая является комплементарной в нуклеотидной последовательности, по крайней мере, части целевой РНК, и каталитическую область, которая адаптирована к расщеплению целевой РНК. Гибридизирующая область содержит 9 или более нуклеотидов.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения рибозимы имеют область гибридизации, содержащую одну или более ветвей, образованных от однонитевой РНК и имеющую последовательность комплементарную, по крайней мере, части целевой РНК; причем указанные одна или несколько ветвей, ассоциированных с каталитической областью, обладают способностью к расщеплению указанной целевой РНК; а область гибридизации содержит одну ветвь из числа указанных ветвей РНК, которая состоит, по крайней мере, из 9 нуклеотидов, при этом указанная область гибридизации включает в себя 2 или более ветви РНК, а сумма нуклеотидов в указанных ветвях составляет более 9 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается получение рибозимы формулы 1: где X представляет собой любой рибонуклеотид и каждый из остатков X могут быть одинаковыми или различными; сумма n и n' превышает 6, и n и n' могут быть одинаковыми или различными; /*/ означает пару оснований между комплементарными рибонуклеотидами;.

X' и X'' представляют собой олигорибонуклеотиды комплементарной последовательности вдоль, по крайней мере, части их длины, так, чтобы основания между олигорибонуклеотидами спаривались; или X' и X'' вместе образуют одну последовательность РНК, причем, по крайней мере, часть указанной последовательности включает в себя стебель, образованный спариванием оснований между комплементарными нуклеотидами; и необязательно, в формуле /I/ после ^IA может быть введен дополнительный нуклеотид, выбранный из A, G, C или U.

Область /I/ формулы /1/ представляет собой плечи или фланкирующие последовательности рибозима, которые гибридизируются с соответствующими участками целевой последовательности РНК. Указанные плечи могут гибридизироваться вдоль полной длины целевой РНК или ее части. Каталитическая область РНК изображена в области /II/ формулы /1/. Указанная каталитическая область может содержать один или несколько дополнительных нуклеотидов, которые не оказывают неблагоприятного воздействия на каталитическую активность. Указанные добавки могут быть легко проверены на рибозимную активность способом, не требующим сложных экспериментов, который будет описан ниже. Каталитическая область может также составлять часть гибридизирующей области.

Олигорибонуклеотиды X' и X'' могут содержать до 5000 нуклеотидов или более.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается получение рибозимы формулы 2: где X представляет собой любой рибонуклеотид и каждый из остатков X могут быть одинаковыми или различными; /*/ означает пару оснований между комплементарными рибонуклеотидами; n и n' определены выше; m и m' имеют значение 1 или выше и могут быть одинаковыми или различными; "B" представляет собой связь, пару оснований, рибонуклеотид или олигорибонуклеотид, содержащий, по крайней мере, 2 рибонуклеотида; и необязательно, в формуле /2/ после ^IA может быть введен добавочный нуклеотид, выбранный из A, G, C или U.

Рибозимы настоящего изобретения могут быть получены способами, известными per se, использующимися для синтеза РНК-молекул. /Например, в соответствии с руководством, рекомендованным Promega, Madison, WI США/. В частности, рибозимы настоящего изобретения могут быть получены из соответствующей ДНК-последовательности /ДНК, которая при транскрипции дает рибозим и которая может быть синтезирована способами, обычно используемыми специалистами для синтеза ДНК/, активно связанной с промотором РНК-полимеразы, например промотором для РНК-полимеразы T7 или SP6. ДНК-последовательность, соответствующая рибозиму настоящего изобретения, может быть лигирована в вектор переноса ДНК, например плазмидную или фаговую ДНК. Когда вектор переноса содержит промотор РНК-полимеразы, активно связанный с ДНК, соответствующий рибозиму, то рибозим может быть продуцирован в процессе инкубации с РНК-полимеразой. Поэтому, рибозимы могут быть продуцированы in vitro путем инкубации РНК-полимеразы с промотором РНК-полимеразы, активно связанным с ДНК, соответствующей рибозиму, в присутствии рибонуклеотидов. In vivo прокариотические или эукариотические клетки /включая клетки млекопитающих и растений/ могут быть трансфецированы с соответствующим вектором внедрения, содержащим генетический материал, соответствующий рибозиму, который согласно настоящему изобретению является активно связанным с промотором РНК-полимеразы так, что указанный рибозим транскрибируется в хозяйской клетке. Векторы переноса могут быть бактериальными плазмидами или вирусными РНК или ДНК. Нуклеотидная последовательность, соответствующая рибозимам, находится, в основном, под контролем сильных промоторов, например, таких как lac, поздний промотор SV 40, ранний промотор SV 40, металлотионин, или - промоторы. Рибозимы могут быть транскрибированы непосредственно in vivo из вектора переноса или альтернативно они могут быть транскибированы как часть из большей РНК-молекулы. Например, ДНК, соответствующая рибозимным последовательностям, может быть лигирована в 3'-конец гена-носителя, например, после стоп-сигнала трансляции. Большие, молекулы РНК могут способствовать стабилизации рибозимных молекул против нуклеазного переваривания в клетках. При трансляции ген-носитель может способствовать образованию белка, присутствие которого можно непосредственно оценить с помощью ферментной реакции. Ген-носитепь может, например, кодировать фермент.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается получение вектора переноса ДНК, который содержит ДНК-последовательность, соответствующую рибозиму, активно связанному с промотором, в целях обеспечения транскрипции рибозима.

Один из предпочтительных способов продуцирования рибозима заключается в том, что посредством стандартных процедур получают два синтетических олигонуклеотида комплементарной последовательности и гибридизируют их, например, с помощью синтезатора ДНК Прикладной Биосистемы модели 380A /Applied Biosystems Inc. , Foster City, Калифорния 94404/. Один из олигонуклеотидов кодирует целевой рибозим. Соответствующие концы гибридизированных олигонуклеотидов соответствуют различным рестриктирующим сайтам, например Eco R1 на одном конце и Pst1 на другом конце. После расщепления подходящими рестриктазами /например, Eco R1 и Pst1/ фрагмент двухцепочечной ДНК может быть клонирован в вектор переноса. Если плазмидный вектор содержит промотор РНК-полимеразы, находящийся выше от ДНК-последовательности, соответствующей рибозиму настоящего изобретения, то РНК-транскрипты, соответствующие рибозиму, могут быть получены либо in vitro, либо in vivo. Если рибозим состоит из двух половин, которые содержатся вместе с помощью спаривания оснований между комплементарными нуклеотидами, то каждая половина рибозима может быть продуцирована в соответствии с указанными выше способами, после чего эти две половины инкубируют вместе с образованием указанного рибозима.

Предпочтительные рибозимы настоящего изобретения расщепляют целевую РНК, которая содержит последовательность X^oUY, где X^o является любым рибонуклеотидом, U означает урацил, а Y - аденин, цитозин или урацил. X^oU образует часть пары оснований, фланкирующих область, а Y не является спаренным основанием. Предпочтительно, но необязательно, если X^o = гуанидин, а X^oUY = GUC иди CUA. Любая молекула РНК, содержащая эти последовательности, может быть расщеплена рибозимами настоящего изобретения. После того, как последовательность РНК-транскрипта, содержащая последовательность X^oUY, будет определена, могут быть синтезированы плечи последовательности рибозима, которая является комплементарной /а значит и гибридизируемой/ РНК на целевой последовательности, фланкирующей последовательность X^oUY. При гибридизации плечей рибозима с целевой РНК-последовательностью, фланкирующей последовательность X^oUY, каталитическая область рибозима расщепляет целевую РНК внутри последовательности X^oUY. РНК-расщепление облегчается в присутствии магния или другого двухвалентного катиона при pH равном приблизительно 8,0.

В соответствии с этим, предпочтительные рибозимы настоящего изобретения могут быть сконструированы для расщепления любой РНК, последовательность которой является известной.

Высокая частота остатков, расщепляемых рибозимами в РНК /1:64 для GUC в РНК со случайной или равной частотой распределения оснований/ означает, что число потенциальных сайтов для расщепления рибозима может быть предсказано с достаточно высокой степенью надежности в любой данной целевой РНК.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается способ инактивации целевой РНК-последовательности, заключающийся в том, что указанную целевую РНК-последовательность подвергают взаимодействию с рибозимом настоящего изобретения.

Вектор переноса, такой как бактериальная плазмида или вирусная РНК или ДНК, кодирующие один или несколько рибозимов, может быть трансфецирован in vivo, т. е. в клетку или клетки организма /например, Leewellyn et al., F. Mol. Biol. /1987/ 195: 115-123; Hanahan et al., T. Mol. Biol./1983/166/. Попадая в клетку, вектор переноса может реплицироваться и быть транскрибирован клеточными полимеразами с образованием рибозимных РНК, которые затем инактивируют нужную целевую РНК. Альтернативно вектор переноса, содержащий одну или несколько последовательностей рибозима, может быть трансфецирован в клетки или внедрен в клетки при помощи техники микроманипулирования, такой как микроинъекция, так, чтобы вектор переноса или его часть интегрировалась в геном хозяйской клетки. Транскрипция интегрированного генетического материала приводит к продуцированию рибозимов, которые инактивируют целевую РНК.

Рибозимы настоящего изобретения имеют широкое терапевтическое и биологическое применение. Например, вирусы, вызывающие заболевания человека и животных, могут быть инактивированы путем введения в объект, инфецированный вирусом, рибозима настоящего изобретения, который является адаптированным для гибридизации и расщепления РНК-транскриптов вируса. Указанные рибозимы могут быть введены парентеральным путем или другими способами введения. Альтернативно в объект инфецированный вирусом, вызывающим заболевания, может быть введен невирулентный вирус /такой как вакцина, или аденовирус/, который может быть генетически сконструирован так, чтобы он содержал ДНК, соответствующую рибозиму, активно связанному с РНК-промотором, в результате чего рибозим транскрибируется в клетках животного-хозяина, трансфецированного сконструированным вирусом, и осуществляет расщепление и/или инактивацию транскрипта целевой РНК вируса, вызвавшего заболевание. В частности, рибозимы настоящего изобретения могут быть использованы для лечения заболеваний, вызванных такими вирусами, как вирус простого герпеса /ВГП/ или вирус СПИД'а /ВИЧ/.

Рибозимы настоящего изобретения могут быть использованы также для инактивации РНК-транскриптов в бактериях или других прокариотических клетках, в растениях и животных. В бактериях РНК-транскрипты, например бактериофага, вызывающего гибель бактериальных клеток, могут быть инактивированы путем трансфецирования клетки вектором переноса ДНК, обладающего способностью продуцировать рибозим настоящего изобретения, который инактивирует фаговую ДНК. Альтернативно рибозим сам по себе может быть введен в бактериальную клетку для осуществления расщепления фаговой ДНК.

РНК-транскрипты в растениях могут быть инактивированы с помощью рибозимов, кодированных вектором переноса, таким как Ti-плазмида, происходящая от Agrobacterium tumefaciens. Когда такие векторы трансфецируются в растительную клетку, то под действием РНК-полимеразы продуцируются рибозимы, которые осуществляют расщепление конкретной последовательности целевой РНК. В соответствии с этим растительные вирусы, РНК которых являются известными, или РНК-транскрипты растительных генов могут быть инактивированы с помощью указанных рибозимов.

Транскрипты чужеродного гена в растениях, животных или клетках другого типа могут быть инактивированы с помощью рибозимов настоящего изобретения. В результате чего могут быть модулированы нежелательные фенотипы или признаки. Можно, например, с помощью рибозимов удалять косточки из фруктов или лечить наследственные заболевания у человека, вызываемые продуцированием вредного белка или чрезмерным продуцированием какого-либо конкретного белка.

Настоящее изобретение иллюстрируется примерами и сопровождающими их чертежами, причем ни те, ни другие не ограничивают возможных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 1 изображены сайты саморасщепления РНК дикого типа и мутированных РНК; а также профили электрофореза продуктов самокаталитического расщепления РНК.

/а/ показаны сохраненные структуры, ассоциированные с встречающимися в природе сайтами расщепления в ASBV транскриптах ДНК сателлита тритона и РНК-содержащего сателлита STOBRV, LTSV, вируса табачной мозаики, вируса мозаики паслена черного /solanum nodiflorum/ и вируса мозаики подземного клевера. На фиг. показана нуклеотидная последовательность между этими структурами, тогда как другие обозначены X. Спаривание оснований обозначено //, а сайты расщепления РНК указаны стрелкой.

/b/ показана сохраненная нуклеотидная последовательность, ассоциированная с расщеплением /+/ - нити РНК STOBRV. Сайт расщепления указан стрелкой.

/c/ показан in vitro - мутант STOBRV, содержащий вставку восьми нуклеотидов /обведено рамкой/ вместе с фланкирующей дупликацией трех нуклеотидов /UGU остатки 7-9/.

/d/ показаны субклонированные Hal III - фрагменты STOBRV дикого типа и in vitro - мутант D-51, каждый из которых транскрибированы в обеих /+/ и /-/ ориентациях, а также радиоактивно меченные транскрипты, фракционированные путем электрофореза в полиакриламидном геле. Положения нерасщепленных транскриптов оснований 159 и 170 от последовательностей дикого типа /WT/ и мутанта D-51 показаны стрелкой; На фиг. 2 показана нуклеотидная последовательность рибозима и продуктов расщепления рибозима, выделенных с помощью гель-электрофореза.

/а/ Показаны нуклеотиды, инсертированные в D-51-мутант и содержащие сайт рестриктирующей эндонуклеазы Bam H1. Bam H1 использовался для расщепления мутантной ДНК, а две последовательности были субклонированы и транскрибированы отдельно in vitro. РНК-транскрипты показаны схематически с потенциальным спариванием оснований между указанными // РНК. Фрагменты, содержащие указанный стрелкой сайт для расщепления, обозначены S-РНК; а фрагмент, содержащий рибозим, обозначен Rz-РНК.

/b/ [³²P] -R_z-PHK /101 основание/ инкубировали отдельно /дорожка 1/ и с не-меченной S-РНК /дорожка 2/. [³²P]-S-РНК инкубировали отдельно /дорожка 3/ и с немеченными, и с [³²P]-мечеными R_z-PHK /дорожки 4 и 5 соответственно/.

На фиг. 3 изображена схематическая модель рибозима в соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения. Область A представляет собой последовательность расщепления в целевой РНК. Область B представляет собой каталитическую область, а область C представляет собой плечи рибозима.

На фиг. 4 показано построение рибозимов, направленных против транскрипта гена CAT /хлорамфеникол-ацетилтрансфераза/. Рибозимы, обозначенные R_zCAT-1, R_zCAT-2 и R_zCAT-3, направлены против трех сайтов, находящихся в in vitro - транскрипте из 835 оснований гена CAT. Относительные расположения сайтов расщепления на транскрипте схематически показаны вместе с фланкирующими пронумерованными основаниями /а/. Показаны также //b/ - /d// три последовательности рибозима с их целевыми последовательностями. Аминокислотные последовательности CAT-гена пронумерованы, а предсказанные сайты для РНК-расщепления обозначены стрелками. R_zCAT-1 и R_zCAT-3 содержат последовательности с 24 основаниями, происходящие от /+/ нити STOBRV /область B, фиг. 3/, a R_zCAT-2 содержит одну U-A-замену в этой области.

На фиг. 5 показаны результаты CAT-расщепления РНК рибозимами R_zCAT-1 - R_zCAT-3.

/а/ [³²P] -CAT-РНК подвергали гель-фракционированию после инкубации как отдельно /-/, так и с одним из трех рибозимов R_zCAT-1 - R_zCAT-3 /дорожки 1, 2 и 3 соответственно/. Локализация полного транскрипта показана стрелкой.

/b/ Показан анализ 5'-терминальных оснований. 3'-фрагменты, продуцированные путем расщепления рибозимом CAT-РНК, были обработаны [5'-³²P]-киназой, подвергнуты гель-очистке, переварены полной нуклеазой, а выделенные терминальные остатки фракционировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. 5'-концевыми нуклеотидами, определенными по маркерам /дорожка M/, являлись A, U и G для фрагментов, продуцированных с помощью R_z-CAT-1 - R_zCAT-3 /дорожки 1, 2 и 3 соответственно/.

На фиг. 6 изображен временной цикл каталитической активности рибозима /R_zCAT-1/ против CAT-РНК. Было вычислено количество продукта расщепления /139 нуклеотидов/ и построена диаграмма. На вставке показано аккумулирование фрагмента в 139 оснований со временем после электрофореза в полиакриламидном геле.

На фиг. 7 показаны относительные скорости расщепления CAT-РНК в зависимости от различных температурных условий. Субстратная РНК представлена сплошной линией. В каждом случае продукт расщепления показан прерывистой линией.

На фиг. 8 показаны три рибозима /соответствующие R_zCAT-2/, имеющие плечи или фланкирующие последовательности различной длины.

На фиг. 9 изображена схема продуцирования рибозима, включающего антисмысловую РНК, содержащую каждую из областей расщепления R_zCAT-1 - R_zCAT-3.

На фиг. 10 показана гибридизация рибозимов с последовательностями, содержащими GUA /10a/ и GUU /10b/ в матричной CAT-РНК.

На фиг. 11 показаны для самокаталитического расщепления РНК вироида экзокортиса цитрусовых /CEV/ и ее комплемента.

На фиг. 12 показаны рибозим R_zCEV 25x/+/, гибридизированный с целевой CEV-РНК/а/, и профиль гель-электрофореза CEV-РНК и комплементарной /-/ CEV-РНК, инкубированных с R_zCEV25x/+/ /b, дорожки 1 и 2 соответственно. Продукт расщепления обозначен стрелкой/.

На фиг. 13 показаны рибозим R_zCAT-2, гибридизированный с его последовательностью-мишенью /а/ и рибозим R_zSCMoV /b/. Каталитическая область каждого домена заключена в рамку. Показаны также отличия /обведены/ каталитической области R_zSCMoV по сравнению с R_zCAT-2.

На фиг. 14 показан рибозим R_zCEV-2, гибридизированный с его последовательностью-мишенью РНК вироида экзокортиса цитрусовых /CEV/. Сайт расщепления соответствует нуклеотиду 336 в РНК-последовательности CEV. Альтерация в нуклеотидной последовательности в ее каталитической области по сравнению с каталитической областью STOBRV обведена кружком /а/. На фиг. 14 /b/ показан профиль электрофореза контрольной РНК [ /-/ нить CEV], /дорожка 7/ и РНК /+/ нити CEV /дорожка 8/, после инкубации с R_zCEV2.

На фиг. 15 показан рибозим R_zCAT-2 /а/ в сравнении с рибозимом R_zCAT-2B /b/. Каталитические области обведены в рамку. Изменения в каталитической области R_zCAT-2B в сравнении с R_zCAT-2 также обведены в рамку; На фиг. 16 изображена карта плазмиды pT35SN; На фиг. 17 изображен график, представляющий собой активность /среднюю по 4 экспериментам/ при ингибировании CAT-экспрессии в растениях /протопласты табака/.

Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие осуществление настоящего изобретения, но не ограничивающие его возможных вариантов.

Реакции и манипуляции с ДНК, такие как лигирование, переваривание рестриктирующими ферментами, бактериальная трансформация, ДНК-секвенирование и т.п., выполнялись в соответствии со стандартной техникой, такой как, например, описана Maniatis et al., /Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, 1982/. Манипуляции в РНК также осуществлялись стандартными способами, такими как описаны, например, Uhlenbeck/Nature 328, 596-600 /1987/ и Haseloff and Gerlach (Nature 334, 585-591 /1988/).

Пример 1. Самокатализируемое расщепление мутированной РНК STOBRV Консенсус областей, ассоциированных с сайтами расщепления природных РНК в ASBV, транскриптах ДНК сателлита тритона, и РНК сателлита STOBRV, LSTV, вируса табачной мозаики /VMoV/, вируса мозаики паслена черного /SNMV/ и вируса мозаики клевера подземного показан на фиг. 1a. На фиг. показаны сохраненные между этими структурами нуклеотидные последовательности, а несохраненные последовательности обозначены X. Добавочные U находятся после остатка ^IA в /+/ нити LTSV.

Области, связанные с самокаталитическим расщеплением /+/ нити STOBRV, исследовались на активность ферментного субстрата в этой области. Сначала клонированные кДНК STOBRV подвергали мутагенезу путем инсерции олигонуклеотидного линкера /Bam H1/ в соответствии с руководством по применению этого способа.

Конструирование вектора для экспрессии STOBRV in vitro: 160 п.о. TaqI - SpeI - фрагмент кДНК STOBRV выделяли из PSP653 /Gerlach et al., 1985, Virology 151: 172-185 и лигировали с AccI-SpeI - разрезанной и обработанной фосфатазой pGEM 4 для образования сайта Acc I. Полученный в результате клон лианезировали Acc I, обрабатывали фосфатазой и вводили 359 по. TagI-фрагмента кДНК STOBRV. Полученные в результате клоны скринировали на присутствие циркулярно пермутированных 520 п.о. последовательности кДНК STOBRV, содержащей 277-81 терминально избыточных остатков /pTTS/. Последовательность STOBRV фланкирована промоторами для РНК-полимераз T7 и SP6, а в результате in vitro - транскрипции получали РНК с /+/ или /-/ ориентацией, которые содержали два сайта для саморасщепления.

Мутагенез in vitro.

Плазмиду pTTS /50 мкг/ линеаризовали BamH1, обрабатывали SI-нуклеазой и снова лигировали для удаления уникального сайта BamH1. Полученную конструкцию, pTTS-B, обрабатывали с помощью 2 10^-4 ед. ДНазы I в 29 мМ Трис-HCl /pH 7,0/, 15 мМ MgCl₂ в течение 10 мин при 37^oC. Полученные линейные ДНК подгоняли, и/или обрабатывали ДНК-полимеразой T4 для наполнения концов, и очищали при помощи электрофореза на агарозном геле 0,7% LGT и при помощи экстракции. Обработанную киназой BamH1-линкерную последовательность /CGGATCGG/ лигировали с линеаризованной плазмидой в течение ночи при комнатной температуре в присутствии 5% полиэтиленгликоля. После чего реакции подвергали перевариванию BamH1, а линейные плазмидные ДНК снова очищали с помощью электрофореза на агарозном геле 0,7% LGT /это было необходимо для удаления последних остатков кольцевой плазмиды вместе с нелигированными линкерами/. Плазмиды снова замыкали при помощи ДНК-лигазы T4 и трансформировали в E. coli ДН-1. Колонии /более 1000/ соскребали с агаровых чашек, культивировали в жидкой среде до насыщения и приготавливали смешанные популяции плазмидных ДНК. Смешанные вставки ДНК STOBRV вырезали путем переваривания рестриктазой у фланкирующих EcoR1 и Pst1 - сайтов, очищали с помощью электрофореза на агарозном геле 1% СТ и субклонировали в EcoR1-Pst1 - разрезанной и обработанной фосфотазой pGEM 4. Полученные в результате трансформанты снова собирали, культивировали в жидкой среде и получали плазмидную ДНК. Плазмидные ДНК обрабатывали BamH1 для расщепления только тех плазмид, которые содержат BamH1 - линкерную последовательность, а затем линейные формы снова очищали посредством двух циклов электрофореза на агарозном геле 0,7% LGT, снова замыкали ДНК-лигазой T4 и трансформировали в E.coli ДН-1. Отдельные трансформанты скринировали на приблизительную локализацию инсертированного BamH1 - линкера в последовательности STOBRV путем переваривания рестриктирующим ферментом, субклонировали в M13 mp19 и секвенировали с помощью стандартного способа дидезокси-терминации.

В результате получали библиотеку STOBRV мутантов. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что каждый мутант содержал инсертированную BamH1-линкерную последовательность /CGGATCGG/ вместе с фланкирующими дуплицированными или делетированными последовательностями STOBRV. Мутанты были транскрибированы in vitro, а РНК исследовали на их способность к расщеплению. В результате этих экспериментов 52-нуклеотидную последовательность идентифицировали как содержащую субстрат и участки расщепления РНК STOBRV. Эта 52-нуклеотидная последовательность, изображенная на фиг. 1b, содержит область сохраненной последовательности, необходимой для саморасщепления других РНК /фиг. 1а/. Один мутант, обозначенный D-51, содержал 8-нуклеотидную BamH1-линкерную последовательность, инсертированную между тремя дуплицированными нуклеотидами STOBRV, обозначенными 7-9. РНК этого мутанта подвергалась самокаталитическому расщеплению.

97 и 108 п.о. Hal III - фрагменты, содержащие 52-нуклеотидную последовательность расщепления дикого типа и D-51-РНК /как показано на фиг. 1b и 1c/, удаляли из секвенированных плазмидных клонов. Фрагменты лигировали в Sma1 - сайт pGEM 4 и скринировали для определения обеих ориентаций вставок. Плазмиды были линеаризованы с использованием EcoRI, а РНК с /+/ и /-/ нитями длиной 159 и 170 оснований были транскрибированы с использованием 200 ед/мл РНК-полимеразы T7 в 50 мМ Трис-HCI, pH 7,5, 10 мМ NaCl, 6 мМ MgCl₂, 2 мМ спермидина, 1000 ед/мл араназина, 500 мкМ ATP, CTP и GTP с 200 мкМ O³²PTP. РНК фракционировали с помощью электрофореза в 10% полиакриламиде, 7-молярной мочевине, 25% формамидном геле и осуществляли авторадиографию.

Как показано на фиг. 1d, расцепления транскриптов /-/ нити РНК не наблюдалось. Это было ожидаемым результатом, поскольку /-/ нить не содержала самокаталитического сайта расщепления. Что касается /+/ нитей последовательностей как дикого типа, так и D-51, то в данном случае расщепление имело место; причем расщепление D-51-PHK было несколько менее эффективно, чем РНК дикого типа /фиг. 1d/. Этот эксперимент показал, что область однонитевой петли с правой стороны от 52-нуклеотидной последовательности, участвующей в самокаталитическом расщеплении РНК, не играет главной роли.

Разделение ферментной и субстратной активностей: Используя сайт рестриктирующей эндонуклеазы BamH1, введенный в D-51, были получены фланкирующие Hal III - BamH1 и BamH1 - Hal III-фрагменты и каждый из них был субклонирован в E. coli - плазмиде, подходящей для транскрипции in vitro. Это приводит к элиминации мутированной однонитевой петли из области саморасщепления и расщеплению области на два РНК-фрагмента /фиг. 2а/. Меньший Hal III - BamH1-фрагмент содержал нуклеотиды 321-9, включая фактический сайт расщепления, и был обозначен как S-фрагмент. BamH1 - Hal III - фрагмент, содержащий STOBRV - нуклеотиды 7-48, был назван рибозимом или R_z-фрагментом. E.coli - плазмидами, использованными для in vitro транскрипции, были pGEM3 и pGEM4 /Promega, Madison, WI, США/.

Указанные плазмиды экспрессии содержали: а/ начало репликации; b/ ген избирательной лекарственной устойчивости /Amp^r/; c/ многократно клонирующий сайт, фланкированный промоторами РНК-полимеразы, который может быть использован для продуцирования транскриптов in vitro.

Фрагменты R_z-pGEM3 и S-pGEM4, обработанные ДНК-полимеразой T7, и переваренные KpnI и XbaI, были транскибированы с помощью РНК-полимеразы при тех же условиях, что были описаны выше.

Как показано на фиг. 2, S-РНК и R_z-РНК не обнаружили значительной деградации при их отдельной инкубации /фиг. 2b/, дорожки 1 и 3/ в условиях, которые способствовали высокоэффективному саморасщеплению /50^oC, 20 мМ MgCl₂, pH 8,0/. Очевидно, что меченая R_z-РНК также осталась неизменной после инкубации с S-РНК /фиг. 2b, дорожки 2 и 5/. Однако при смешивании S-PHK с R_z-РНК имело место эффективное расщепление S-РНК /фиг. 2b, дорожки 4 и 5/, с образованием двух фрагментов. Размеры продуктов при расщеплении S-РНК /84 оснований/ у нормального сайта между нуклеотидами N 359 и N 1 с образованием фрагментов, расположенных у 5'-конца и 3'-конца, составляли 67 и 17 нуклеотидов соответственно. Это означает, что S-РНК действует как субстрат для рибонуклеолитического расщепления посредством R_z-РНК, которая выполняет каталитическую роль.

Модель рибозима, основанная на каталитической области РНК STOBRV, показана на фиг. 3. Этот рибозим имеет два плеча или фланкирующие последовательности однонитевой РНК /показанной в С/, гибридизирующиеся с комплементарными последовательностями на субстратной РНК, т.е. расщепляемой РНК. Каждая фланкирующая последовательность, показанная в С, содержит 8 рибонуклеотидов. Число нуклеотидов, содержащихся в области С, не является критическим. Однако это число должно быть достаточным для осуществления гибридизации рибозима с РНК-мишенью. Очевидно, что для осуществления указанной гибридизации в области С должно присутствовать как минимум 4 нуклеотида.

Каталитическая область В содержит последовательности, которые являются в высокой степени сохранившимися в областях расщепления природного происхождения /см. фиг. 1a/. По сравнению с областями расщепления известных последовательностей длина стебля II не имеет особого значения, как и присутствие ассоциированной петли у одного его конца.

Сайт расщепления в целевой РНК обозначен у A /фиг. 3/ как GUC. Исходя из экспериментов настоящего изобретения /не показано/ и других экспериментов Koizumi /FEBS LETT 288; 228-230 /1988/; и FEBS LETT 239; 285-288 /1988/, очевидно, что при сайтах в РНК природного происхождения последовательности GUA, GUC, CUC, AUC и UUC также действуют как сайты раскрепления внутри РНК.

Пример 2. Описание построения, синтеза и активности рибозимов, имеющих новую и высокоспецифическую эндорибонуклеазной активностью В качестве иллюстрации настоящего изобретения были сконструированы три рибозима, направленные против транскрипта обычно используемого индикаторного гена, происходящего из бактерии, хлорамфенилколацетилтрансферазы Tn 9/CAT, которая сообщает устойчивость к антибиотику в бактериях, растениях и животных и которая легко поддается анализу. Эти рибозимы, обозначенные R_zCAT-1 - R_zCAT-3, соответствуют потенциальным сайтам расщепления GUC в CAT-РНК в положениях 139-140, 494-495 и 662-663 соответственно. Последовательности этих рибозимов изображены на фиг.4. В каждом случае, фланкирующие последовательности рибозима, которые гибридизируются с целевой CAT-РНК, имели длину в 8 нуклеотидов. Каталитические области выбирали в соответствии с областями РНК STOBRV, показанной на фиг. 3.

CAT-ген был получен из pGM4 и был субклонирован в качестве BamH1-фрагмента в pGEM-32 из Promega, Maclison, N 1. Эта плазмида была линеаризована Hind III и CAT-генные транскрипты были получены с использованием РНК-полимеразы T7 с 220 маМ [-³²P] UTP. Последовательности рибозимов синтезировали в качестве олигонуклеотидов, R_zCAT-1, 2 и 3 соответственно. Они были обработаны киназой, затем их лигировали с фосфотазной обработкой, pGEM4 разрезали EcoRI-Pst1 и инкубировали с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1, а затем трансформировали в бактерии. EcoRI-линеаризованную плазмиду транскрибировали с помощью РНК-полимеразы T7, в результате чего получали рибозимные РНК. Рибозимы инкубировали с CAT-транскриптом в 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 20 мМ MgCl₂ при 50^oC в течение 60 минут, и полученные продукты фракционировали с помощью электрофореза на 5% полиакриламиде, 7М мочевины, 25% формамидном геле, а затем проводили авторадиографию.

При инкубировании 840-