Способ индуцирования образования цветков у растений

Способ индуцирования образования цветков у растений

Реферат

 

Изобретение предназначено для увеличения урожайности растений. Последовательности ДНК, кодирующие протеин, обладающий цитрат-синтазной активностью, стабильно интегрируют в геном клетки растения. Из клетки затем регенерируют целое растение. Благодаря повышению уровня продукции цитрат-синтазы в клетках растений у них индуцируется ускоренное и в большем количестве образование цветков. 8 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 табл.

Настоящее изобретение относится к способам ингибирования образования цветков и к способам индуцирования образования цветков у растений, а также к способам улучшения способности к хранению запасающих органов полезных растений и к способам уменьшения прорастания клубней у клубневых растений. Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, кодирующим цитрат-синтазу растений, и к новым плазмидам, содержащим эти последовательности ДНК, которые в результате интеграции с геномом растения изменяют активность цитрат-синтазы у растения, а также к трансгенным растениям, у которых изменения активности цитрат-синтазы получают путем введения указанных последовательностей ДНК.

Вследствие непрерывного возрастания потребности в продовольствии, являющегося результатом постоянного роста численности населения земного шара, одной из задач биотехнологических исследований является стремление увеличить урожайность полезных растений. Одной из возможностей достижения этого является, например, изменение характера цветения полезных сельскохозяйственных растений. Возрастание количества цветков является, например, желательным для растений, цветки, плоды или семена которых имеют сельскохозяйственное значение. Более раннее образование цветков приводит к укорачиванию периода между посевом и цветением, что, таким образом, позволяет культивировать растения в климатических зонах с укороченными периодами вегетации или применять два посева в течение одного вегетационного периода. Ингибирование образования цветков может быть целесообразным в отношении растений, которые размножаются преимущественно вегетативным способом, и может привести к увеличению накопления запасаемых веществ в запасающих органах. Одним из примеров такого полезного сельскохозяйственного растения является картофель.

Однако направленное изменение характера цветения у растений до настоящего времени не было возможным, поскольку процесс индуцирования образования цветков у растений оставался до сих пор недостаточно ясным. В качестве индукторов образования цветков рассматриваются различные вещества, такие как, например, углеводы, цитокинины, ауксин, полиамины и кальций. Однако в целом было признано, что цветение представляет собой сложный процесс, являющийся результатом взаимодействия нескольких факторов, которые еще недостаточно изучены (Bernier и др., (1993), Plant Cell, 5:1147-1155).

В настоящее время для изменения характера цветения, как правило, применяют химические вещества. Так, например, известно, что ингибирование образования цветков у сахарного тростника, приводящее к значительному увеличению получения сахара, может быть достигнуто путем экзогенного внесения различных синтетических регуляторов роста (монурона, диурона, диквата). Применение таких синтетических веществ, однако, обычно связано со значительными затратами и опасностью для окружающей среды, которую трудно оценить.

В связи с этим желательно разработать способы, позволяющие осуществлять направленное изменение характера цветения, в частности ингибирование или индуцирование образования цветков различных полезных растений, исключив при этом использование синтетических веществ.

Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка способов, позволяющих получать растения с измененной характеристикой цветения, в частности растения, у которых ингибируют образование цветков, или растения с более ранним образованием цветков и их увеличенным количеством.

В настоящем изобретении описаны способы генетической инженерии, которые приводят к изменению характеристики цветения растений в результате изменения активности фермента, вовлеченного в процессы дыхания в клетках.

Неожиданно было установлено, что сильное ингибирование активности цитрат-синтазы в клетках растений картофеля приводит к полному ингибированию образования цветков у этих растений и что увеличение активности цитрат-синтазы в клетках трансформированных растений картофеля также приводит к изменению характера цветения растений, в частности к более раннему образованию цветков и к увеличению их количества.

Для получения растений со сниженной активностью цитрат-синтазы из различных видов растений выделяли последовательности ДНК, кодирующие ферменты с ферментативной активностью цитрат-синтазы. Этими последовательностями являются последовательности ДНК из растений семейства пасленовых (Solanaceae), в частности из Solanum tuberosum и Nicotiana tabacum, и последовательности из растений семейства маревых (Chenopodiacae), в частности из сахарной свеклы (Beta vulgaris).

Следовательно, предметом настоящего изобретения являются последовательности ДНК из растений семейства пасленовых, в частности из видов Solanum tuberosum и Nicotiana tabacum, и из растений семейства маревых, в частности из вида Beta vulgaris, кодирующие ферменты, обладающие ферментативной активностью цитрат-синтазы, и которые после интеграции с геномом растения позволяют получать транскрипты, у которых может быть подавлена активность эндогенной цитрат-синтазы, или получать транскрипты, в клетках которых может быть повышена активность цитрат-синтазы. В частности, изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим протеин, имеющий одну из аминокислотных последовательностей, представленных в Seq ID N 1, Seq ID N 2 или Seq ID N 3, или протеин, имеющий практически идентичную аминокислотную последовательность, и к последовательностям ДНК, имеющим одну из нуклеотидных последовательностей, представленных в Seq ID N 1, Seq ID N 2 или Seq ID N 3, или практически идентичную нуклеотидную последовательность. Изобретение также относится к производным последовательностей, представленных в Seq ID N 1-3, которые могут быть получены из них в результате вставки (инсерции), делеции или замещения одного или более нуклеотидов или путем рекомбинации и которые кодируют протеины, обладающие ферментативной активностью цитрат-синтазы.

Рекомбинантные молекулы ДНК, например, плазмиды, и бактерии, содержащие эти последовательности ДНК или их участки, либо их производные, также являются предметом настоящего изобретения.

Термин "практически идентичные" в отношении ДНК и аминокислотных последовательностей означает, что рассматриваемые последовательности имеют высокую степень гомологичности и что существует функциональная и/или структурная эквивалентность между рассматриваемыми последовательностями ДНК или аминокислотными последовательностями. Под высокой степенью гомологичности понимается, что последовательность идентична по крайней мере на 40%, предпочтительно более чем на 60% и особенно предпочтительно более чем на 80%. Последовательности, которые являются гомологичными последовательностям по изобретению и отличаются от последовательности ДНК или аминокислотной последовательности по изобретению по одной или нескольким позициям, как правило, являются вариациями или производными этой последовательности и представляют собой модификации, выполняющие ту же функцию. Кроме того, они также могут быть вариациями естественного происхождения, например последовательностями из других организмов, или мутациями, причем эти мутации могут быть вызваны естественным путем или быть интродуцированы в результате направленного мутагенеза. Эти вариации также могут представлять собой последовательности, полученные искусственным путем.

Протеины, кодирующие различные варианты последовательности ДНК по изобретению, обладают определенными общими характеристиками. Последние могут включать, например, ферментативную активность, иммунологическую реактивность, конформацию и т.д., и физические свойства, такие как, например, подвижность при гель-электрофорезе, хроматографическое поведение, коэффициенты седиментации, растворимость, спектроскопические характеристики, стабильность и т.д.

Было установлено, что ингибирование образования цветков происходит в трансформированных растениях, если последовательности ДНК, кодирующие цитрат-синтазу, вводят в клетки растения и экспрессируют в антисмысловой ориентации, что приводит к уменьшению цитрат-синтазной активности в клетках.

В контексте настоящего изобретения ингибирование образования цветков означает, что у трансформированных растений цветки либо более не развиваются совсем или образуется меньше цветков, чем у нетрансформированных растений, либо некоторые цветки могут образовываться, но не превращаются в цветки с нормальными функциями. Ингибирование образования цветков также означает, что у растений цветки все же развиваются, но они являются стерильными и не приводят к образованию семян или плодов, или они способны функционировать только в ограниченной степени и приводят к образованию меньшего количества семян по сравнению с растениями дикого типа. В частности, ингибирование образования цветков означает, что формируются мужские стерильные цветки или цветки, в мужских репродуктивных органах которых формируется только небольшое количество способной к оплодотворению пыльцы. Термин также означает, что у растений формируются цветки, в которых женские репродуктивные органы отсутствуют, не обладают нормальными функциями или их функции понижены по сравнению с растениями дикого типа.

Ингибирование образования цветков также означает, что трансформированные растения, если они обладают способностью к зацветанию, зацветают позднее, чем нетрансформированные растения, как правило, позднее на несколько дней, предпочтительно позднее на одну или несколько недель, наиболее предпочтительно позднее на 2-4 недели.

Следовательно, предметом настоящего изобретения является применение последовательностей ДНК, кодирующих цитрат-синтазу, для ингибирования образования цветков у растений и применение таких последовательностей для экспрессии нетранслируемой мРНК, которая препятствует синтезу эндогенных цитрат-синтаз в клетках.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования образования цветков у растений, отличающемуся тем, что в клетках растений снижают активность цитрат-синтазы, причем это снижение получают предпочтительно путем ингибирования экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих цитрат-синтазы.

Наиболее предпочтительными являются способы, в которых ингибирование образования цветков достигают путем ингибирования экспрессии генов эндогенной цитрат-синтазы, применяя антисмысловую РНК.

Настоящее изобретение относится, в частности, к способам ингибирования образования цветков у растений, отличающимся тем, что а) ДНК, комплементарную присутствующему в клетке гену цитрат-синтазы, стабильно интегрируют в геном клетки растения, б) указанную ДНК экспрессируют присущим ей образом или ее индуцируют путем комбинации с соответствующими элементами, контролирующими транскрипцию, в) экспрессию генов эндогенной цитрат-синтазы ингибируют в результате антисмыслового эффекта и г) растения регенерируют из трансгенных клеток.

Экспрессию ДНК, комплементарной гену цитрат-синтазы, присутствующему в клетке, как правило, получают путем интегрирования в геном растений рекомбинантной двухцепочечной молекулы ДНК, включающей полигенный экспрессирующий кластер, имеющий следующие составляющие и экспрессирующий их: А) промотор, функционирующий в растениях, Б) последовательность ДНК, кодирующую цитрат-синтазу, которую сливают с промотором в антисмысловой ориентации так, чтобы транскрибировалась некодирующая цепь, и при необходимости В) функционирующий в растениях сигнал для прекращения транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

Такие молекулы ДНК также являются предметом изобретения. Настоящее изобретение относится к таким молекулам ДНК, которые содержат описанные полигенные экспрессирующие кластеры в форме плазмиды pKS-CSa (DSM 8880), содержащей кодирующую область для цитрат-синтазы картофеля, и плазмиды TCSAS (DSM 9359), содержащей кодирующую область для цитрат-синтазы табака, строение которых описано в примерах 3 и 8 соответственно.

В принципе, в качестве промотора может быть использован любой активный в растениях промотор. Промотор должен гарантировать, что выбранный ген экспрессируется в растении. Возможно применение как таких промоторов, которые гарантируют существенную экспрессию во всех тканях растения, как, например, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, так и таких промоторов, которые гарантируют экспрессию только в определенной ткани, на определенной стадии развития растения или в момент времени, определенный внешними воздействиями. Промотор может быть гомологичным или гетерологичным по отношению к трансформируемому растению.

Применение тканеспецифичных промоторов является предпочтительным предметом изобретения.

Последовательность ДНК, кодирующая протеин, обладающий ферментативной активностью цитрат-синтазы, может, в принципе, иметь происхождение из любого выбранного организма, предпочтительно из растений. Предпочтительно, чтобы используемая последовательность имела происхождение из тех видов растений, которые применяют для трансформации, или из близкородственных видов растений.

Предпочтительный пример осуществления указанного выше способа состоит в том, что в качестве последовательности ДНК, кодирующей цитрат-синтазу, применяют последовательность ДНК, имеющую происхождение из растения семейства Solanaceae или семейства Chenopodiaceae, в частности из Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum или Beta vulgaris. Наиболее предпочтительные примеры выполнения изобретения включают применение последовательности ДНК, кодирующей протеин, имеющий одну из аминокислотных последовательностей, представленных в Seq ID N 1, Seq ID N 2 или Seq ID N 3, или практически идентичную аминокислотную последовательность, в частности последовательность ДНК, которая идентична или практически идентична одной из последовательностей ДНК, представленных в Seq ID N 1, Seq ID N 2 или Seq ID N 3.

Кроме того, используя стандартные способы и уже известные последовательности ДНК, кодирующие цитрат-синтазы, могут быть выделены из любых организмов, предпочтительно из растений, другие последовательности ДНК, которые кодируют протеины, обладающие ферментативной активностью цитрат-синтазы. Эти последовательности также могут применяться в способах по настоящему изобретению.

Антисмысловая ориентация по отношению к промотору кодирующей последовательности ДНК, указанная в п. Б), приводит к образованию нетранслируемой мРНК в трансформированных клетках растений, что препятствует синтезу эндогенной цитрат-синтазы.

Вместо полных последовательностей ДНК, представленных в Seq ID N 1, Seq ID N 2 и Seq ID N 3, в соответствии с настоящим изобретением для антисмыслового ингибирования также можно применять их частичные последовательности. Могут быть использованы последовательности, минимальная длина которых составляет 15 пар оснований. Однако ингибирующее действие не исключено и в том случае, когда используют более короткие последовательности. Предпочтительно применяют более длинные последовательности, состоящие из 100-500 пар оснований, в частности для эффективного антисмыслового ингибирования предпочтительно использовать последовательности, имеющие более 500 пар оснований. Как правило, применяют последовательности, имеющие менее 5000 пар оснований, предпочтительно последовательности, которые имеют менее 2500 пар оснований.

В способе по настоящему изобретению также возможно применять последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологичности с последовательностями ДНК по настоящему изобретению, но которые не являются полностью идентичными. Минимальная гомологичность должна быть выше чем приблизительно 65%. Предпочтительно использовать последовательности, гомологичные на 95-100%.

Также могут использоваться последовательности ДНК, образованные из последовательностей, представленных в Seq ID N 1, Seq ID N 2 или Seq ID N 3, путем вставки, делеции или замещения так, чтобы не было нарушено ингибирующее действие антисмысловой последовательности.

Фрагменты ДНК, применяемые для конструирования антисмысловых конструкций, также могут быть фрагментами синтетической ДНК, получаемыми с использованием современных методов синтеза ДНК.

Растения, получаемые с помощью описанного способа и которые характеризуются тем, что они проявляют пониженную активность цитрат-синтазы в клетках в результате экспрессии антисмысловой РНК, которая комплементарна последовательностям ДНК, кодирующим протеин, обладающий ферментативной активностью цитрат-синтазы, также являются предметом изобретения. Такие растения также отличаются тем, что они содержат стабильно интегрированный в геном полигенный экспрессирующий кластер, содержащий следующие последовательности: А) промотор, функционирующий в растениях, Б) последовательность ДНК, кодирующую цитрат-синтазу, которую сливают с промотором в антисмысловой ориентации так, чтобы транскрибировалась некодирующая цепь, и при необходимости В) функционирующий в растениях сигнал для прекращения транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

Растения предпочтительно представляют собой указанные выше растения.

Как описано в примерах выполнения изобретения при использовании картофеля в качестве примера, в растениях картофеля ингибирование образования цветков в трансформированных растениях происходит вследствие снижения активности цитрат-синтазы в результате антисмыслового эффекта. В частности, трансформированные растения картофеля проявляют более или менее выраженные фенотипы в зависимости от степени снижения активности цитрат-синтазы. Существенное снижение активности цитрат-синтазы приводит к полному ингибированию образования цветков. Растения с менее выраженным ингибированием могут образовывать почки, из которых тем не менее не развиваются цветки с нормальной функцией. Также могут быть получены растения, на которых развиваются цветки, но женские репродуктивные органы которых не обладают нормальной функцией.

Сходные эффекты наблюдают у трансгенных растений табака, которые обладают пониженной активностью цитрат-синтазы. В данном случае также развиваются цветки, женские репродуктивные органы которых сильно уменьшены в размере.

Ингибирование образования цветков путем снижения активности цитрат-синтазы представляет интерес, однако не только для картофеля или табака, но имеет более широкое значение для селекции растений и сельского хозяйства. Например, можно отметить возможность достижения хронологически заданной индукции или ингибирования цветения путем комбинации последовательностей ДНК по настоящему изобретению с экзогенно регулируемыми элементами контроля. Это может играть роль для повышения морозостойкости.

Способы по настоящему изобретению могут быть использованы как в отношении двудольных, так и в отношении однодольных растений. Растениями, которые представляют особый интерес, являются полезные растения, такие как некоторые виды зерновых культур (например, рожь, пшеница, кукуруза, овес, ячмень, маис, рис и т.д.), некоторые виды фруктовых культур (например, абрикос, персик, яблоневые, слива и т.д.), некоторые виды овощных культур (например, томат, брокколи, спаржа и т.д.), декоративные растения или другие типы растений, имеющие экономическое значение (например, картофель, табак, рапс, соя, подсолнечник, сахарный тростник и т.д.).

Применение настоящего изобретения, в частности, в отношении сахарной свеклы представляет особенный интерес, поскольку в данном случае путем ингибирования образования цветков может быть предотвращено "стеблевание". Поскольку стеблевание индуцируют низкие температуры, семена высаживают относительно поздно (в апреле/мае), чтобы предотвратить стеблевание. Уменьшение стеблевания сахарной свеклы может быть достигнуто путем ингибирования цитрат-синтазы. Это позволяет высаживать семена сахарной свеклы раньше, что впоследствии приводит к повышению урожая благодаря увеличению вегетационного периода.

Кроме ингибирования образования цветков у трансформированных растений картофеля, которые обладают пониженной активностью цитрат-синтазы в клетках, наблюдали снижение прорастания клубней и снижение респирации в клетках клубней по сравнению с нетрансформированными растениями. Это приводит к снижению потерь при хранении и повышению стойкости клубней при хранении. Следовательно, способ по настоящему изобретению также пригоден для получения растений с повышенной устойчивостью при хранении запасающих органов, причем повышенная устойчивость при хранении, как это понимается в контексте настоящего изобретения, означает, что хранящиеся запасающие органы трансформированных растений имеют меньшую потерю массы сырой ткани и массы в сухом состоянии после периода хранения по сравнению с таковой для нетрансформированных растений. Под запасающими органами понимаются обычные органы растений, собираемые в виде урожая, такие как семена, плоды, клубни и корнеплоды.

В частности, способ пригоден для получения трансгенных растений картофеля, клубни которых характеризуются повышенной устойчивостью при хранении, уменьшенными потерями при хранении и пониженной способностью клубней к прорастанию по сравнению с растениями дикого типа. Пониженная способность клубней к прорастанию означает, что на клубнях трансформированных растений образуются ростки, которые имеют меньшую массу сырой ткани и массу в сухом состоянии по сравнению с ростками нетрансформированных растений. Экономическая выгода этого очевидна.

Следовательно, предметом изобретения также являются способы повышения устойчивости при хранении запасающих органов растений, отличающиеся тем, что активность цитрат-синтазы в клетках этих растений снижена, причем снижение активности предпочтительно достигается путем ингибирования экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих цитрат-синтазы.

Наиболее предпочтительными являются способы, в которых активность цитрат-синтазы понижают путем ингибирования экспрессии генов эндогенной цитрат-синтазы при использовании антисмысловой РНК.

Настоящее изобретение относится, в частности, к способам повышения устойчивости при хранении запасающих органов растений, отличающимся тем, что а) ДНК, комплементарную присутствующему в клетке гену цитрат-синтазы, стабильно интегрируют в геном клетки растения, б) указанную ДНК экспрессируют присущим ей образом или ее индуцируют путем комбинации с соответствующими элементами, контролирующими транскрипцию, в) экспрессию генов эндогенной цитрат-синтазы ингибируют в результате антисмыслового эффекта и г) растения регенерируют из трансгенных клеток.

Такие способы могут быть использованы в отношении всех типов растений, у которых развиваются запасающие органы, предпочтительно в отношении полезных сельскохозяйственных растений и наиболее предпочтительно в отношении некоторых видов зерновых культур (например, ржи, ячменя, пшеницы, кукурузы, риса и т.д.), некоторых видов фруктовых культур, овощных культур, растений, у которых образуются клубни, таких как, например, картофель или маниок, и растений, у которых образуются корнеплоды в качестве запасающих органов, в частности сахарной свеклы.

Предметом изобретения также являются способы получения трансгенных клубневых растений, клубни которых обладают пониженным прорастанием, отличающихся тем, что активность цитрат-синтазы в клетках этих растений снижена, причем снижение активности предпочтительно достигается путем ингибирования экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих цитрат-синтазы.

Наиболее предпочтительными являются способы, в которых активность цитрат-синтазы понижают путем ингибирования экспрессии генов эндогенной цитрат-синтазы при использовании антисмысловой РНК.

Настоящее изобретение относится, в частности, к способам получения трансгенных клубневых растений, клубни которых обладают пониженным прорастанием, отличающимся тем, что а) ДНК, комплементарную присутствующему в клетке гену цитрат-синтазы, стабильно интегрируют в геном клетки растения, б) указанную ДНК экспрессируют присущим ей образом или ее индуцируют путем комбинации с соответствующими элементами, контролирующими транскрипцию, в) экспрессию генов эндогенной цитрат-синтазы ингибируют в результате антисмыслового эффекта и г) растения регенерируют из трансгенных клеток.

Такие способы предпочтительно могут быть применены для получения трансгенных растений картофеля и маниока.

Указанное выше в отношении способа ингибирования образования цветков также применимо и к различным вариантам осуществления данных способов, в частности в отношении выбора и длины используемой последовательности ДНК, которая кодирует цитрат-синтазу, и выбора промотора.

В качестве альтернативы снижению активности цитрат-синтазы в клетках растений с использованием антисмыслового эффекта это снижение может также быть достигнуто путем введения последовательности ДНК, кодирующей рибозиму, которая специфично расщепляет транскрипты генов эндогенной цитрат-синтазы эндонуклеотидным образом. Рибозимы представляют собой каталитически активные молекулы РНК, которые обладают способностью расщеплять молекулы РНК в специфических последовательностях-мишенях. Применяя методы генетической инженерии, оказывается возможным изменять специфичность рибозим. Существуют различные классы рибозим. При практическом применении для целенаправленного расщепления транскрипта определенного гена предпочтительно используют представителей двух различных групп рибозим. Первая группа включает рибозимы, которые могут быть отнесены к интронам группы I рибозим. Вторая группа включает рибозимы, имеющие основную характерную структурную особенность - последовательность-мотив, так называемую "молотообразную головку". Специфическое распознавание молекулы РНК-мишени может быть модифицировано путем изменения последовательностей, прилегающих к последовательности-мотиву. Путем спаривания оснований последовательностей молекулы-мишени эти последовательности определяют сайт, в котором происходит каталитическая реакция и, следовательно, расщепление молекулы-мишени. Поскольку требования к последовательности для эффективного расщепления чрезвычайно низки, то в принципе представляется возможным получить специфические рибозимы для практически любой молекулы РНК.

Генетически модифицированные растения, у которых активность цитрат-синтазы существенно понижена, следовательно, также могут быть получены путем введения в растения и экспрессии рекомбинантной двухцепочечной молекулы ДНК, содержащей: а) промотор, функционирующий в растениях, б) последовательность ДНК, кодирующую каталитическую область рибозимы и "по соседству" с которой располагают последовательности ДНК, гомологичные последовательностям молекулы-мишени, и при необходимости в) функционирующий в растениях сигнал для прекращения транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

Под последовательности, определенные в п. б), подпадают, например, каталитическая область сателлитной ДНК вируса SCMo (Davies и др., 1990, Virology, 177:216- 224) или таковая сателлитной ДНК вируса TobR (Steinecke и др. , 1992, EMBO J., 11: 1525-1530; Haseloff и Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591).

Последовательности ДНК, расположенные по соседству с каталитической областью, образованы из последовательностей ДНК, которые гомологичны последовательностям генов эндогенной цитрат-синтазы.

Указанное выше для конструирования антисмысловых структур применимо и к последовательностям, указанным в п.п. а) и в).

Еще одним предметом настоящего изобретения является экспрессия в смысловой ориентации последовательностей ДНК, кодирующих протеины, обладающие ферментативной активностью цитрат-синтазы, в клетках растений, чтобы повысить активность этой цитрат-синтазы. Для этого последовательность ДНК, кодирующую цитрат-синтазу, сливают с промотором в смысловой ориентации, т.е. 3'-конец промотора связывают с 5'-концом последовательности, кодирующей ДНК. Это приводит к экспресии мРНК, кодирующей цитрат-синтазу, и, следовательно, к увеличению синтеза этого фермента.

Неожиданно было установлено, что в результате увеличения активности цитрат-синтазы в клетках трансформированных растений происходит изменение характера цветения по сравнению с нетрансформированными растениями. В частности, индуцируется образование цветков. Под этим в контексте настоящего изобретения понимают следующее: а) более раннее образование цветков (в этом случае это означает, что трансформированные растения зацветают раньше по сравнению с нетрансформированными растениями, как правило, раньше на несколько дней, предпочтительно раньше на одну или несколько недель), и/или б) увеличение образования цветков (в этом случае это означает, что трансформированные растения образуют больше цветков, предпочтительно по крайней мере на 10% больше цветков по сравнению с нетрансформированными растениями).

Такой эффект является желательным для ряда культивируемых и полезных растений, таких как некоторые виды овощных культур, например томаты, перец, тыква, дыня, огурец антильский, кабачок, рапс, некоторые виды зерновых культур, кукуруза или хлопчатник, и различных видов декоративных растений.

Еще одним предметом настоящего изобретения является, следовательно, применение последовательностей ДНК, кодирующих протеины, обладающие ферментативной активностью цитрат-синтазы, для индуцирования образования цветков у растений и способы индуцирования образования цветков у растений, отличающиеся тем, что активность цитрат-синтазы в клетках этих растений увеличена. Активность цитрат-синтазы увеличивают предпочтительно путем введения в клетки растений молекулы рекомбинантной ДНК, содержащей кодирующую область для цитрат-синтазы и приводящей к экспрессии цитрат-синтазы в трансформированных клетках.

Такие способы предпочтительно включают следующие стадии: а) стабильную интеграцию в геном растительной клетки ДНК, которая является гомологичной или гетерологичной таковой, присущей данному организму, и которая кодирует протеин, обладающий цитрат-синтазной активностью, б) экспрессию этой ДНК присущим ей образом или в результате индукции путем соединения с соответствующими элементами, контролирующими транскрипцию, в) увеличение вследствие этого активности цитрат-синтазы в клетках и г) регенерацию растений из трансгенных клеток.

Экспрессии ДНК, которая кодирует протеин, обладающий ферментативной активностью цитрат-синтазы, как правило, достигают путем интеграции в геном растений рекомбинантной двухцепочечной молекулы ДНК, включающей полигенный экспрессирующий кластер, имеющий следующие составляющие и экспрессирующий их: А) промотор, функционирующий в растениях, Б) последовательность ДНК, кодирующую цитрат-синтазу, которую сливают с промотором в смысловой ориентации, и при необходимости В) функционирующий в растениях сигнал для прекращения транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

Такие молекулы ДНК также являются предметом изобретения. Настоящее изобретение относится к таким молекулам ДНК, которые содержат указанные полигенные экспрессирующие кластеры в форме плазмиды pHS-mCS, которая содержит кодирующую область для цитрат-синтазы из S.cerevisiae, и плазмиды pEC-mCS, которая содержит кодирующую область для цитрат-синтазы из E.coli.

Кодирующие цитрат-синтазу последовательности ДНК, приведенные в п. а) указанного способа, могут быть как гомологичными или нативными, так и гетерологичными или чужеродного происхождения по отношению к растению-хозяину, которое должно быть трансформировано. Они могут иметь происхождение как из про-, так и из эукариот. Известны, например, последовательности ДНК, кодирующие цитрат-синтазу, из следующих организмов: Bacillus subtilis (U05256 и U05257), E. coli (V01501), R.prowazekii (М17149). P.aeruginosa (M29728), A. anitratum (M33037) (см. Schendel и др. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58: 335-345 и указанные в этом документе ссылки), Haloferax volcanii (James и др. (1992) Biochem. Soc. Trans. 20: 12), Arabidopsis thaliana (Z17455) (Unger и др. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 411-418), B.coagulans (M74818), C. burnetii (M36338) (Heinzen и др. (1991) Gene 109: 63- 69), M.smegmatis (X60513), T. acidophilum (X55282), T.thermophila (D90117), свинья (M21197) (Bloxham и др. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5381-5385), N.crassa (M84187) (Ferea и др. (1994), Mol. Gen. Genet. 242:105-110) и S.cerevisiae (Z11113, Z23259, M14686, M54982, X00782) (Suissa и др. (1984) EMBO J. 3: 1773-1781). Числа в скобках в каждом случае представляют собой регистрационные номера, под которыми указанные последовательности зарегистрированы в банке данных GenEMBL. Последовательности могут быть выделены из указанных организмов с помощью современных методов молекулярной биологии или могут быть получены искусственным путем.

Предпочтительный пример осуществления способа по настоящему изобретению включает применение последовательностей ДНК, кодирующих цитрат-синтазы, которые по сравнению с цитрат-синтазами, обычно встречающимися в растениях, являются дерегулируемыми или нерегулируемыми, т.е. их ферментативная активность не регулируется регуляторными механизмами, которые оказывают воздействие на активность цитрат-синтазы в клетках растений. Дерегулируемые означает, в частности, что эти ферменты не ингибируются в той же степени ингибиторами или не активируются активаторами, которые в норме ингибируют или активируют цитрат-синтазы растений. В контексте настоящего описания под нерегулируемыми цитрат-синтазами понимают такие цитрат-синтазы, которые не поддаются регулированию ингибиторами или активаторами в клетках растений.

Предпочтительно применяют прокариотные, в частности бактериальные последовательности ДНК, которые кодируют цитрат-синтазы, поскольку они обладают тем преимуществом, что протеины, которые кодируются этими последовательностями, не поддаются регулированию или слабо регулируются в клетках растений. Поэтому возможно, что увеличение активности цитрат-синтазы происходит вследствие экспрессии дополнительной цитрат-синтазы в клетках растений.

В предпочтительном примере осуществления указанного способа применяют последовательности ДНК из E.coli, которые кодируют протеин с цитрат-синтазной активностью, в частности ген glt A (Sarbjit и др., 1983, Biochemistry 22:5243-5249).

Еще один предпочтительный пример способа по настоящему изобретению относится к применению последовательностей ДНК из Saccharomyces cerevisiae, которые кодируют цитрат-синтазу, в частности к применению последовательностей ДНК, описанных у Suissa и др., (1984, EMBO J. 3: 1773-1781).

В случае, когда применяют последовательности ДНК растительного происхождения, предпочтительно используют последовательности ДНК, кодирующие протеин, имеющий одну из аминокислотных последовательностей, приведенных в Seq ID N 1, или Seq ID N 2, или Seq ID N 3, или практически идентичную аминокислотную последовательность. Также могут применяться более короткие последовательности ДНК, кодирующие только части аминокислотных последовательностей, приведенных в Seq ID N 1, или Seq ID N 2, или Seq ID N 3, при условии, что образовавшийся протеин гарантирует получение ферментативной активности цитрат-синтазы.

Наиболее предпочтительный пример осуществления относится к способу, в котором последовательность ДНК, кодирующая активность цитрат-синтазы, включает нуклеотидную последовательность, приведенную в Seq ID N 1, или Seq ID N 2, или Seq ID N 3, или практически идентичную нуклеотидную последовательность либо ее часть, причем эта часть является достаточно длинной, чтобы кодировать протеин, проявляющий цитрат-синтазную активность.

Кроме того, с помощью стандартных методов с использованием уже известных последовательностей ДНК, кодирующих цитрат-синтазу, могут быть выделены другие последовательности ДНК, которые кодируют протеины, обладающие активностью цитрат-синтазы, из любых организмов, предпочтительно из растений и прокариотных организмов. Эти последовательности также могут быть применены в способах по нас