Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови

Олигомер (варианты), способ обнаружения последовательности hcv (варианты), набор для обнаружения, способ получения крови

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Полинуклеотид, используемый для обнаружения вируса гепатита HCV, и его фрагменты показаны на фиг. 18. Праймер для синтеза ДНК, меченый зонд, несущий обнаруживаемую метку, и зонд захвата представляют собой фрагмент полинуклеотида. Проводят инкубирование полинуклеотидного фрагмента с образцом в условиях, обеспечивающих образование гибридизованных дуплексов между полинуклеотидным реагентом и нуклеиновой кислотой HCV. Обнаруживают образуемые дуплексы, перед инкубацией полинуклеотидного реагента с образцом нуклеиновую кислоту в образце могут дополнительно амплифицировать методом полимеразной цепной реакции с использованием праймера. Из образца крови, подозреваемого на содержание нуклеиновой кислоты HCV, получают нуклеиновую кислоту. Ее инкубируют с фрагментом полинуклеотида в качестве полинуклеотидного реагента в условиях, допускающих образование гибридизованных дуплексов между нуклеиновой кислотой HCV и указанным полинуклеотидным реагентом. Изобретение позволяет обнаруживать вирус гепатита HCV в биологических образцах. 15 с. и 30 з.п.ф-лы, 7 табл., 45 ил.

Техническая часть Изобретение касается материалов и методологий, которыми руководствуются в случаях инфекции вирусом не-A, не-B гепатита (NANBV). Более подробно, она относится к этиологическому агенту не-A, не-B гепатита (NANBH), вирусу гепатита C (HCV) и к полинуклеотидам и их аналогам, которые используются для определения HCV в биологических образцах.

Основания для изобретения Не-A, не-B гепатит (NANBH) - передающаяся от одного человека другому болезнь или семейство заболеваний, которая, как считают, вирусного происхождения, и неотличима от других форм вирус-ассоциированных болезней печени, включая и те, что вызываются известными вирусами гепатита, т.е. вирусом гепатита A (HAV), гепатита B (HBV) и вирусом гепатита дельта (HDV) так же, как и гепатит, вызываемый цитомегаловирусом (CMV) или вирусом Эпштейн-Бара (EBV). NANBH был сначала выявлен у индивидуумов, которым сделали переливание крови. Передача от человека шимпанзе и серийный пассаж в шимпанзе обнаружил свидетельство о том, что NANBH обусловливается заразным инфекционным агентом или агентами.

Эпидемиологическое доказательство предполагает, что возможны три типа NANBH: передающийся посредством воды эпидемический тип, через кровь или иглы и спорадически возникающий (заражение в обществе других людей) тип. Однако количество агентов, которые могут вызывать NANBH, неизвестно.

Есть целый ряд кандидатов в NANBH. См., например, обзоры Prince (1983), Feinstone и Hoofnagle (1984), Overby (1985, 1986, 1987) и статья Iwarson (1987). Однако нет доказательства, что какой-либо из этих кандидатов представляет этиологический агент NANBH.

Потребность в чувствительных специфических методах для скрининга и идентификации носителей NANBV и NANBV, зараженной крови или ее компонентов, очень важна. Посттрансфузионный гепатит (PTH) случается приблизительно у 10% пациентов, и NANBH отвечает за максимум 90% этих случаев. Основная проблема этой болезни - частое прогрессирование к хроническому повреждению печени (25-55%).

Обслуживание пациентов, как и предотвращение заражения NANBH через кровь и ее компоненты или путем тесных персональных контактов, требует надежных инструментов скрининга, диагностики и прогностики для обнаружения нуклеиновых кислот, антигенов и антител, относящихся NANBH.

Методы обнаружения специфических полинуклеотидов гибридизационными анализами известны в науке. См., например, Matthews и Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169: 1; Landegren и др. (1988), Science 242:229 и Mittlin (1989), Clinical chem 35:1819, US patent N 4868105, выданный Sept., 9, 1989, и в EPO publication N 225807 (опубликованном 16 июня, 1987).

Заявитель обнаружил новый вирус, вирус гепатита C (HCV), который, как доказали, является главным этиологическим агентом передающегося посредством воды NANBH (BB-NANBH). Первая работа заявителя, включающая частичную геномную последовательность изолята прототипа HCV, CDC /HCV1/, также обозначенного как HCV1, описана в EPO публикации N 318216 PCT N WO 89/04669 (опубликованной 31 мая 1989 г.) и опубликованного 1 июня 1989 г. Эти патентные заявления так же, как любые соответствующие национальные патентные заявления, объединены здесь в сносках. Эти заявления учат методам рекомбинантной ДНК - клонирования последовательностей HCV, диагностическим процедурам с пробой HCV, антиHCV-антител и методам выделения новых последовательностей.

Раскрытие изобретения Настоящее изобретение основано на последовательностях HCV, описанных EPO publication N 318216 и PCT pub. N WO 89/04669, так же, как и на других последовательностях HCV, которые описаны здесь. Методы выделения и/или детекции специфических полинуклеотидов гибридизацией не могло быть использовано для скрининга HCV до открытия заявителем HCV. Соответственно один из аспектов изобретения - олигомер, способный гибридизоваться с последовательностью HCV в аналит-полинуклеотидной цепи, где олигомер включен в последовательность-мишень HCV, комплементарную по крайней мере 4 прилежащим нуклеотидам кДНК HCV, показанной на фиг. 18.

Другой аспект изобретения - процесс обнаружения последовательности HCV в цепи аналита, подозрительного на содержение HCV полинуклеотида, где HCV полинуклеотид включает селективный район мишени, названный процесс включает: а) обеспечение олигомером, способным гибридизоваться с HCV последовательностью в аналит-полинуклеотидной цепи, где олигомер включает HCV последовательность-мишень, комплементарную по крайней мере 4 прилежащим нуклеотидам HCV кДНК, представленной на фиг. 18, б) инкубацию цепи аналита с олигомером а), что позволяет формировать специфические гибридные дуплексы между последовательностью мишени и исследуемой последовательностью и в) детекцию гибридов, образованных между районом мишени или любым другим и олигомером.

Еще один аспект изобретения - метод получения крови, свободной от HCV, включает: а) обеспечение аналит-нуклеиновыми кислотами из образцов крови, подозрительных на содержание HCV последовательности-мишени, б) обеспечение олигомером, способным гибридизоваться с последовательностью HCV в аналит-полинуклеотидной цепи или любой другой, где олигомер включает HCV последовательность мишени, комплементарную последовательности по крайней мере 8 нуклеотидов, присутствующих в консервативной нуклеотидной последовательности HCV в PHK, в) реагирование а) с б) при условиях, которые позволяют образовать полинуклеотидный дуплекс между последовательностью мишени и исследуемой последовательностью, если не любой другой, г) обнаружение сформированного дуплекса в в) или любого другого и д) сохранение крови, в которой не обнаруживались комплексы в г).

Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает последовательность HCV кДНК в клоне 12f и кодируемую им аминокислоту.

Фиг. 2 демонстрирует последовательность кДНК HCV в клоне K9-1 и кодируемые им аминокислоты.

Фиг. 3 демонстрирует последовательность клона 15e и кодируемые им аминокислоты.

Фиг. 4 представляет нуклеотидную последовательность кДНК HCV в клоне 13i, кодируемые им аминокислоты и последовательности, которые перекрываются клоном 12f.

Фиг. 5 демонстрирует нуклеотидную последовательность кДНК HCV в клоне 26j, кодируемые им аминокислоты и последовательности, которые перекрывают клон 13i.

Фиг. 6 показывает нуклеотидную последовательность кДНК HCV в клоне CA59a, кодируемые им аминокислоты и последовательности, которые перекрываются с клонами 26j и K9-1.

Фиг. 7 - 17 демонстрируют нуклеотидную HCV кДНК, которая перекрывается соответственно: на фиг. 7 в клоне CA84a клоном CA59a; на фиг. 8 в клоне CA156e клоном CA84a; на фиг. 9 в клоне CA1676 клоном CA156e; на фиг. 10 в клоне CA216a клоном CA1676; на фиг. 11 в клоне CA290a клоном CA216a; на фиг. 12 в клоне ад30a клоном CA290a; на фиг. 13 в клоне CA205a последовательностью HCV кДНК в клоне CA290a; на фиг. 14 в клоне 18д последовательностью HCV кДНК в клоне ag30a; на фиг. 15 в клоне 16jh последовательностью HCV кДНК в клоне 15e; на фиг. 16 в клоне 6k последовательностью HCV кДНК в клоне 16jh; на фиг. 17 в клоне p131jh последовательностью HCV кДНК в клоне 6к.

Фиг. 18 представляет составленную кДНК последовательность HCV, происходящую из клонов, здесь описанных, и их составной HCV кДНК последовательности, представленной в БРО публикации N 318216. Клонами, из которых произошли эти последовательности, являются 5'-clone 32, b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1, 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k и p131jh. На чертеже три горизонтальных штриха выше последовательности указывают положение предположительного инициаторного метионинового кодона. Также на чертеже показана аминокислотная последовательность предположительного полипротеина, кодируемого кДНК HCV. Гетерогенность в клонированных ДНК HCV1 указана аминокислотами, приведенными выше предположительной кодирующей последовательности большой OPC, круглые скобки указывают, что гетерогенность обнаружена в или около 5'- или 3'-конца HCV кДНК клона.

Фиг. 19 представляет последовательности захваченных и меченых проб для детекции PHK HCV в биологических образцах.

Фиг. 20 показывает схематический вид полипротеина флавивируса и предположительного полипротеина HCV, кодируемого в большой OPC генома HCV. Также на чертеже указаны возможные функции полипептидов флавивируса, очищенных из флавивирусных полипротеинов. В дополнение, приведены сравнительные расположения полипептидов NANB 5-1-1 и C100 по сравнению с предположительным HCV полипротеином.

Фиг. 21 показывает двухцепочечную нуклеотидную последовательность инсерции кДНК HCV в клоне и предположительной аминокислотной последовательности кодируемого ею полипептида.

Фиг. 22 дает HCV кДНК последовательность в клоне 36, сегмент которой перекрывается с кДНК NANBV клона 81, и кодируемую клоном 36 полипептидную последовательность.

Фиг. 23 дает кДНК HCV последовательность в клоне 37b, сегмент которой перекрывается с клоном 35, и кодируемый им полипептид.

Фиг. 24 дает авторадиографии HCV кПЦР анализа на РНК, полученной из образцов печени шимпанзе с NANBH (фиг. 25A) и итальянских пациентов с NANBH (фиг. 25B).

Фиг. 25A и 25B - графики, показывающие температурную зависимость между степенью повреждения печени, присутствием HCV РНК и присутствием антиHCV-антител для двух шимпанзе с NANBH.

Фиг. 26 дает нуклеотидную последовательность HCV кДНК в клоне CAB4a, кодируемые ею аминокислоты и последовательности, перекрывающиеся с клоном C459a.

Фиг. 27 дает HCV кДНК последовательность в клоне 40b, сегмент которой перекрывается с клоном 37b, и кодируемый ею полипептид.

Фиг. 28 - авторадиография, показывающая меченые амплифицированные продукты приблизительно 300, 30 и 3 CID HCV геномов.

Фиг. 29 дает нуклеотидную последовательность HCV кДНК в клоне 40a.

Фиг. 30 - авторадиография, показывающая амплифицированные продукты, полученные с праймеров, происходящих из консервативных районов HCV генома.

Фиг. 31 представляет HCV кДНК последовательность в клоне 35, сегмент которого перекрывает клон 36, и кодируемый ею полипептид.

Фиг. 32 - диаграмма, показывающая связь проб и праймеров, происходящих из 5'-района HCV РНК, из которого происходят HCV кДНК клонов ag30a и K9-1.

Фиг. 33 - авторадиография амплифицированных продуктов, полученных с наборов праймеров, происходящих от ag30a и K9-1.

Фиг. 34 дает построчно нуклеотидные последовательности человеческих изолятов 23 и 27 HCV 1. Гомологичные последовательности указаны символом (*). Негомологичные последовательности в маленьком шрифте.

Фиг. 35 демонстирует построчно аминокислотные последовательности изолятов человека 23 и 27 HCV 1. Гомологичные последовательности указаны символом (*). Негомологичные последовательности - маленьким шрифтом.

Фиг. 36 показывает изображение в полутонах радиоавтографа норзерн блота РНК, изолированной из печи инфицированной BB-NANBV шимпанзе, гибридизации с BB-NANBV кДНК клона 81.

Фиг. 37 дает изображение в полутонах радиоавтографа нуклеиновых кислот, экстрагированных из NANBV частиц, захваченных из инфицированной плазмы с помощью антиNANB 5-1-1 и гибридизованных с ³²P-меченой NANBV кДНК из клона 81.

Фиг. 38A и B дает изображение радиоавтографов фильтров, содержащих выделенные NANBV нуклеиновые кислоты, гибридизованные с ³²P-мечеными плюс- и минус-цепями ДНК в качестве проб, которые происходили из NANBV кДНК в клоне 81.

Фиг. 39 демонстрирует нуклеотидную последовательность консенсуса изолята человека 23, вариантные последовательности показаны ниже строки этой последовательности. Также показаны аминокислоты, кодируемые последовательностью консенсуса.

Фиг. 40 - график, показывающей связь праймеров EnvR и EnvL с моделью полипротеина флавивируса и предположительно HCV полипротеина.

Фиг. 41 дает сравнение (соответствие по вертикали) нуклеотидных последовательностей изолятов Thorn, ECI, HCT # 18 и HCV 1.

Фиг. 42 дает сравнение нуклеотидных последовательностей EC10 и составной HCV1 последовательностью, последовательность EC10 расположена в строчке выше дотов, и последовательность в строчке ниже дотов.

Фиг. 43 дает сравнение аминокислотных последовательностей 117-308 (относительно HCV1), кодируемых в "EnvL" районах последовательностей консенсуса изолятов человека HCT # 18, JH23, JH27, Thorne, EC1 и HCV 1.

Фиг. 44 дает сравнение аминокислотных последовательностей 330-360 (относительно HCV1), кодируемых в "EnvR" районах последовательностей консенсуса изолятов человека HCT # 18, JH23, JH27, Thorne, EC1 и HCV1.

Фиг. 45 дает нуклеотидные последовательности индивидуальных праймеров в праймерной смеси 5'-3.

Способы осуществления изобретения Термин "вирус гепатита C" (HCV) заранее заказан исследователями этой области для до сих пор неизвестного этиологического агента NANBH. Прототипный изолят HCV был идентифицирован USSN 122, 714 (см. также EPO publication N 318,216). Термин HCV также включает новые изоляты тех же вирусных видов. Как разъяснение этой терминологии заболевание, вызываемое HCV, ранее названное передающийся посредством воды NANB гепатит (BB-NANBH), назвали гепатитом C. Термины NANBH и гепатит C могут использоваться в этом случае взаимозаменяемо.

HCV-вирусные виды, посредством которых патогенные штаммы вызывают BB-NANBH. Могут быть также ослабленные штаммы или дефектные мешающие частицы, берущие от них начало. Как показано ниже, HCV геном состоит из РНК. Известно, что РНК-содержащие вирусы имеют относительно высокие скорости спонтанных мутаций, т.е. явно порядка 10^-3 - 10^-4 на включившийся нуклеотид (Eields и Knipe (1986)). Следовательно, так как гетерогенность и "текучесть" генотипа наследуется в РНК-вирусах, среди их штаммов есть множество штаммов (изолятов), которые могут быть вирулентными или авирулентными. Рецептуры и методы, описанные здесь, дают возможность распространять, идентифицировать, обнаруживать и выделять различные HCV штаммы или изоляты.

Идентифицировано несколько разных штаммов/изолятов HCV (см. ниже). Один такой штамм или изолят, который является прототипом, обозначен CDC/HCV1 (также названный HCV1). Информации об одном штамме или изоляте, таком как частичная геномная последовательность, достаточно, чтобы позволить тем, кто квалифицирован в этой области, используя стандартные технологии, выделить новые штаммы/изоляты и идентифицировать, являются ли также новые штаммы/изоляты HCV. Например, несколько разных штаммов/изолятов описано ниже. Эти штаммы, которые были получены из целого ряда человеческих сывороток (и из разных географических областей), изолировали, используя информацию о геномной последовательности HCV1.

Используя технологии, описанные в EPO publication N 318,216 и ниже, была определена геномная структура и нуклеотидная последовательность HCV1 геномной РНК. Оказалось, что геном - одноцепочечная РНК, содержащая 10 тыс. нуклеотидов. Геном - позитивная цепь и обладает продолжительной трансляционной открытой рамкой считывания (OPC), которая кодирует полибелок около 3000 аминокислот. По-видимому, в OPC структурные белки кодируются приблизительно первой четвертью N-терминального района, причем большая часть полибелка ответственна за неструктурные белки. При сравнении со всеми известными вирусными последовательностями наблюдаются маленькие, но важные гомологии с неструктурными белками семейства флавивирусов и с пестивирусами (которые теперь также рассматривают как часть семейства флавивирусов).

Схематическое выравнивание возможных районов флавивирусного полибелка (используя в качестве примера вирус желтой лихорадки) и предположительно полибелка, закодированного в главной OPC генома HCV, показано на фиг. 20. На чертеже указаны возможные домены HCV полибелка. Полибелок флавивируса содержит, с амино конца к С-терминальному концу, белок нуклеокапсида (C), белок матрикса (M), белок оболочки (E), неструктурные белки (NS) 1, 2 (a + b), 3, 4 (a + b) и 5. Основанный на предположительных аминокислотах, кодируемых в нуклеотидной последовательности HCV1, небольшой домен во внешнем N-конце HCV полибелка, по-видимому, как по размеру, так и по высокому содержанию щелочных оснований подобен белку нуклеокапсида (C), находящемуся на N-конце флавивирусных полибелков. Неструктурные белки 2, 3, 4 и 5 (NS2-5) HCV и вируса желтой лихорадки (YFV), по-видимому, имеют противоположные части сходного размера и гидрофильности, хотя имеется дивергенция в аминокислотных последовательностях. Однако район HCV, который мог бы соответствовать районам YFV полибелка, которые содержат M, E и NS1 белки, не отличаются по последовательности, но, по-видимому, также совершенно отличны по размеру и гидрофильности. Таким образом, в то время как определенные домены генома HCV можно назвать как, например, NS1 или NS2, следует иметь в виду, что эти указания спекулятивные, между HCV семейством и флавивирусами могут быть значительные различия, которые еще придется оценить.

Ожидают, что различные штаммы, изоляты и субтипы HCV содержат различия в аминокислотах и нуклеиновых кислотах по сравнению с HCV1. Ожидают, что многие изоляты дадут большую гомологию (т.е. более чем около 40%) общей аминокислотной последовательности по сравнению с HCV1.

Однако может также оказаться, что есть другие менее гомологичные HCV изоляты. Их можно определить как HCV в соответствии с различными критериями, такими как, например, OPC с приблизительно 9000 нуклеотидов до приблизительно 12000 нуклеотидов, кодирующая полибелок с подобными HCV1 гидрофобным и/или антигенным свойствами, и присутствие построчно пептидных последовательностей, которые консервативны с HCV 1. В дополнение, считают, что геном позитивная цепь РНК.

Все HCV изоляты кодируют по крайней мере один эпитон, который иммунологически идентичен (т. е. иммунологически перекрестно реагирует) с эпитопом, кодируемым в HCV кДНК, описанной здесь. Предпочтительно этот эпитон включен в аминокислотную последовательность, здесь описанную, и является уникальным для HCV при сравнении с предварительно известными патогенами. Уникальность этого эпитона может определяться его иммунологической реактивностью и антиHCV-антителами и отсутствием иммунологической реакционной способности с антителами к известным патогенам.

HCV штаммы и изоляты являются эволюционно родственными. Следовательно, предполагают, что общая гомология геномов на нуклеотидном уровне возможно около 40% или выше, возможно будет около 50% или выше, возможно около 60% или выше и даже более возможно, что около 80% и выше, и в дополнение, что могут быть соответствующие прилежащие последовательности по крайней мере около 13 нуклеотидов. Следует отметить, как показано ниже, в HCV геноме есть вариабельные и гипервариабельные районы, следовательно, предполагают, что гомология этих районов значительно меньше, чем в целом по геному. Соответствие между предположительной геномной последовательностью цепи HCV и, например, кДНК последовательностью CDC/HCV1 можно определить с помощью методов, известных в науке. Например, их можно определить путем прямого сравнения информации о последовательности полинуклеотида предположительно HCV и HCV кДНК последовательностей, описанных здесь. Их можно также определить гибридизацией полинуклеотидов при условиях, при которых формируются стабильные дуплексы между гомологичными районами (например, те, что можно было бы использовать перед расщеплением S₁), после чего следует расщепление нуклеазой, специфичной к одноцепочечной ДНК, затем следует определение величины переваренных фрагментов.

Вследствие эволюционной связи штаммов и изолятов HCV, предположительные HCV штаммы или изоляты идентичны по их гомологии на полипептидном уровне. В основном, предполагают, что HCV штаммы или изоляты гомологичны по крайней мере на 40%, гомологичны более 50%, возможно более чем около 70% гомологичны и даже более вероятно, что на приблизительно 90% гомологичны на полипептидном уровне. Технологии определения гомологии аминокислотной последовательности известны в науке. Например, аминокислотную последовательность можно определять непосредственно и сравнивать с последовательностями, приведенными здесь. Аналогично можно определить нуклеотидную последовательность геномного материала предположительно HCV (обычно через кДНК интермедиат), предположительную аминокислотную последовательность, кодируемую ей, и соответствующие районные сравнить.

Как здесь употребляется, полинуклеотид, "происходящий от" указанной последовательности, относится к полинуклеотидной последовательности, которая содержит в себе по крайней мере около 6 нуклеотидов, предпочтительно по крайней мере около 8 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере около 10-12 нуклеотидов, и даже предпочтительно по крайней мере около 15-20 нуклеотидов, соответствующих району указанной нуклеотидной последовательности. "Соответствующий" подразумевает гомологичный или комплементарный обозначенной последовательности. Предпочтительно, чтобы последовательность района, из которого происходит полинуклеотид, являлась гомологичной или комплементарной уникальной в геноме HCV последовательности. Более предпочтительно, чтобы родственная последовательность была гомологичной или комплементарной уникальной последовательности во всех или огромном большинстве HCV изолятов. Уникальна последовательность в геноме HCV или нет, можно определить методами, известными тем, кто квалифицирован в этой области. Например, эту последовательность можно сравнить с последовательностями в банке данных, например в банке генов, чтобы определить, присутствует ли она в неинфицированных хозяевах или других организмах. Последовательность можно сравнить также с известными последовательностями других вирусных агентов, включая те, что, как известно, вызывают гепатиты, например HAV, HBV и HDV, и являются членами семейства Flaviviridae. Соответствие или несоответствие родственной последовательности другим последовательностям можно также выяснить гибридизацией при подходящих условиях жесткости. Методы гибридизации для определения комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот в науке и обсуждаются здесь. См. также, например, Maniatis и др. (1982). В дополнение, неспаренные нуклеотиды в полинуклеотидном дуплексе, образованном при гибридизации, можно определить известными методами, включая, например, переваривание с нуклеазой, такой как S₁, которая специфически расщепляет одноцепочечные области в полинуклеотидном дуплексе. Районы, из которых могут "происходить" типичные последовательности ДНК, включают (но не ограничиваются), например, районы, кодирующие специфические эпитоны, так же как нетранкскрибируемые и/или нетранслирумые районы.

Родственный полинуклеотид не обязательно физически происходит от показанной нуклеотидной последовательности, а может быть образован любым образом, включая, например, химический синтез, или репликацию ДНК, или обратную транскрипцию, или просто транскрипцию. В дополнение, комбинации районов, соответствующих районам указанной последовательности, можно модифицировать с помощью способов, известных в науке, чтобы согласовать их в свете предполагаемого использования.

Под термином "рекомбинантный полинуклеотид", как он здесь использован, подразумевается полинуклеотид геномный, кДНК, полисинтетический, синтетический, который по способу его происхождения или манипуляций с ним: 1) не имеет сходства с полным или частью полинуклеотида, с которым он ассоциируется в природе, 2) связан с другим полинуклеотидом, чем тот, с которым ассоциируется в природе, 3) не встречается в природе.

Термин "полинуклеотид", как он здесь использован, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин включает одну- и двухцепочечные ДНК и РНК. Он также включает известные типы модификаций, например мечение, известное в науке, метилирование, "кэпирование", замены одного или более природных нуклеотидов на аналоги, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с неизмененными связями (например, метилфосфанаты, фосфотриэфиры, фосфоангидриды, карбаматы и т.д.) и с измененными связями (например, фосфоротиаты, фосфородитиаты и т. д.), содержащие "подвешенные" к ним части, например белки (включая например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.) с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т.д.), содержащие хелаты (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окисленные металлы и т. д. ), содержащие алкиляторы, с модифицированными связями (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), так же как немодифицированные формы этого полинуклеотида.

Как использовано здесь, "смысловая цепь" нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая имеет последовательность, гомологичную мРНК. "Антисмысловая цепь" содержит последовательность, комплементарную "смысловой цепи".

Как использовано здесь, "геном с позитивной цепью" вируса является геномом, состоящим из РНК либо ДНК, одноцепочечным, который кодирует вирусные полипептиды. Пример позитивных РНК вирусов включают тогавирусы, коронавирусы, ретровирусы, пикорнавирусы и калицивирусы. Также включены флавивирусы, которые прежде классифицировали как тогавирусы. См. Fields и Knipe (1986).

Термин "праймер", как здесь использовано, относится к олигомеру, который способен работать как участок инициации синтеза полинуклеотидной цепи, при инкубации в подходящих условиях. Праймер комплементарен или почти комплементарен району полинуклеотидной цепи, которую нужно скопировать. Таким образом, при условиях, ведущих к гибридизации, праймер отжигается с комплементарным районом цепи аналита. При добавлении подходящих реагентов (например, полимеразы, нуклеотид трифосфатов и подобных) праймер наращивается полимеризующими агентами, образуя копию цепи аналита. Праймер может быть одноцепочечным или альтернативно может быть частично или полностью двухцепочечным.

Термины "полинуклеотид аналита" и "цепь аналита" относятся к молекуле одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая, как подозревают, содержит последовательность мишени и которая может присутствовать в биологическом образце.

Как здесь использовано, термин "олигомер" относится к праймерам и пробам. Термин олигомер не имеет дополнительного значения длины молекулы. Однако обычно олигомеры не длиннее 1000 нуклеотидов, более типично не длиннее 500 нуклеотидов и даже более типично не длиннее чем 250 нуклеотидов, они могут быть не длиннее 100 нуклеотидов, и не длиннее чем 75 нуклеотидов, и также могут быть не более 50 нуклеотидов длины.

Как здесь использовано, термин "проба" относится к структуре, включающей полинуклеотид, который формирует гибридную структуру с последовательностью мишени, обусловленной комплементарностью по крайней мере одной последовательности в пробе с последовательностью в районе мишени. Полинуклеотидные районы проб могут состоять из ДНК, и/или РНК, и/или синтетических нуклеотидных аналогов. Со словом "проба" употребляются сочетания "захваченные пробы" и "меченые пробы". Предпочтительно, чтобы проба не содержала последовательность, комплементарную последовательности(тям), используемым в качестве праймеров для реакции наращивания цепи (PCR).

Как здесь использовано, термин "район мишени" относится к последовательности, с которыми проба или праймер формируют при требуемых условиях стабильный гибрид.

Термин "захватывающая проба", как здесь использовано, относится к полинуклеотиду, состоящему из одноцепочечного полинуклеотида, отожженного с связывающимся партнером. Одноцепочечный полинуклеотид включает полинуклеотидную последовательность для мишени, которая комплементарна последовательности мишени в районе мишени, чтобы быть детектированной в полинуклеотиде аналита. Этот комплементарный район достаточной длины и комплементарен последовательности мишени, чтобы позволить сформировать достаточно стабильный дуплекс, чтобы иммобилизовать полинуклеотид аналита на поверхности носителя (через связывающихся партнеров). Связывающийся партнер может быть связан с поверхностью твердого носителя или может быть связан непрямым способом через другие структуры или связывающихся партнеров с твердым носителем.

Термин "полинуклеотидная последовательность для мишени", как здесь использовано, относится к полинуклеотидной последовательности, которая включает нуклеотиды, комплементарные нуклеотидной последовательности мишени, эта последовательность достаточной длины и комплементарности с последовательностью мишени для образования дуплекса достаточной стабильности для намеченных целей.

Термин "связывающийся партнер", как здесь использовано, относится к молекуле, способной связывать молекулу лиганда с высокой специфичностью, как например антиген и специфичное ему антитело. В основном специфически связывающиеся партнеры должны связываться с достаточным сродством для иммобилизации дуплекса копия аналита/ комплементарная цепь (в случае захватывающих проб) при выбранных условиях. Специфически связывающиеся партнеры известны в науке и включают, например, биотин и авиадин или стрептавидин, IgG и белок A, многочисленные известные пары рецептор - лиганд и комплементарные полинуклеотидные цепи. В случае комплементарных полинуклеотидных связывающихся партнеров они обычно по крайне мере около 15 оснований в длину и могут быть по крайней мере 40 оснований длины, и, кроме того, они имеют F + C состав по крайней мере около 40% и максимально около 60%. Полинуклеотиды могут быть представлены ДНК, РНК или синтетическими нуклеотидными аналогами.

Термин "связанный", как здесь использовано, относится к способам присоединения посредством ковалентных связей или путем сильных нековалентных взаимодействий (например, гидрофобные взаимодействия водородные связи и т.д. ). Ковалентные связи могут быть, например, из сложных эфиров, простых эфиров, фосфоэфирными, амидными, пептидными, имидными, связи углерод-сера, связи углерод-фосфор и подобные.

Термин "носитель" относится к любой твердой или полутвердой поверхности, на которой можно заякорить требуемый связывающийся партнер. Подходящие подложки включают стекло, пластик, металл, полимерные гели и подобные и могут принимать форму гранул, лунок, мембран и подобных.

Термин "меченый", как здесь использовано, относится к любому атому или части, которые можно использовать для обеспечения детектируемого (предпочтительно количественного) сигнала и которые можно включить в полинуклеотид или полипептид.

Как здесь использовано, термин "меченая проба" относится к олигомеру, который включает полинуклеотидную последовательность для мишени, комплементарен последовательности мишени, которую нужно детектировать в полинуклеотиде аналита. Этот комплементарный район достаточной длины и комплементарен последовательности мишени, чтобы позволить образовать дуплекс, состоящий из "меченой пробы" и "последовательности мишени", который детектируется с помощью метки. Олигомер спаривается с меткой либо непосредственно, либо непрямым способом через набор молекул лигандов с высокой специфичностью друг к другу. Наборы молекул лигандов с высокой специфичностью описаны выше и также включают мультимеры.

Термин "мультимер", как здесь описано, относится к линейным или разветвленным полимерам одинаковой повторяющейся одноцепочечной полинуклеотидной единицы или разных одноцепочечных полинуклеотидных единиц. По крайней мере одна из единиц имеет последовательность, длину и состав, которые позволяют специфично гибридизоваться ей с первой же одноцепочечной нуклеотидной последовательностью, представляющей интерес, обычно аналитом или олигомером (например, меченой пробой), связанным с аналитом. Для того чтобы достичь такой специфичности и стабильности, эта единица обычно по крайней мере 15 нуклеотидов длины, типично не более около 50 нуклеотидов длины и предпочтительно около 30 нуклеотидов длиной, более того, F + Ц состав нормально по крайней мере около 40% и максимально около 60%. В дополнение к этой единице(ам) мультимер включает множество единиц, которые способны специфично и стабильно гибридизоваться со вторым одноцепочечным нуклеотидом, представляющим интерес, обычно меченым полинуклеотидом или еще одним мультимером. Эти единицы в основном приблизительно одинакового размера и состава с мультимерами, описанными выше. Когда мультимер предназначен для гибридизации с еще одним мультимером, первая и вторая олигонуклеотидные единицы гетерогенные (разные) и не гибридизуются друг с другом при выбранных условиях анализа. Таким образом, мультимеры могут быть мечеными пробами или лигандами, которые связывают метку с пробой.

Как здесь использовали, термин "вирусная РНК", которая включает HCV РНК, относится к РНК вирусного генома, его фрагментов, его транскриптов и происходящим из него мутантным последовательностям.

Как здесь использовано, "биологический образец" относится к образцу ткани или жидкости, изолированных из индивидуума, включающих (но не ограничивающихся), например, плазму, сыворотку, спиномозговую жидкость, лимфу, наружные покровы кожи, дыхательного, кишечного и мочеполового трактов, слезы, слюну, молоко, клетки крови, опухоли, органы и также образцы клеточной культуры in vitro (включающие, но не ограничивающиеся определенной средой, полученной при росте клеток в клеточной культуральной среде, предположительно инфицированные вирусом клетки, рекомбинантные клетки и клеточные компоненты).

Описание изобретения Практика настоящего изобретения использует, если не оговорено особо, общепринятые технологии химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые доступны квалифицированным в науке. Такие методы полностью даны в литературе. См., например, Maniatis, Fitsch и Sambrook, Molecular cloning; A Laboratory manual (1982); DNA cloning, Volumes I и II (D. N. Glover ed. 1985); oligonucleotide synthesis (M.I.Gaid ed., 1984); Nucleic acid hybridization (B.D.Hames S.I.Higgins eds. 1984); серии Methods in enzymology Academic press. Inc. ), особенно Vol 154 и Vol 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., соответственно). Все патенты, патентные заявления и публикации, о которых здесь упоминалось как выше, так и ниже, внесены здесь в ссылки.

Используемые материалы и процессы настоящего изобретения делают возможным обнаружение HSV как этиологического агента BB-NANBV и обеспечение семейством нуклеотидных последовательностей, выделенных из кДНК библиотек, которые содержат HCV кДНК последовательности. Эти кДНК библиотеки получали на основании последовательностей нуклеиновых кислот, присутствующих в плазме HCV-инфицированной шимпанзе. Конструирование одной из этих библиотек библиотеки "с" (АТСС N 40394) описано в БРО publication N 318216.

Используя вышеописанные HCV кДНК последовательности, можно сконструировать олигомеры, которые используют как реагенты для детекции вирусных полинуклеотидов в биологических образцах. Например, возможно синтезировать ДНК олигомеры длиной около 8-10 нуклеотидов или больше, которые используют как гибридизационные пробы для обнаружения присутствия HCV РНК, например, в крови доноров, фракциях крови, сыворотке индивидуумов, подозрительных на носительство вируса, или системах культуры клеток, в которых реплицируется вирус. Кроме того, новые олигомеры, описанные здесь, позволяют далее охарактеризовать HCV геном.

Полинуклеотидные пробы и праймеры, происходящие из этих последовательностей, можно использовать для амплификации последовательностей, присутствующих в кДНК библиотеках, и/или скринировать кДНК библиотеки для дополнительных перекрывающихся последовательностей кДНК, которые