Способ очистки гемоглобина в коммерческом масштабе

Способ очистки гемоглобина в коммерческом масштабе

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу хроматографического выделения гемоглобина. Сущность изобретения состоит в том, что способ выделения гемоглобина из водного раствора включает в себя пропускание сырого раствора в концентрации 0,1-20% на первой хроматографической стадии и проведение хроматографии либо в условиях анионообмена, либо в условиях катионообмена, при этом непрерывное пропускание осуществляют до почти полного насыщения колонки гемоглобинами и компонентами с более высоким сродством и производят дальнейшее непрерывное пропускание раствора до сверхнагрузки колонки с последующим замещением на ней гемоглобинов. Способ имеет также вторую хроматографическую стадию. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала способов очистки гемоглобина в коммерческом масштабе. 9 з.п.ф-лы, 9 табл., 10 ил. .

Это изобретение касается очистки гемоглобина хроматографией и, более конкретно, относится к хроматографическому процессу очистки гемоглобина в коммерческом масштабе, который приводит к получению раствора гемоглобина, содержащего не менее 99% растворенного вещества. Данное изобретение также относится к новым препаратам гемоглобина, имеющим неожиданные полезные свойства для использования в качестве заменителя крови.

Разработка гемоглобина, основного заменителя крови, продолжает привлекать коммерческое внимание, и недавние разработки показали, что гемоглобин из кровяных клеток млекопитающих после соответствующей модификации, такой как, например, внутримолекулярное поперечное связывание и, в некоторых случаях, полимеризация, является многообещающим средством в качестве основы кровезаменителя. Однако по мере развития этой возможности постоянно повышаются требования к чистоте гемоглобина. Одно время предполагалось, что гемоглобину необходимо только, чтобы он был свободен от стромы, - условие, которое достигается промывкой и мягким лизингом красных кровяных клеток (эритроцитов) с последующей фильтрацией лизата. Впоследствии было обнаружено, что присутствие следовых количеств примесей, таких как фосфолипиды, приводит к более специфичным реакциям, например, к сужению кровеносных сосудов. Даже после того, как препарат подвергался различным стадиям фильтрации, он все еще содержал недопустимо высокие следовые количества потенциально опасных примесей, таких, как ферменты эритроцитов, модифицированные и различные формы гемоглобина, фосфолипиды и поверхностные антигены.

Одной из наиболее важных проблем в области кровезаменителей, особенно в области переносчиков кислорода на основе гемоглобина, является разработка эффективных процессов для рациональной и экономичной очистки гемоглобина в коммерческом масштабе. Этот препарат должен быть конкурентоспособным с другими потенциальными веществами, используемыми для увеличения объема плазмы, крови, и жидкостями, переносящими кислород, которые предлагаются в качестве кровезаменителей.

В то время как степень разделения и время анализа являются важными характеристиками в аналитическом выделении, решающими параметрами в препаративной хроматографии для использования в коммерческом или полукоммерческом масштабе являются следующие параметры: - количество вещества, выделенного в единицу времени, с определенным уровнем чистоты (пропускная способность), и - экономические характеристики процесса, такие как размер колонки, среда, буферные растворы, оборудование, рецикл и повторное использование компонентов, реагентов и т.п.

Методы очистки гемоглобина, которые бы отвечали критериям экономически эффективного способа получения, отсутствуют в литературе.

Кровезаменитель на основе гемоглобина требует либо единственной формы гемоглобина, либо, если присутствует более чем одна форма, - тщательного контроля состава известных форм гемоглобина. Таким образом, успешный способ очистки является необходимым для того, чтобы отделить одну форму гемоглобина от другой, а также для отделения требуемой формы гемоглобина от загрязняющих компонентов красных кровяных телец, таких, как ферменты эритроцитов, белки, фосфолипиды и антигены.

Хроматографические методы применялись для очистки растворов гемоглобина. В патенте США 4925474, Hsia и др. описывается техника аффиной хроматографии для очистки гемоглобина с использованием колонок, в которых лиганд, имеющий преимущественное химическое сродство к DPG-участку гемоглобина, связывается со стационарной фазой колонки.

Для очистки гемоглобина применялась также техника ионнообменной хроматографии. Основные принципы ионнообменной хроматографии хорошо известны. Смесь различных веществ в растворе наносится на соответствующим образом приготовленную ионнообменную колонку. Каждое из веществ в смеси имеет различное сродство к химическим реакционноспособным группам колонки. Изменяя условия на колонке, например pH раствора, отдельные вещества могут связываться или элюироваться с колонки избирательно, так чтобы отделить индивидуально одно из веществ из смеси. Применение этой техники для очистки белков, таких как гемоглобин, экономически невыгодно, за исключением случаев использования в малых масштабах и аналитических работах. Для очистки гемоглобина в промышленном масштабе для использования, например, в качестве переносчика кислорода в реанимационных растворах (кровезаменитель) эта техника для стандартного применения является нерациональной. Количество гемоглобина, которое требуется абсорбировать и затем элюировать из хроматографической колонки, так велико, что требуемые размеры колонки становятся невыполнимо большими и дорогими.

Christensen и др. , J.Biochem. Phys. 17 (1988), 143-154, описал хроматографическую очистку человеческого гемоглобина. Используемая методология представляет собой стандартный способ ионнообменной хроматографии и не дает возможности для экономичного производства на промышленном уровне.

Winslow и Chapman "Приготовление растворов гемоглобина в опытном масштабе", Methods in Enzymology (Pilot-scale Preparation of Hemoglobin Solutions), vol. 231, p3 (1984) описали получение стромсвободного гемоглобина (SFH), высокоочищенного гемоглобина Ао и поперечносвязанного гемоглобина, используя в качестве исходного материала устарелую человеческую кровь. SFH был получен фильтрацией. Гемоглобин Ао был получен из SFH хроматографией в крупном масштабе, используя сильную ионообменную среду и градиент высокой ионной силы.

Как Christensen и др. , так и Winslow и Chapman описанные выше работы выполняли в институте Letterman Army Institute for Research (LAIR), известном сейчас под названием Walter Reed Army Institute of Research.

В патенте США 5084588, Rausch и Feola (Biopure) описывается применение стандартного анионо- и катионообменного метода хроматографии для разделения и очистки гемоглобина. В случае анионообменной хроматографии в этом патенте приводится три стандартных подхода: а) связывание Hb при повышенном pH и элюция градиентом с понижающимся pH или ступенчатым градиентом с более низким значением pH, б) связывание Hb при высоких pH, низкой ионной силе и элюция солевым градиентом, в) нагрузка со значениями pH, при которых гемоглобин не связывается с анионообменником и не задерживается на колонке, в то время как примеси (более кислые примеси) задерживаются на колонке.

Методы а) и б) подробно описаны, но они не подходят для производства в большом масштабе из-за ограничений, связанных с низкой емкостью, не позволяющей достигнуть достаточного разделения продуктов гемоглобина. Эта нагрузка обычно составляет 20-30 мг/мл и вынуждает применять недопустимо большие и дорогие колонки для очистки гемоглобина в коммерческом масштабе. Например, для одной дозы в 50 мг конечного переносчика кислорода на основе гемоглобина (HBOC) потребовалась бы колонка объемом 1,5-2,5 л.

Хотя подход в) кажется более рациональным, он дает на практике немодифицированный гемоглобин взрослого нормального человека Ао, который по своим хроматографическим свойствам и содержанию некоторых основных примесей, таких как HbAlc, не представляется удовлетворительным для практического применения.

Стандартные подходы катионообменной хроматографии для очистки гемоглобина млекопитающих имеют аналогичные ограничения.

В патенте США 5084588 также описывается получение растворов бычьего гемоглобина, в которых более чем 99,9% белка присутствует в виде бычьего гемоглобина, но в этом патенте не представлены данные по определению белковых компонентов.

Объект настоящего изобретения представляет собой новый хроматографический способ очистки гемоглобина.

Другим объектом настоящего изобретения является хроматографический способ, дающий в коммерческом масштабе и в экономически доступной форме гемоглобин в водном растворе с чистотой более 90% из загрязненного водного раствора, в котором содержится не менее 60% гемоглобина.

Еще одним и более специфическим объектом настоящего изобретения является получение водного раствора гемоглобина или поперечносвязанного гемоглобина в коммерческих количествах, в котором гемоглобин или поперечносвязанный гемоглобин составляет не менее 99% растворенного вещества, и их использование в указанной степени чистоты в качестве кровезаменителя с проявленными in vivo свойствами ранее не было описано.

Настоящее изобретение представляет собой способ, посредством которого водный раствор образцов предварительно разделенного гемоглобина (Hb) с содержанием Hb от 60 до 99% растворенного вещества подвергается ионообменной хроматографии в две стадии. Одной из стадий является анионообменная хроматография и другой - катионообменная хроматография. Эти два вида ионообменной хроматографии могут быть проведены в любом порядке. Сырой раствор предварительно разделенных образцов гемоглобина, например, HbAо, является сырьем для первой стадии хроматографии, например анионообменной хроматографии, в условиях, при которых все составные части смешанного растворенного вещества первоначально адсорбируются на твердой фазе хроматографической колонки. Для анионообменной хроматографии требуются относительно высокие значения pH. Условия также подобраны таким образом, что достигается очень эффективная нагрузка на колонку благодаря использованию исходного раствора с низкой ионной силой, что приводит к такой ситуации, в которой практически все доступные участки твердой хроматографической фазы заполняются веществами из исходного раствора. Собранный на этой стадии элюат не содержит белкового продукта. Замещение HbAо и примесей с низким сродством к колонке при выбранных условиях достигается затем нагрузкой дополнительных объемов водного исходного раствора, как описано выше. В достигнутых условиях, называемых здесь условиями перегрузки, примеси с более высоким сродством к колонке замещаются гемоглобином, а примеси с меньшим сродством элюируются из колонки. Если первой стадией хроматографического разделения является анионообменная хроматография, то примеси с большей кислотностью, чем выделяемые образцы гемоглобина, адсорбируются на твердой фазе хроматографической колонки и отделяются здесь от образцов Hb, которые появляются в элюате среди других более основных примесей. В том случае, когда в качестве первой стадии выбирают катионообменную хроматографию, более основные примеси отделяются от более кислотных примесей и образцов Hb, которые находятся в элюате, благодаря более высокому сродству первых в колонке.

Затем на второй хроматографической стадии данного способа изобретения проводится второй ионообменный процесс частично очищенных образцов Hb, содержащихся в элюате первой колонки, в условиях различных значений pH. Когда элюат из первой колонки содержит образцы гемоглобина и более основные компоненты, вторая стадия хроматографии является катионообменной хроматографией, и наоборот. Снова производится подача этого загрязненного раствора на вторую колонку, пока не достигается насыщающая и более высокая нагрузка, с тем чтобы создать условия перегрузки в колонке. В условиях перегрузки образцы предварительно разделенного гемоглобина элюируются с колонки путем замещения, осуществляемого примесями с большим сродством в выбранных условиях, и затем собираются в элюате второй колонки с высокой степенью чистоты. Способ изобретения можно в большинстве случаев называть "выполняемой в две стадии самозамещающей хроматографией".

В результате образцы Hb элюируются из колонки в исключительно чистом виде, обычно при более чем 90% чистоты и с коммерчески приемлемым выходом. Примеси более кислотные, чем разделенные образцы Hb, остаются связанными на одной смоле колонки, а более основные - на другой. Колонки могут быть легко регенерированы с использованием традиционных очищающих и регенерирующих методов.

Важнейшим фактором успешного проведения этого способа, особенно в большом, промышленном масштабе, являются селективные с высокой степенью нагрузки колонки по отношению к примесям, позволяющие элюировать образцы Hb.

Когда способ изобретения применяется для очистки человеческого гемоглобина Ао, производится новый вид человеческого гемоглобина, имеющий состав и свойства, не описанные ранее в литературе. Этот препарат гемоглобина составляет соответственно другой аспект настоящего изобретения, независимый от описанного здесь способа очистки. Этот продукт обладает высокоценными свойствами и характеристиками, ранее необнаруженными и неописанными в связи какими-либо препаратами человеческого гемоглобина Ао и особенно полезными при их использовании в качестве основы кровезаменителя. Среди этих свойств важным является полное отсутствие вирусных частиц, особенно липидных частиц инкапсулированных вирусов, полное отсутствие вазоактивности при его введении in vivo, отсутствие токсичности по отношению к эндотелиальным клеткам при инкубации in vitro, о чем свидетельствует пониженное высвобождение лактатдегидрогеназы в сравнении с подобным введением других препаратов гемоглобина. В добавление, что касается стандартных необходимых свойств гемоглобина для использования в качестве кровезаменителя, таких как отсутствие эндотоксинов и других пирогенов, продукт настоящего изобретения также имеет улучшенные свойства по сравнению с другими препаратами гемоглобина.

Сопроводительные чертежи Фиг. 1 является графической иллюстрацией первоначальной ионообменной части предпочтительного способа настоящего изобретения.

Фиг. 2 является подобной иллюстрацией второй, катионной части предпочтительного способа настоящего изобретения.

Фиг.3 представляет собой аналитическую анионообменную хроматограмму, полученную по результатам примеров 2 и 3, приведенных ниже.

Фиг.4 представляет собой аналитическую анионообменную хроматограмму, полученную по результатам примера 4, приведенного ниже.

Фиг. 5 является графическим представлением результатов примера 8, приведенного ниже.

Фиг. 6 является копией бумажной полоски при анализе изоэлектрического фокусирования продукта примера 13, приведенного ниже.

Фиг.7 является копией результатов эксперимента по окрашиванию и блотированию, описанных в примере 13.

Фиг.8 графически представляет результаты примера 14, приведенного ниже.

Фиг. 9 и 9а графически представляют результаты примера 15, приведенного ниже.

Фиг.10 графически представляет результаты примера 16, приведенного ниже.

Заместительная хроматография или заместительная элюция, как это обычно называется, - известный метод в области разделения белков. Это один из трех методов, по которому образцы веществ выделяют из хроматографической колонки. Когда этот метод применяют для разделения соответствующих белков из раствора их смеси, белки с более высоким сродством будут замещать на матрице белки с меньшим сродством, так чтобы иерархия белков в заместительном порядке по сродству устанавливалась сверху в пределах колонки от входа до выхода. Когда белки замещают другие белки, отчетливая линия разделения между образцами белков образуется редко. Потому применение этой техники для получения высокоочищенного раствора единственного белка, такого как гемоглобин, является неприемлемой. Если для разделения выбирают небелковые вещества, то в результате хроматографическая матрица будет связана с веществами, имеющими очень высокое сродство, и носитель будет трудно регенерировать для повторного использования.

Основным промышленным использованием предложенного способа является получение очищенного гемоглобина взрослого человека Ао (HbAо) и таким образом оно будет в основном описано с включением литературных ссылок. Данный способ, однако, не ограничивается очисткой HbAо, но дополнительно применим и для других предварительно разделенных образцов гемоглобинов, таких как производные избирательно поперечносвязанного гемоглобина, отдельные виды бычьего гемоглобина, другие виды гемоглобина, такие как гемоглобин плода, серповидноклеточный гемоглобин и т.д., генноинженерный гемоглобин и т.д.

Способ данного изобретения чрезвычайно экономически выгоден при использовании для очистки HbAo в промышленном масштабе для производства кровезаменителей. Он обеспечивает особо высокоэффективную емкость колонки. Способ позволяет, следовательно, использовать колонки с относительно малыми размерами для очистки относительно больших объемов загрязненного раствора гемоглобина. Он может проводиться периодически или непрерывно для очистки данной партии раствора гемоглобина, полученной из красных кровяных телец (эритроцитов) по стандартной процедуре, растворов, обычно содержащих порядка 80% гемоглобина, но которые содержат обычно широкий набор примесей, как белковоподобных, так и небелковых. Более того, загрязненный раствор гемоглобина сам используется как средство замещения. При этом исключается обеспечение и использование различных вытеснителей с их неудобствами в обслуживании, сложностью и дороговизной.

Типичный общий способ для получения очищенного раствора HbAo, включающий методику настоящего изобретения, начинается с нормальных красных кровяных телец (эритроцитов) взрослого человека. Их объединяют и подвергают фильтрации для удаления лейкоцитов. Клетки промывают для удаления белков сыворотки и лизируют, чтобы экстрагировать гемоглобин и другие клеточные компоненты. Лизат фильтруют, чтобы удалить мембраны красных кровяных телец (эритроцитов), и затем образующийся раствор гемоглобина диафильтруют и концентрируют. Загрязненный экстракт гемоглобина обрабатывают окисью углерода для образования CO-Hb- комплекса и нагревают для пастеризации, тем самым инактивируя примеси вирусов в растворе. Эта смесь затем центрифугируется и фильтруется для удаления дальнейших остатков и клеточных осколков. После этого раствор подготовлен к осуществлению самозаместительного способа настоящего изобретения.

По предпочтительному осуществлению данного изобретения первой стадией хроматографического процесса является анионообмен, а второй - катионообмен. Первый анионообменный процесс проводят при высоких pH, например pH 7-10, и предпочтительно при pH 8,5 - 9,0 и в условиях низкой ионной силы, т.е. низкой удельной проводимости. Соответственно проводимость составляет менее 3 мСм (mS - миллиСименс) и предпочтительно менее 1 мСм. Такие условия определяют необходимость бессолевого буфера. Целевые образцы HbAo в этих условиях первоначально связываются со средой колонки вместе с другими веществами. Когда снабжение колонки загрязненным раствором HbAo продолжается, те вещества, которые проявляют более высокое сродство к матрице, чем NbAo, чаще всего более кислотные примеси, постепенно замещают HbAo и более основные примеси из колонки. В конце концов достигается сверхнагрузка колонки, так что весь HbAo и более основные примеси замещаются, оставляя связанными только более кислотные примеси. В большинстве случаев эта нагрузка в избытке превышает нагрузку колонки, рекомендуемую производителем. Таким образом, на этой стадии достигается хроматографическое разделение более кислых примесей от HbAo.

Снабжение загрязненным раствором гемоглобина проводится с низкой линейной скоростью потока, не выше 10 см/мин и предпочтительно 1 см/мин. Такая скорость допускает установление кинетического равновесия на колонке. Концентрация поступающего раствора не является решающим фактором, но подходящей является концентрация в пределах 0,1-20%, предпочтительно 2-7%.

Достижение сверхнагрузки может контролироваться анализом вытекающего из колонки раствора - когда он совсем не содержит или содержит только следы кислотных примесей, то достигается максимум практической нагрузки колонки.

Фиг. 1 сопутствующих чертежей иллюстрирует с помощью диаграмм часть анионообменного способа настоящего изобретения. Ионообменная колонка, имеющая химические группы -N+R3 (обычно анионообменная смола), показанная на стадии А этого способа на фиг. 1, снабжается раствором, содержащим смесь веществ, изображенных звездочками, для более кислотных примесей, эллипсы представляет собой HbAo и прямоугольники - более основные примеси. На стадии нагрузки, стадия В, в основном все активные химические группы N-R3 связываются электростатически с одним из веществ, содержащихся в смеси.

Наносят дополнительное количество того же раствора с тем, чтобы нагрузка на колонку достигла условий сверхнагрузки, что показано на фиг. 1, стадия С. Затем все более основные примеси (прямоугольники) и некоторые HbAo (эллипсы) замещаются оттуда более кислотными компонентами (звездочки), которые проявляют более высокое сродство к колонке при этих условиях. Продолжают снабжать дополнительным количеством этого раствора до сверхнагрузки колонки, достигая стадии D, показанной на фиг.1, на которой кислотные вещества замещают в основном весь HbAo из колонки благодаря их более высокому сродству в выбранных условиях. В этом случае вытекающая из колонки жидкость в основном не содержит кислотных примесей. Таким образом получают достаточно чистый раствор HbAo, но он еще содержит некоторое количество основных веществ.

Вторая стадия предпочтительного способа настоящего изобретения использует катионообменную колонку, и на нее наносят элюат с первой колонки в подобных условиях сверхнагрузки. Целевой HbAo и другие нежелательные более основные примеси связываются в сверхнагрузочных количествах. Частично очищенный раствор гемоглобина с первой колонки продолжает насыщать вторую колонку. Снова используется относительно низкая скорость пропускания раствора (10 см/мин или менее предпочтительно 1 см/мин), допускающая установление кинетического равновесия между твердой и жидкой фазой в элюате с первой колонки. Поддерживают pH 5-9, предпочтительно pH 6,5-8,5 и наиболее предпочтительно pH 7-8 перед нанесением элюата на катионообменную колонку. Используют раствор с низкой ионной силой, т.е. удельная проводимость меньше 3 мСм (mS - миллиСименс), предпочтительно менее 1 мСм. Удельная проводимость 2,5 мСм полезна только в случае очень низкой скорости потока и очень высокого разбавления используемого раствора. Снова используются условия сверхнагрузки. Белковоподобные примеси с большим сродством, т.е. более основные, чем HbAo, замещают HbAo на колонке, и, таким образом, HbAo элюируется и возвращается в исключительно чистом виде.

Фиг. 2 сопутствующих рисунков показывает с помощью диаграмм, подобно фиг. 1, часть способа, осуществляемого на катионообменной смоле, содержащей SO3-группы. Элюат с первой колонки после доведения до соответствующего pH наносится на колонку и первоначально в стадии А колонка насыщается как HbAo (эллипсы), так и более основными примесями (прямоугольники), путем электростатического связывания с химическими группами колонки. Хотя эти группы изображены как сульфогруппы, но равным образом могут быть выбраны и другие возможности, такие как карбоксильные группы. Нанесение элюэнтного раствора на колонку продолжают до достижения условий сверхнагрузки, показанное на фиг. 1, стадия В, в которой более основные примеси благодаря их большему сродству к колонке в этих условиях замещают HbAo на колонке. При продолжении нанесения раствора до сверхнагрузки колонки, как показано на фиг. 2, стадия С, почти 100% чистого HbAo замещается таким образом и находится в растворе в качестве элюанта с колонки. Соответственно, чем выше нагрузка колонки, тем выше процентное содержание полученного очищенного HbAo с колонки. Элюат анализируется для того, чтобы определить присутствие основных примесей (прямоугольников) в нем. Когда при замещении на колонке больше не обнаруживается HbAo, в этой точке определяют максимум ее нагрузки.

Используемый здесь термин "более основные примеси" относится к тем примесям, которые элюируются с колонки при более высоком pH, чем требуется для элюирования HbAo. В противоположность этому термин "более кислотные примеси" относят к тем примесям, которые элюируются с колонки при более низких pH, чем требуется для элюирования HbAo. В предпочтительном способе согласно данному изобретению, в котором первой проводится анионообменная хроматография, более основные примеси элюируются перед HbAo, а более кислотные примеси - после HbAo. В зависимости от использования ионообменной среды для хроматографии могут быть рассмотрены различные кривые элюции с незначительными отклонениями в порядке элюции.

Как для первой, так и для второй колонки скорость потока неочищенного раствора гемоглобина должна быть оптимизирована для избирательного концентрирования этого раствора. Линейная скорость потока 1 см/мин или меньше является оптимальной для растворов гемоглобина в концентрации 2-7%. Скорость потока выше 2 см/мин может успешно применяться для разделения более разбавленных растворов, например, менее чем 1%Hb. Ha разделение ионообменной хроматографией при низкой степени нагрузки обычно не влияет линейная скорость потока, однако для способа настоящего изобретения кинетическое равновесие в процессе хроматографии сильно зависит от скорости потока. Концентрация наносимого раствора не является решающей на любой стадии.

По методу заместительной хроматографии настоящего изобретения, используя сначала анионообменную хроматографию для удаления более кислотных компонентов и затем катионообменную хроматографию для удаления более основных примесей, можно достигнуть высокого выхода исключительно чистого HbAo, в основном полностью свободного от заметных количеств других белков, таких как сывороточные и мембранные белки, в промышленном масштабе. Чистота по данным аналитической анионообменной хроматографии составляет 99% и обычно более 99,5%. Эффективность процесса, по крайней мере, на порядок выше, чем при обычном хроматографическом подходе. Кроме удаления белковоподобных примесей, способ настоящего изобретения позволяет также исключительно полно удалить модифицированные и другие нежелательные формы гемоглобина, давая высокочистый HbAo (99,5%). Кроме того, как описано более детально ниже, может быть достигнуто практически полное удаление инкапсулированных вирусных частиц, как активных, так и неактивных.

Преимущества масштабности способа настоящего изобретения по сравнению со способом, использующим стандартную ионообменную хроматографию с адсорбцией-элюцией, показаны в табл. 1. Цифры в колонке "самозамещение" получены из рабочего примера способа данного изобретения, описанного ниже. Цифры в колонке "адсорбция- элюция" получены из вышеупомянутой статьи Winslow и др.

Из анализа этих цифр ясно, что самозаместительная хроматография по способу настоящего изобретения может быть проведена быстрее с достаточно небольшими колонками. Она может проводиться при низком давлении и температурах окружающей среды. Эффективная емкость может быть достигнута в 10-20 раз выше, чем емкость, сообщенная для стандартных хроматографических методов, давая возможность использования колонок с относительно небольшим объемом. Это приводит к снижению потребности в воде, уменьшаются отходы и потребность в буферных растворах, все это заметно улучшает промышленную экономику данного способа.

Очищенный раствор гемоглобина, представляющий собой элюат катионообменной колонки, может быть диафильтрован в выбранный буфер и доведен до необходимой концентрации HbAo.

В способе настоящего изобретения выбор материала ионообменного геля в качестве стационарной фазы не является решающим. Выбор может быть сделан успешно в пределах современного уровня науки. Здесь могут быть использованы любые из обычных коммерчески доступных гелей такого типа при условии, что они могут быть успешно дериватизированы для использования в ионообменном методе в условиях селективного сродства для веществ, которые будут разделяться. Общие классы носителей для ионообменных средств включают в себя макропористые, макросетчатые и непористые дивенилбензол - поперечносвязанные полистиролы или полиметакрилаты, полиалкиленамины, целлюлозы, агарозы, двуокись кремния, керамику, стекло, окись алюминия, металлические частицы и др. Коммерчески доступные носители включают те, которые продаются под торговыми марками POROS, Fractogel, Huper D, Dowex, Amberlite, Duolite, Bio-Rex, Chelex, Sephadex, Sepharose, Toyopearl, Macro-prep, Bio-protocol, Accell, Monotypes и др. Функциональные группы, привязанные к таким носителям для целей ионного обмена, включают сульфонат, сульфопропил, карбоксиметил, карбоксилат, фосфо, четвертичный амин, четвертичный аминоэтил, диметиламиноэтил, полиэтиленамин, триметиламиноэтил, диэтиламиноэтил, аспартамид и др.

Способ данного изобретения может также работать для получения раствора гемоглобина не менее 99% чистоты и неожиданно свободного от вирусных частиц, активных или неактивных, особенно липидных инкапсулированных вирусов, таких как ВИЧ, герпес, симплекс-вирус (HSV), вирус бычьей диареи, который во многих случаях является моделью для вируса человеческого гепатита С.

Это некоторые из наиболее серьезных и опасных вирусных примесей крови. Это очень важное дополнительное достижение, которое было получено при использовании настоящего изобретения, и это достижение не могло быть предсказано до того, как этот способ был испытан и результаты проанализированы. Хотя предпочтительный процесс согласно данному изобретению включает стадию пастеризации для инактивации вирусов до очистки, как описано выше, но достижение возможности удаления вирусных частиц как части способа очистки представляется особенно ценным. Способ дает возможность удалять из кровезамещающих материалов различные активные вирусные частицы, которые могут сохраняться при пастеризации, и какие-либо остаточные неактивированные вирусные частицы. Все это может быть достигнуто без использования какой-либо дополнительной специфической стадии удаления вирусных частиц и без добавления каких-либо специальных реагентов или чего-то подобного для удаления вирусов. Может быть достигнуто исключительно полное удаление липидных инкапсулированных вирусов. Было также достигнуто заметное снижение количества других вирусов.

Насколько это известно заявителю, препараты гемоглобина настоящего изобретения имеют более высокую степень чистоты, чем ранее описанные препараты. Возможно, благодаря их необычно высокой степени чистоты или, возможно, благодаря другим, еще не полностью объясненным факторам, продукты данного изобретения проявляют неожиданные и высокополезные свойства, ранее не описанные для препаратов гемоглобина, по крайней мере, для препаратов, производимых в большом масштабе.

Точнее говоря, продукты настоящего изобретения, HbAo, свободны от всех белков мембраны красных кровяных телец (эритроцитов), как показано с помощью изоэлектрического фокусирования и иммунноблот-анализа. Следовые количества человеческого сывороточного альбумина (HSA) на уровне менее чем 4 мкг и обычно 2-4 мкг HSA/100 мг Hb присутствуют в препаратах, как обнаружено с помощью иммуноабсорбционных методов. Единственными другими определяемыми белками, которые иногда обнаруживаются в продуктах изобретения, являются фрагменты альфа- и бета-глобиновых цепей гемоглобина, и они не превышают 1 мкг на 100 мг гемоглобина. При этом чрезвычайно высоком уровне чистоты продукт настоящего изобретения является необычным и проявляет неожиданные свойства, описанные ниже. Одно из них - снижение или отсутствие сосудосуживающей активности. Другое свойство - отсутствие токсичности по отношению к культивируемым эндотелиальным клеткам.

Описанные ранее высокоочищенные гемоглобины, как поперечносвязанные, так непоперечносвязанные, давали при вливании прессорную реакцию [1,2]. Поскольку продукты, по-видимому, были достаточно высокоочищенными, существующие теории полагали, что здесь, должно быть, проявляются собственные свойства самого гемоглобина, который является за это ответственным. В частности, предполагали, что гемоглобин связывается оксидом азота, который вызывает этот эффект. Оксид азота, называемый также эндотелийобразующим релаксирующим фактором, является мощным вазодилатором, синтезируемым эндотелиальными клетками при помощи синтазы оксида азота как посредника. Поскольку молекула гемоглобина будет связывать оксид азота с высокой степенью сродства, то было постулировано и в настоящее время общепринято, что внутривенное введение раствора гемоглобина, особенно растворов непоперечносвязаного гемоглобина, будет удалять оксид азота и вызывать гипертензивный эффект с сужением кровеносных сосудов.

Обнаружение того, что продукты настоящего изобретения не проявляют вазопрессорной активности в моделях изоволемического обмена и геморрагического шока, явилось также полной неожиданностью, так как противоречит современным теориям и мнениям в отношении присущих гемоглобину свойств. Настоящее изобретение наводит на мысль, что это не собственное свойство гемоглобина, которое обуславливало его сосудосуживающую активность (как сообщалось ранее), но, по крайней мере, частично связано с примесями, которые присутствуют в очень малых количествах и которые не были ранее успешно удалены, несмотря на сообщения об очень высоком уровне чистоты гемоглобинов, описанных ранее.

Преимущества отсутствия вазопрессорной активности продуктов настоящего изобретения сохраняются в поперечносвязаных и полимеризованных гемоглобинах, полученных из продуктов настоящего изобретения, например, с помощью способа, описанного в заявке США N 08/231945, апрель 21, 1994.

Кроме того, продукт настоящего изобретения проявляет более высокую степень снижения токсичности по отношению к эндотелиальным клеткам при введении in vivo, чем ранее описанные гемоглобины. Исследования с ранее описанными растворами оксигемоглобина, включая хроматографически чистые гемоглобины, показали наличие клеточных повреждений, на что указывает заметное увеличение лактатдегидрогеназы в эндотелиальных клетках культуральной среды по сравнению с его уровнем в среде контрольной эндотелиальной клеточной культуры. Лактатдегидрогеназа является маркером клеточного повреждения. Снова было постулировано и признано, что эта токсичность есть собственное свойство оксигемоглобина, поскольку испытуемые растворы содержали оксигемоглобин высокой степени очистки [3].

Неожиданно было обнаружено, что гемоглобин согласно настоящему изобретению не является посредником в высвобождении лактатдегидрогеназы. В противоположность гемоглобину настоящего изобретения, при инкубировании эндотелиальных клеток с растворами гемоглобина, не содержащих стромы и очищенных другими хроматографическими способами, было отмечено значительное повышение высвобождения лактатдегидрогеназы.

Вообще важно и очевидно, что любой кровезаменитель и любой компонент или сырье для кровезаменителя должен быть достаточно очищенным, так чтобы он был свободен от вредных примесей. Ранее такими признанными вредными примесями считались клеточная строма, эндотоксины и другие пирогены, негемоглобиновые белки, фосфолипиды и т. п. Было сообщено, что прежние кровезаменители "свободны в основном" от одной и более таких примесей. Однако термин "свободен в основном" является относительным субъективным термином, интерпретация и ограничения которого зависят от способа определения соответствующих параметров, и он использовался для описания предшествующего уровня техники. В резуль