Способ получения композита окисленного глутатиона с cis- диаминодихлорплатиной и фармацевтических композиций на его основе, регулирующих метаболизм, пролиферацию, дифференцировку и механизмы апоптоза нормальных и трансформированных клеток

Способ получения композита окисленного глутатиона с cis- диаминодихлорплатиной и фармацевтических композиций на его основе, регулирующих метаболизм, пролиферацию, дифференцировку и механизмы апоптоза нормальных и трансформированных клеток

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, а именно к способам получения лекарственных средств на основе активных метаболитов пептидной природы. Способ получения биологически активного соединения - композита, состоящего из динатриевой соли окисленного глутатиона с сis-диаминодихлорплатиной (GSSGPt), проводят в одну стадию окисления восстановленной формы глутатиона, где добавка сis-диаминодихлорплатины выступает как катализатор реакции окисления. Технический результат: Способ позволяет регулировать условия реакции, используя при этом меньшее эквивалента количество перекиси водорода, исключив образование продуктов переокисления и сделав количественным выход целевого продукта. Композит и его химические модификации характеризуются стабилизированной дисульфидной связью при введении его в биологические среды, что увеличивает время полужизни препарата в биологических средах. Созданы фармацевтические композиции, полученные на основе композита, его химических модификаций, продемонстрированы применение этих композиций для изготовления лекарственных средств и способ их использования. 7 с. и 21 з.п. ф-лы, 14 ил., 37 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, а именно к способам получения лекарственных средств на основе активных метаболитов пептидной природы, которые могут быть использованы в клинической практике для профилактики и лечения различных патологических синдромов и заболеваний посредством дифференцированного воздействия на процессы метаболизма, пролиферации, дифференцировки и апоптоза нормальных и трансформированных клеток.

Современная фармакоиндустрия невольно способствует геосоциальному масштабированию двух медико-биологических проблем: формированию резистентности (привыкания и падения фармакологической эффективности) к лекарственным препаратам, в том числе вследствие активации системы MDR-генов; формированию резорбтивных нежелательных эффектов, проявляющихся, в первую очередь, повреждением системы иммунокомпетентных клеток и гемопоэза: кардио-, гепато-, нефро- и нейротоксичностью.

Основная причина этих негативных явлений - широчайшее применение собственно химиотерапевтических средств, весьма эффективных по своим физико-химическим механизмам, но чужеродных для организма по своей природе. Даже генно-инженерные препараты, несмотря на использование генов (ДНК) человека, в качестве матрицы для тиражирования используют одноклеточные организмы (кишечная палочка, дрожжевые клетки), которые вносят свой, следовательно, чужеродный вклад в нарабатываемые таким образом лекарственные препараты.

Поэтому теоретическая и практическая медицина все чаще и настойчивее обращает свой взор в сторону естественных ключевых метаболитов, то есть клеточных факторов (низкомолекулярных биохимических субстанций), самой природой предназначенных для запуска цепных реакций эндогенной наработки, модификации ряда биологически активных продуктов, следовательно физиологически важных и физиологически адекватных процессов. В ряде случаев подобные биохимические субстанции выступают в роли "биохимических гироскопов", предназначенных для восстановления нарушенного равновесия основополагающих метаболических процессов, например, анаболизма и катаболизма; или пролиферации и дифференцировки. Нарушения данных основополагающих механизмов жизнедеятельности формируют процессы гибели клеток (синдром цитолиза) или превращения их в злокачественные, то есть опухолевые клетки. Ключевые регуляторные метаболиты, своего рода "клеточные гормоны", как правило, являются факторами пептидной природы (обычно не более 3-20 аминокислот). Отсюда, получение синтетических аналогов данных метаболитов (биохимических субстанций), следовательно, препаратов с заранее заданными свойствами является актуальной проблемой, поскольку данные препараты выступают в качестве оптимальных инструментов метаболической терапии и практически не являются чужеродными.

Пептидными структурами, к которым обращаются достаточно активно, являются серосодержащие пептиды и их производные, в первую очередь - это группа тиолов. В частности, известен трипептид восстановленного глутатиона ( - глутамил-цистеинил-глицин; далее - GSH), биологические эффекты которого исследуются широчайшим образом.

Известен димер трипептида глутатиона - глутатион окисленный (бис-( -L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин) - далее GSSG, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками.

Известно, что использование экзогенного синтетического аналога GSSG в опытах in vitro индуцирует синтез цитокинов и гемопоэтических факторов; а в условиях циклофосфановой и радиационной модели иммунодепрессии (опыты in vivo) обеспечивает нормализацию цитокинового профиля, наряду с восстановлением систем иммунитета и кроветворения (международная заявка WO 97/21444).

В свою очередь, лекарственные формы экзогенного GSSG, применяемые при тяжелых иммунодефицитных состояниях и угнетенном костномозговом кроветворении (клинические примеры, приводимые в международной заявке, по больным СПИД; больным с онкопатологией, апластической анемией, и другие) в течение различных сроков применения обеспечивало терапевтический эффект, восстанавливая иммунный статус организма (в том числе показатели противоопухолевого иммунитета); функциональную активность иммуногенеза и кроветворения.

При этом подчеркивается, что названными эффектами обладает именно и только окисленный глутатион (GSSG), то есть пептид с дисульфидной связью.

В международной заявке [1] красной нитью проходит положение о том, что предшествующий уровень техники в области применения биологически-активных веществ тиолового ряда был направлен на обеспечение повышенного уровня восстановленного глутатиона (GSH), т.е. на достижение антиоксидантных эффектов, в то время как в названном выше изобретении заявлялась биолого-медицинская целесообразность безусловно отличающегося фармакологического воздействия, а именно, достижения прооксидантных эффектов и формирования нового уровня редокс-контура в клетках посредством введения в организм GSSG, обладающего прооксидантным потенциалом. Согласно точке зрения авторов, только в этом случае запускаются механизмы индукции редокс-чувствительной экспрессии иммунологически значимых генов, активации метаболизма тиолов в клетках, следовательно, обеспечиваются благоприятные фармакологические свойства, в том числе системные цитопротекторные эффекты и регуляция состояния системы иммунитета в зависимости от ее исходного статуса: или это иммунодефицит, то есть гипореактивность; или это иммуноаутоагрессия, то есть гиперреактивность.

С учетом сказанного о расшифрованных авторами в международной заявке [1] биолого-фармакологических эффектах окисленной формы глутатиона (GSSG), ассоциированных с определенной фармакокинетикой экзогенного аналога GSSG в биологических средах, изобретательский замысел заявки направлен на достижение группы технических и фармацевтически приемлемых решений, которые будут эффективны для предотвращения восстановления GSSG в GSH и, тем самым, пролонгирования существования GSSG в окисленной форме в биологических средах. Достижение биолого-фармакологических эффектов окисленной формы глутатиона подтверждается результатами биомедицинских исследований, полученных в ходе комплексной и широкомасштабной программы доклинических и клинических исследований по изучению эффективности синтетических аналогов GSSG. В этой связи часть пунктов формулы заявки [1] утверждает концептуальную модель создания фармацевтических средств в различных лекарственных формах, содержащих в качестве действующего вещества производные окисленного глутатиона (GSSG) в виде: его солей; или использование композитных препаратов, включая комбинации GSSG с веществами, пролонгирующими или усиливающими действие GSSG или его солей; или производных в качестве новых композиций, то есть формул новых соединений, когда последние получают посредством создания ковалентной связи. При этом впервые было показано, что фармацевтически приемлемые производные GSSG в форме его солей; или комбинации с пролонгаторами пребывания GSSG в окисленной форме; или комбинации GSSG с усилителями/модуляторами, то есть все те технические решения, которые в той или иной степени стабилизируют молекулу GSSG в дисульфидной форме, - значительно эффективнее и целенаправленнее индуцируют продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов в нормальных, но, в большей степени и целесообразнее, в патологических условиях.

Более того, лекарственные формы производных GSSG, характеризующиеся большей степенью стабильности молекулы GSSG в дисульфидной форме, обладали новой фармакокинетикой в биологических средах и проявляли способность: а) индуцировать продукцию более широкой палитры цитокинов и гемопоэтических факторов, что определяло наличие в большей степени модулирующих, а не только стимулирующих эффектов; б) воспроизведения эффектов некоторых цитокинов, например IL-2.

Следует подчеркнуть, что авторами впервые установлены [2] уникальные свойства природного окисленного глутатиона (GSSG) стимулировать/модулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических (в том числе колониестимулирующих, то есть ростовых) факторов. При этом стабилизация указанными фармацевтическими решениями времени пребывания в биологических средах экзогенно введенного GSSG в окисленной форме усиливала эти эффекты. В свою очередь, сегодня общеизвестны события, которые развиваются в клетках (тканях и, следовательно, в органах) после взаимодействия с цитокинами. Они обусловлены универсальным влиянием цитокинов на основные сигнал-передающие системы и через них на геном клеток, что определяет регулирующие эффекты цитокинов на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз.

Сказанное определяет существование научной проблемы, заключающейся в создании новых фармацевтически приемлемых соединений с заранее заданными свойствами на основе GSSG со стабилизированной дисульфидной связью.

Известны способы получения димера трипептида глутатиона, то есть окисленного глутатиона - GSSG, из его предшественника, восстановленного глутатиона (GSH).

В настоящее время существуют три основных метода окисления восстановленной формы глутатиона. Во-первых, известно, что реакция окисления достаточно лабильных мepкaпто-SH-групп цистеина в молекуле глутатиона [3] окисляется уже такими мягкими окислителями как кислород воздуха [4, 5]. Однако скорость реакции в данном случае низкая и для количественного выхода требуется очень продолжительное время (многие сутки). Катализ ионами тяжелых металлов, и особенно токсичной меди, создает существенные трудности для получения чистого фармацевтического препарата.

Вторым изученным методом считается использование более мощных окислителей, например, таких как перекись водорода, йод, ферроцианид калия и др. [6, 7] . Реакции в этих случаях проходят значительно быстрее (от десятков минут до нескольких часов), однако их общим существенным недостатком является трудно контролируемые реакционные условия, что приводит к значительному загрязнению целевого вещества продуктами окисления, то есть производными соответствующих кислот. Это вызывает необходимость подключения дополнительных, иногда достаточно трудоемких, средств очистки, что резко удорожает процесс.

К третьей группе методов следует отнести использование в качестве окислителей газообразных веществ (окислы азота), сульфоксидов и других соединений, среди которых можно найти достаточно редкие и абсолютно неприемлемые для масштабирования [8, 9].

Все эти методы не дают повышения выхода целевого продукта по сравнению с ранее изложенными, в то же время их применение сопровождается дополнительными трудностями как с точки зрения технологии и безопасности, как в случае с окислами азота, или с труднодоступностью реагентов и их высокой себестоимостью.

Наиболее близким способом по технической сущности к заявляемому способу является способ получения окисленного глутатиона из восстановленного с использованием перекиси водорода как окислителя [6].

Процесс проводится в водном растворе рН около 8,0-8,5 с использованием эквивалента перекиси водорода при комнатной температуре. Время прохождения реакции около 1 часа, выход целевого продукта - 90%. Основными примесями (до 10%) являются продукты окисления, очистка от которых возможна только при использовании дорогостоящего метода препаративной ВЭЖХ, и поэтому может резко увеличить себестоимость препарата.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание способа получения окисленного глутатиона со стабилизированной дисульфидной связью в процессе синтеза целевого продукта, что обеспечивается способом получения композита общей формулы: бис- ( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин динатриевая соль с cis-диаминодихлорплатиной в молярном соотношении 1000:1.

Согласно изобретению, композит характеризуется стабилизированной дисульфидной связью при введении его в биологические среды, а следовательно, большей продолжительностью времени полужизни препарата в биологических средах именно в форме дисульфида.

Общая процедура заявляемого способа получения композита заключается в использовании для реакции окисления восстановленного глутатиона в качестве окислителя перекиси водорода в комбинации с cis-диаминодихлорплатиной, выступающей в роли катализатора. При этом возможно использование меньшего количества перекиси водорода (0,9 эквивалента), что приводит к ликвидации продуктов переокисления в сочетании с очень высоким выходом целевого продукта (более 98% по данным ВЭЖХ). Таким образом целевой продукт получается сразу же с высокой степенью чистоты и не требует дополнительной очистки.

Следует отметить, что простое смешение готового окисленного глутатиона, полученного любым из изложенных выше способов, с комплексным соединением платины в указанной пропорции дает значительно меньший технологический и экономический эффект. В этом случае требуются дополнительные затраты на приобретение готового окисленного препарата (стоимость которого в 2-3 раза превышает стоимость восстановленной формы глутатиона) или самостоятельное проведение синтеза окисленной формы, выделение средств на дорогостоящую очистку полученного препарата, то есть получение композита в две стадии.

Заявляется способ получения нового биологически активного соединения - композита общей формулы: бис-( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин динатриевая соль с cis-диаминодихлорплатиной (далее - GSSGPt).

Структурная формула - приведена на фиг. 1.

Брутто-формула: C₂₀H₃₀N₆O₁₂Na₂S₂ [Pt(NH₃)₂Cl₂] Молекулярный вес: 656,59 на C₂₀H₃₀N₆O₁₂Na₂S₂ с содержанием Pt 0,022-0,042%.

Согласно заявляемому способу образование композита происходит в одну стадию окисления восстановленной формы глутатиона, где добавка cis-диаминодихлорплатины выступает как катализатор реакции окисления. Это позволяет тщательно регулировать условия реакции, используя при этом меньшее, чем эквивалент, количество перекиси водорода, и благодаря этому исключить образование продуктов переокисления, сделав практически количественным выход целевого продукта. Таким образом, получение композита в одной стадии окисления приводит к значительному упрощению технологии и получению композита GSSGPt со стабилизированной дисульфидной связью.

Сущность заявляемого способа заключается в использовании водного раствора исходного восстановленного глутатиона в виде мононатриевой соли, к которому при комнатной температуре при перемешивании добавляется 0,9 эквивалента перекиси водорода и 0,001 эквивалента cis-диаминодихлорплатиной. Реакция окисления протекает около 1,5-2 часов. Контроль за полнотой прохождения окисления осуществляется методом ВЭЖХ. Завершение процесса осуществляется лиофильной сушкой реакционного раствора. В результате получают целевой продукт - композит, состоящий из окисленной формы глутатиона и cis-диаминодихлорплатины в мольном соотношении 1000:1, что подтверждается спектральным анализом на платину и натрий. Пептидная составляющая полученного композита по данным аминокислотного анализа, спектра ПМР, времени удерживания в ВЭЖХ соответствует гексапептиду - бис-( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицину, то есть окисленной форме глутатиона. Содержание посторонних примесей не превышает 2%, выход продукта в виде динатриевой соли 96-98% в расчете на сухой композит.

Схема синтеза композита - приведена на фиг. 2.

Методика синтеза. Восстановленный глутатион GSH 170 г. (0,55 моль) суспендируют в 200 мл воды и, при перемешивании, прибавляют 139 мл (0,55 моль) 4N раствора NAOH и затем 170 мл 0,05% водного раствора cis-диаминодихлорплатины cis-[Pt(NH₃)₂Cl₂].

Полученный прозрачный слегка желтый раствор охлаждают при помощи льда до температуры 18-20^oC и добавляют 283 мл 3% раствора перекиси водорода (раствор H₂O₂) небольшими порциями в течение примерно 5 минут, с такой скоростью, чтобы температура реакционной смеси не превышала 22-25^oC (погруженный термометр).

Через 30 минут после прибавления всего количества раствора перекиси водорода (H₂O₂) внутрь реакционного раствора помещают электрод pH-метра и определяют pH раствора, а затем по каплям добавляют 4N раствор натра едкого до pH 5,6-5,8, при этом контролируют температуру, которая должна быть в пределах 22-25^oC. Далее охлаждение убирают и перемешивание продолжают уже при комнатной температуре в течение еще 30 минут.

Контроль полноты прохождения реакции окисления осуществляют методом ВЭЖХ. Жидкостной хроматограф для ВЭЖХ типа Beckman, Sol. Module 126, Det. 168, снабженный колонкой Luna Phenomenex ODS 4,6х250 мм, или аналогичный, подготавливают к работе согласно инструкции по пользованию. Для приготовления мобильной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 20 см³ ацетонитрила (ТУ 6-09-14-2167-84), 1 см³ свежеперегнанной трифторуксусной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой. Перемешивают и дегазируют встряхиванием в вакууме.

Через 30 мин после прибавления всего количества раствора перекиси водорода осуществляют контроль за полнотой прохождения реакции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для этого из реакционной смеси при помощи микрошприца отбирают 10 мкл и растворяют их в 1 мл мобильной фазы (0,1% трифторуксусная кислота: ацетонитрил, 98:2). 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф Beckman 126 Solvent Module, Diod Array Detector Module 168, колонка Luna Phenomenex ODS 4,6х250 мм или аналогичный. Элюирование в изократическом режиме 30 мин в системе 0,1% трифторуксусная кислота: ацетонитрил, 98:2; скорость потока 1 мл/мин, детектирование при 220 нм, сканирование 190-600 нм.

Время удерживания в данных условиях для восстановленного глутатиона 5,0+0,5 мин, время удерживания окисленного глутатиона (11,00,5) мин.

Если по данным ВЭЖХ после стандартного интегрирования хроматограммы содержание окисленной формы глутатиона составляет менее 97%, перемешивание продолжают в том же режиме еще 0,5 ч и контроль по ВЭЖХ повторяют.

Если результат равен или превышает 97%, реакцию считают законченной и переходят к фильтрованию реакционного раствора. Для этого используют фильтр с размером пор не более 0,7 мкм.

Потеря массы при сушке: не должна превышать 5% при сушке до постоянного веса при 100^oC в вакууме (1 мм Hg) над CaCl₂ и P₂O₂.

Содержание основного вещества в готовом продукте по данным ВЭЖХ не ниже 98%.

Таким образом получают окисленный глутатион в виде композита с cis-диаминодихлорплатиной.

Внешний вид: белый порошок без запаха.

Растворимость: растворим в воде, изотоническом растворе хлорида натрия 0,9% для инъекций; нерастворим в спирте 95%, хлороформе, эфире и других органических растворителях.

Прозрачность и цветность раствора: раствор 0,05 г препарата в 10 мл воды прозрачен и бесцветен.

pH 0,1% раствора: 5.0-6.0 потенциометрически, прибор pH/mV/^oC meter Cole Farmer, модель 59003-15 или аналогичный Подлинность: а) аминокислотный анализ (6 н. HCl, 110^oC, 20 ч), глицин-2.0 15%; глутаминовая кислота - 2.0 15%; цистеин-2.0 40%; аминокислотный анализатор ААА "Т-339 М" Pragu или аналогичный.

б) ВЭЖХ - по времени выхода соответствует стандарту бис-( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин динатриевая соль.

Условия хроматографирования: прибор BECKMAN "Gold Nouveau Chromatography Data System" Version 1.0, Diod Array Detector Module 126 или аналогичный.

Проба - 20 мкл 0,1% раствора препарата в мобильной фазе, хроматографирование на колонке ULTRASPERE ODS 250х4,6 мм с обращенной C₁₈-фазой в изократическом режиме ацетонитрил-0,1% трифторуксусная к-та (2:98); скорость потока 1 мл/мин, детектирование при 220 нм, сканирование 190-600 нм.

Чистота (содержание основного вещества): а) по ВЭЖХ не ниже 98%, б) по аминокислотному анализу: не ниже 85 % (анализ согласно Разделу "Подлинность", пункт "а" с точной навеской) Методика определения содержания элементов Точная навеска пробы (около 50 мг) растворялась в 50 мл бидистиллированной воды и раствор использовался для анализа.

Содержание платины определялось количественно методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе модели PQe, фирмы VG Elemental, Англия.

Относительная точность анализа 5%.

Содержание других элементов определяется количественно методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе модели TRACE 61E фирмы Thermo Jarrell Ash, США. Относительная точность анализа 5%.

г) содержание натрия (Na) по эмиссионному спектральному методу: (7,0 0,5)% д) содержание платины (Pt) по масс-спектральному методу: (0,032 0,01)% Содержание элементов, мкг/г: Серебро (Ag) - < 1.0 (< 0.0001%) Алюминий (Al) - 2.0 Мышьяк (As) - < 1.0 Барий (Ba) - < 0.50 Бериллий (Be) - < 0.05 Кальций (Ca) - 7.0 Кадмий (Cd) - < 0.05 Кобальт (Со) - < 0.5 Хром (Cr) - 1.7 Медь (Си) - < 0.5 Железо (Fe) - < 1.0 Калий (К) - < 2.5 Селен (Se) - < 2.0 Магний (Mg) - < 2.5 Марганец (Mn) - < 0.2 Молибден (Mn) - < 0.2 Никель (Ni) - < 0.5 Свинец (Pb) - < 0.40 Стронций (Sr) - 1.9 Титан (Ti) - < 0.5 Ванадий (V) - < 0.5 Цинк (Zn) - 0.65 Сурьма (Sb) - < 0.5 Химические особенности структуры молекулы GSSGPt Препарат GSSGPt представляет собой получаемый по заявляемой технологии композит гексапептида бис-( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин динатриевая соль, координационно-ковалентно связанная с cis-диаминодихлорплатиной (cis-платина). В изобретении представлен новый разработанный авторами метод синтеза структурного аналога GSSG - гексапептида с особой формой стабилизации дисульфидной (-S-S-) связи, что определяет новые биофизические и биохимические свойства молекулы GSSGPt (фиг. 3-5).

Принципиально новым техническим решением в разработке синтеза гексапептида со стабилизированной дисульфидной связью является использование каталитических микрограммовых количеств cis-диаминодихлорплатины в качестве катализатора процесса окисления двух молекул восстановленного глутатиона, что привело к образованию координационно-ковалентных и новых донорно-акцепторных связей.

В молекуле cis-диаминодихлорплатины атом платины соединен с двумя атомами азота в NH₃ группах за счет неподеленных электронов атомов азота, предоставляемых для образования донорно-акцепторных связей (фиг. 3).

При взаимодействии с молекулой окисленного глутатиона GSSG возможен обмен лигандами, т. е. вместо групп NH₃ в донорно-акцепторные связи с атомом платины вступают два атома серы, имеющие по две пары неподеленных электронов. Такая новая донорно-акцепторная связь может рассматриваться как более прочная и равновесие будет смещаться в сторону образования именно таких продуктов. Это связано с увеличением нуклеофильности атомов серы (наличие двух пар неподеленных электронов на более удаленных от ядра орбиталях) по сравнению с атомами азота. Поэтому возможна стабилизация дисульфидной связи в молекуле GSSG за счет включения атомов серы в cis-положении в плоскую структуру с атомом платины (фиг. 4).

Следует учитывать также возможность, дополнительно к рассмотренному, фактор стабилизации молекулы GSSG в препарате GSSGPt за счет сближения групп NH₂ вследствие обмена лигандов - групп NH₃ cis-диаминодихлорплатины на группы NH₂ молекулы GSSG. Этим стабилизируется общая конформация молекулы GSSG (фиг. 5).

Указанные обстоятельства сказываются не только на стабильности молекулы GSSG в препарате GSSGPt, но и в ряде показателей новой химической реакционной способности GSSGPt.

Во-первых, резко увеличивается скорость и полнота прохождения реакции окисления восстановленного глутатиона GSH до окисленной формы GSSG.

Введение в каталитических количествах cis-диаминодихлорплатины в реакционную среду существенным образом повышает выход целевого продукта, степень чистоты и сокращает время реакции, что представляет собой сущность заявляемой технологии. Согласно разработанным нами режимам синтеза, чистота получаемого препарата по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии достигает значений более 99% при проведении синтезов в промышленном масштабе, что значительно выше описываемых в литературе данных по получению обычного окисленного глутатиона (75-93% в зависимости от метода).

Во-вторых, при получении новых химических модификаций молекулы GSSG в препарате GSSGPt, связанных с ацилированием аминогрупп (например, бис-фенилаланилглутатион и др.) резко снижается риск протекания побочных реакций, связанных с затрагиванием атомов серы и разрушением дисульфидной связи. Такие реакции, например S-алкилирование, окисление до соответствующих кислот и др. , вызывают определенные трудности при работе и в данном случае могут быть сведены к минимуму или исключены.

В-третьих, химические модификации, связанные с образованием новых несимметричных дисульфидов (например, при реакции GSSGPt + цистеамин) будут, безусловно, проходить существенно легче в присутствии cis-диаминодихлорплатины. Это связано со стабилизацией вновь образующейся дисульфидной связи за счет включения атомов серы в циклическую систему с атомом платины, о чем говорилось ранее.

Следовательно, представленный в заявляемом изобретении новый метод синтеза молекулы GSSG и ее физико-химической модификации непосредственно в процессе синтеза (стабилизация дисульфидной связи и общей конформации молекулы; появление новых реакционно-способных функциональных сайтов) обеспечили получение биологически активного гексапептида - бис-( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицина со стабилизированной дисульфидной связью - с новыми биофизическими, химическими и биохимическими параметрами структурно-функциональных качеств данного соединения.

Новые возможности химической модификации GSSGPt в целях получения семейства препаратов с заданными свойствами - класс тиопоэтинов Цели химической модификации.

При помощи химической модификации базовой молекулы GSSGPt возможно создание новых препаратов, в молекулах которых наряду с уже показавшей высокую медико-биологическую активность базовой структурой на основе композита окисленного глутатиона с cis-диаминодихлорплатиной, присутствуют фрагменты других ковалентно связанных биохимически активных молекул. Использование ковалентно-связанных комбинаций позволит усилить ряд важных характеристик препаратов, таких как стабильность и стандартизованность состава.

Кроме того, можно ожидать, что целенаправленно выбранные ковалентно связанные фрагменты биохимически важных молекул позволят существенно улучшить медико-биологические свойства базовой молекулы GSSGPt, сделав их более избирательными для каждой конкретной лечебной цели, резко увеличив эффективность в желаемом терапевтическом направлении. Это может быть обусловлено аддитивным эффектом фрагментов в биохимических механизмах действия, резким улучшением транспорта лекарственной молекулы к клетке- или молекуле-мишени, большим сродством к рецептору, нужным перераспределением окислительно-восстановительного потенциала и рядом других факторов, а также их сочетанием.

Основой для химических модификаций служит гексапептидный остов GSSGPt с двумя первичными аминогруппами глутаминовой кислоты, дисульфидной связью цистина и карбоксильными группами глицина и - карбоксильными группами глутаминовой кислоты (фиг. 6).

Все направления модификации молекулы GSSGPt представителями различных классов химических соединений укладываются в рамки шести типовых химических реакций, которые приведены ниже, наряду с обозначением (с N 1 по N 29) общих формул новых композиций в каждом типе реакции синтеза производных GSSGPt.

1 ТИП Реакции ацилирования первичной аминогруппы глутаминовой кислоты.

Этот вариант наиболее подходит для ацилирования при помощи N-защищенных активированных производных аминокислот, по которому после стадии временной защиты меркапто-групп цистеина, конденсации (метод активированных эфиров), удалении N- и S-защитных групп и проведения окисления перекисью водорода с добавкой cis-диаминодихлорплатины, получают композиты GSSGPt, модифицированные аминокислотами по аминогруппам глутаминовой кислоты.

По этой схеме предложены следующие модификации: 1) бис-фенилаланил- GSSGPt - структурная формула приведена на фиг.7 По этой принципиальной схеме синтезируются и все другие модификации GSSGPt, основанные на ацилировании аминогрупп производными защищенных аминокислот, оксикислот, карбоновых кислот и их производных. Возможны небольшие изменения в методиках, связанные с конкретной природой модифицирующей молекулы.

2) бис-метионил-GSSGPt - (Met)₂GSSGPt При синтезе данного производного требуется учитывать специфику молекулы метионина на стадии деблокирования BOC-защитной группы после стадии конденсации.

3) бис-аспартил-GSSGPt Введение аспарагиновой кислоты возможно по рассмотренной общей схеме, однако требуется применение временной защитной группы для - карбоксильной группы, которая по возможности должна удаляться одновременно с BOC-защитной группой.

Поэтому на стадии конденсации используется (3-трет-бутиловый эфир N-BOC-аспарагиновой кислоты, т.е. BOC-Asp(OBu^t)-OSu. Удаление защитных групп трифторуксусной кислотой.

4) бис-гистидил-GSSGPt Имидазольное кольцо гистидина в данном случае нельзя защищать N^im-бензильной защитной группой, которую невозможно деблокировать каталитическим гидрогенолизом в присутствии S-S-дисульфидной группы цистина в молекуле GSSGPt.

Поэтому используется ди-трет-бутилоксикарбонильное производное гистидина на стадии конденсации, т.е. BOC-His(BOC)-OSu. Удаление защитных групп, как и в предыдущих случаях, при помощи трифторуксусной кислоты.

5) бис-3-йод-тирозил-GSSGPt Использование бензильной и бензилоксикарбонильной широко применяемых защитных групп для гидроксильной группы тирозина невозможно, т.к. их удаление проводится при помощи каталитического гидрогенолиза. Оптимальный вариант в данном случае - кислотолабильная защитная группа трет-бутиловый эфир. Используемое на стадии конденсации производное тирозина - BOC-Tyr(OBu^t)-OSu.

6) ГAMK- GSSGPt; - aминoбутaнoил-GSSGPt Используется на стадии конденсации с молекулой GSSGPt кислотолабильная защитная группа трет-бутилоксикарбонильная (BOC), как и в случаях с другими аминокислотами.

7) ГОМК-GSSGPt; - гидроксибутаноил-GSSGPt Для защиты гидроксильной группы - оксимасляной кислоты применяется кислотолабильная (удаляемый раствором трифторуксусной кислоты) трет-бутиловый эфир.

Используемое на стадии конденсации производное ГAMK(OBu^t)-OSu 8) бис-липоил-GSSGPt В данном случае в молекуле липоевой кислоты нет боковых функциональных групп, требующих специальной защиты.

Поэтому на стадии конденсации возможно использование активированного (оксисукцинимидного) эфира липоевой кислоты. Обработка TFA не требуется.

10) бис-3,4-дигидроксифенилаланил-GSSGPt, биc-ДOФA-GSSGPt Для введения молекулы ДОФА требуется предварительная защита двух гидроксильных групп 3,4-дигидроксифенилаланина при помощи трет-бутиловых эфиров и защита аминогруппы BOC-защитной группой. Для конденсации с молекулой GSSGPt получают активированный эфир (оксисукцинимидный или пентафторфениловый) и используют его в мольном избытке. Удаление защитных групп одновременно при помощи раствора трифторуксусной кислоты.

11) бис-карнозил-GSSGPt (бис - аланил-L-гистидил-GSSGPt) Карнозин перед стадией конденсации переводят в защищенное ди-BOC производное для аминогруппы - аланина и имидазольной группы гистидина.

Далее конденсация и последующее деблокирование по рассмотренной для других аминокислот схеме.

2 ТИП Реакции образования амидных связей между аминогруппами GSSGPt и карбоксильными группами гетероциклических карбоновых кислот или фосфоамидных связей с нуклеотидами при помощи стандартных реагентов, используемых для этих целей (замещенные карбодиимиды и др.).

12) бис-никотиноил-GSSGPt (бис-пиридин-3-карбоноил-GSSGPt) Никотиновая кислота, не содержащая боковых функциональных групп, может вводится в конденсацию с GSSGPt без получения защищенных производных в виде соответствующих активированных эфиров, оксисукцинимидного или пентафторфенилового. Обработка трифторуксусной кислотой для деблокирования защитных групп не нужна.

13) Уридин-5'-монофосфатил-GSSGPt, UMP-5'-GSSGPt Для получения данной модификации используются классические методы, применяемые в химии нуклеотидов. Уридин-5'-монофосфат в присутствии N,N-дициклогексил-карбодиимида может образовывать фосфоамидные связи в реакциях с аминами [10] . В качестве аминокомпоненты используют GSSGPt с защищенными карбоксильными группами, тетратриметилсилильное производное GSSGPt (TMS)₄. При этом деблокирование проходит в мягких условиях в водно-спиртовых системах.

14) инозин-5'-монофосфатил-GSSGPt, IMP-5'-SGGS