Нуклеозиды с модифицированными сахарами и олигонуклеотиды

Нуклеозиды с модифицированными сахарами и олигонуклеотиды

Реферат

 

Описываются новые нуклеозиды с модифицированными сахарами общей формулы (I), где значения R'₁, R₁-R₅, R'₅, R'₃, X, В указаны в п.1 формулы изобретения. Возможно применение данных олигонуклеотидов с модифицированной сахарной составляющей в качестве антисмысловых терапевтических средств, поскольку предполагается, что они обладают повышенной устойчивостью к нуклеазам и поглощением клетками, при этом сохраняя специфичность и сродство к последовательности нуклеиновых кислот-мишеней in vitro или in vivo. Описываются также олигонуклеотиды. 4 c. и 16 з.п. ф-лы, 14 ил.

Областью данного изобретения являются аналоги полинуклеотидов, содержащие модифицированные сахара.

Предпосылки изобретения Терапевтическое применение олигонуклеотидов является очень важной областью и описано, например, в (1) Zamecnik Р.С. and Stephenson M.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1978), 75, 280, 285; (2) Uhlmann E. and Peyman A. Chemical Reviews (1990), 90, 543-584; (3) Goodchild J. Bioconjugate chemistry (1990), 1, 165-187; и (4) Crooke S.T. and Lebleu B. "Antisense Research and Applications", CRC Press (1993). Специфическое связывание антисмысловых полинуклеотидов с представляющими интерес ДНК- или РНК-мишенями может вызывать потерю функций, связанных с ДНК или РНК, таких как репликация, транскрипция или трансляция, обеспечивая, таким образом, механизм контроля таких заболеваний, как рак и вирусная инфекция. Вследствие этого связывание антисмысловых олигонуклеотидов с мишенью может быть применено для изменения генной экспрессии во многих случаях, например для вмешательства в жизненные циклы вирусов или рост раковых клеток (Stein С.A., Cheng Y.C. Science (1993), 261, 1004-1012). Кроме этого, некоторые олигонуклеотиды хорошо связываются с белковыми мишенями, действуя таким образом как ингибиторы ферментов. Bock и др. описывают олигонуклеотиды, ингибирующие катализируемое тромбином человека образование фибриновых сгустков in vitro (Bock L.C., Griffin L. C. , Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Nature (1992), 355, 564-566). Ecker и др. описывают различные олигонуклеотиды, ингибирующие симплекс вирус герпеса человека в количествах менее 1,0 мкмоля. Полинуклеотиды, обладающие свойствами ингибиторов ферментов, могут без труда быть выявлены с помощью комбинаторной технологии (Ecker D.J., Vickers T.A., Hanecak R., Driver V., Anderson К. Nucleic Acids Res. (1993), 21, 1853-1856).

Сообщалось, что олигонуклеотид, содержащий 5'-C-метил-разветвленный нуклеозид, показывает повышенную устойчивость к нуклеазам (Saha А.К. et al., poster in 206th ACS Meeting, Chicago, 1993). Сообщалось, что олигонуклеотид, содержащий 2'-O-метилнуклеозиды, также обладает улучшенной стабильностью в отношении действия нуклеаз и повышенным сродством к РНК (a. Inoue Н., Hayase Y. , Imura A., Iwai S., Miura K., Ohtsuka E. Nucleic Acids Res. (1987), 15, 6131; b. Shibahara S., Mukai S., Morisawa H., Nakashima H., Cobayashi S., Yamamoto N. Nucleic Acids Res. (1989), 17, 239). Сообщалось, что олигонуклеотид, содержащий 1'-замещенный нуклеозид, обладает некоторой устойчивостью к нуклеазам (Ono А., Dan А., Matsuda A. Bioconjugate Chemistry (1993), 4, 499-508).

Кроме наличия специфического сродства к комплементарной полинуклеотидной последовательности-мишени антисмысловые олигонуклеотиды хорошо удовлетворяют требованиям, необходимым для терапевтического применения, таким, например, как эффективность действия, биологическая доступность, низкая токсичность и низкая стоимость. Поскольку олигонуклеотиды, имеющие природный фосфодиэфирный остов, подвержены действию нуклеаз и с трудом проникают через клеточную мембрану, исследователи предприняли попытки осуществить его модификации, улучшающие устойчивость к действию нуклеаз и поглощение олигонуклеотидов клеткой. Главный недостаток аналогов олигонуклеотидов, используемых в качестве антисмысловых, заключается в том, что модифицированные межнуклеотидные связи исключают активацию ими РНКазы H, расщепляющей цепь РНК, с которой связан аналог олигонуклеотида. В связи с этим желательно получение таких полинуклеотидных аналогов, которые обладали бы повышенной устойчивостью к действию нуклеаз и клеточной поглощаемостью, сохраняя способность активировать РНКазу Н.

Краткое описание изобретения Настоящее изобретение охватывает различные новые модифицированные по сахарной составляющей нуклеозиды и соответствующие модифицированные по сахарной составляющей олигонуклеотиды, обладающие свойствами, превосходящими свойства природных РНК- и ДНК-олигонуклеотидов при использовании их в качестве антисмысловых, в диагностике или для других целей.

Соединения по изобретению включают различные нуклеозиды, которые модифицировали таким образом, что они содержат замещения в положениях C1', C3', C4' или C5' сахарной составляющей нуклеозида.

Другой аспект данного изобретения заключается в получении олигонуклеотидов, содержащих один или более нуклеозид с модифицированной в соответствии с изобретением сахарной составляющей.

Другой аспект данного изобретения заключается в получении конъюгатов олигонуклеотидов, содержащих один или большее число нуклеозидов по изобретению с модифицированной сахарной составляющей.

Краткое описание рисунков На фиг.1 изображены олигонуклеотиды по изобретению, в которых нуклеозидные заместители замещают положительно заряженной группировкой.

На фиг.2 изображена реакционная схема 1 для синтеза 3'-C-разветвленного тимидина.

На фиг.3 изображена реакционная схема 2 для синтеза 3'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 4 изображена реакционная схема 3 для синтеза 4'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 5 изображены дополнительные аспекты реакционной схемы 3 для синтеза 4'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 6 изображена реакционная схема 4 для синтеза 4'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 7 изображена реакционная схема 5 для синтеза 5'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 8 изображена реакционная схема 6 для синтеза 5'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 9 изображены дополнительные аспекты реакционной схемы 6 для синтеза 5'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 10 изображена реакционная схема 7 для синтеза 5'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 11 изображена реакционная схема 8 для синтеза 5'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 12 изображена схема, иллюстрирующая стереохимическое строение соединения 44 и других соединений.

На фиг. 13 изображена реакционная схема 9 для синтеза 1'-C-разветвленного тимидина.

На фиг. 14 изображена реакционная схема 10 для синтеза 1'-C-разветвленного тимидина.

Сокращения и определения DMTr = 4,4'-диметокситритил СЕРА = 2-цианоэтил-(N,N'-диизопропил)фосфорамидо TBDMS = трет-бутилдиметилсилил Ас = ацетил TBDMSM = трет-бутилдиметилсилоксиметил N₃ = азидо CF₃CO = трифторацетил T_f = трифторметансульфонил THP = тетрагидропиранил OT_s = тозил Используемый здесь термин "нуклеозид" означает соединение, содержащее пуриновое или пиримидиновое основание (или его производное), ковалентно связанное с 5-углеродным циклическим сахаром (фуранозой), например рибозой, 2'-дезоксирибозой и 2',3'-дидезоксирибозой. Термин "нуклеозид" применяется широко, включая модифицированные по сахарной составляющей нуклеозиды по изобретению.

Используемый здесь термин "полинуклеотид" означает полимеры, содержащие две или большее число нуклеозидных составляющих, в которых каждая нуклеозидная составляющая соединена с одной (в случае концевой) или двумя другими (в случае внутренней) нуклеозидными составляющими посредством межнуклеозидных связей, таких как фосфодиэфирные связи, пептидные связи, фосфонатные связи, фосфоротиоатные связи и им подобные. Примерами полинуклеотидов являются ДНК и РНК. Используемый здесь термин "полинуклеотид", если не оговорено особо, применяется широко, включая модифицированные по сахарной составляющей полинуклеотиды по изобретению.

Используемый здесь термин "олигонуклеотид" относится к относительно небольшим полинуклеотидам, например полинуклеотидам длиной от 2 до приблизительно 50 пар оснований; однако олигонуклеотид может быть и значительно длиннее.

Используемый здесь термин "гидроксилблокирующая группа" хорошо понятен специалистам в области органической химии. Примеры гидроксилблокирующих групп и других блокирующих групп могут быть найдены (среди прочих источников) в работе Greene and Wuts. "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, NY, NY (1991).

Используемые здесь термины "основание" и "нуклеозидное основание" относятся к гетероциклическим нуклеотидным основаниям природных нуклеиновых кислот, таким как аденин, цитозин, гипоксантин, урацил, тимин, гуанин, и их аналогам, включая неприродные основания, способным к образованию пар с природными основаниями. Подобные неприродные гетероциклические основания включают, но этим они не ограничиваются, аза- и деазапиримидиновые аналоги, аза- и деазапуриновые аналоги равно как и другие аналоги гетероциклических оснований, в которых один или несколько атомов углерода и азота пуринового или пиримидинового циклов замещены гетероатомами, например атомами кислорода, серы, селена, фосфора и им подобными.

Описание конкретных воплощений изобретения Согласно данному изобретению предложены новые нуклеозиды и олигонуклеотиды, обладающие свойствами, делающими их пригодными для применения в антисмысловых, диагностических и других методах, использующих олигонуклеотиды. Соединения по изобретению включают различные нуклеозиды, модифицированные таким образом, что в них введены замещения в положениях C1', C3', C4' или C5' сахарной составляющей нуклеозида. Нуклеозиды по изобретению могут включать один или более заместителей, делающих нуклеозид пригодным для твердофазного синтеза или родственных методик синтеза, например рассматриваемые нуклеозиды могут находиться в форме фосфорамидитных производных, содержащих 5'-диметокситритильную или другие защитные группы. Согласно настоящему изобретению также предложены олигонуклеотиды, содержащие в составе нуклеиновой кислоты один или большее число нуклеозидов, модифицированных по сахарной составляющей в соответствии с данным изобретением.

Добавление соответствующего заместителя в положения C3' или C5' нуклеозида изменяет окружение фосфодиэфирной связи олигонуклеотидов, содержащих подобные модифицированные по сахарной составляющей нуклеозиды. Предпочтительным является использование в положениях C3' или C5' объемных заместителей, ингибирующих нежелательные взаимодействия с ферментами или их активными центрами. Такие C3'- и C5'-заместители должны делать фосфодиэфирную связь олигонуклеотидов недоступной для действия многих ферментов. В результате присутствия заместителей олигонуклеотиды, содержащие подобные C3'- или C5'-разветвленные нуклеозиды, могут быть более устойчивыми к действию нуклеаз по сравнению с ДНК и РНК. Заместители в C1' и C4' положениях нуклеозидов могут оказывать такое же благоприятное влияние, как заместители в положениях C3' и C5'. В тех воплощениях изобретения, в которых рассматриваемые олигонуклеотиды содержат положительно заряженные аминоалкильные производные сахарных составляющих, их общий отрицательный заряд при физиологических условиях уменьшен настолько, что двойная спираль, образованная с участием по меньшей мере одной нити подобного олигонуклеотида, может быть более стабильной по сравнению с соответствующим немодифицированным олигонуклеотидом (см. фиг.1). Таким образом, в тех воплощениях данного изобретения, которые включают аминоалкильные производные сахарных составляющих или похожие положительно заряженные производные, вследствие наличия положительного заряда может быть достигнуто улучшенное связывание при гибридизации рассматриваемых олигонуклеотидов с полинуклеотидной мишенью. Специалистам в данной области следует принимать во внимание, что изложенные выше предположения, являясь руководством для использования и создания дополнительных воплощений данного изобретения, не нуждаются в коррекции с целью применения или создания настоящего изобретения.

Одним воплощением данного изобретения являются нуклеозиды, модифицированные по сахарной составляющей, следующей формулы: где R₁ может быть алкилом, аралкилом, арилом, замещенным алкилом, замещенным аралкилом, замещенным арилом, в которых заместителями могут быть NO₂, CN, N₃, COOEt, ОН, SH, CONH₂, CONHR, CONR₂, COOH, OAC, NH₂, NHAc, NMe₂, CF₃CONH, OR, SR, SO₂CH₃, CF₃, F, Cl, Br, I, OTs, ⁺NMe₃, CH=chr, C=CR, где R представляет собой алкил; R₂ может быть H, ОН, алкокси-, арилоксигруппой; R₃ может быть ОН, O-CEPA; R₄ может быть ОН или гидроксилблокирующей группой; В представляет собой гетероциклическое нуклеозидное основание; X может быть О, S, NH или CH₂.

Гетероциклическое нуклеозидное основание В модифицированных по сахарной составляющей нуклеозидов по изобретению, как представлено в формулах 45, 46, 47, 48, 49 и 50, может быть любым гетероциклическим нуклеозидным основанием как природным, так и неприродным. Так, гетероциклическими нуклеозидными основаниями, которые могут являться составляющими модифицированных в соответствии с настоящим изобретением по сахарной компоненте нуклеозидов, могут быть пурины (например, аденин, гуанин или ксантин), пиримидины (например, тимин, урацил, цитозин) и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Подходящими гетероциклическими основаниями, которые могут служить в качестве составляющей нуклеозидных соединений по изобретению, являются те основания, которые могут быть введены в одну нить двунитевого полинуклеотида таким образом, чтобы имелась возможность поддерживать структурные взаимодействия пар оснований с природными основаниями комплементарной полинуклеотидной нити. Кроме этого, составляющая нуклеозидных соединений по изобретению, соответствующая основанию, соединена с сахарной составляющей в таком положении основания, при котором возможно поддержание, как обсуждалось выше, структурных взаимодействий между парами оснований.

Другое воплощение данного изобретения охватывает нуклеозиды формулы: где R₁ может быть алкилом, аралкилом, арилом, замещенным алкилом, замещенным аралкилом, замещенным арилом, в которых заместителями могут быть NO₂, CN, N₃, COOEt, ОН, SH, CONH₂, CONHR, CONR₂, COOH, OAC, NH₂, NHAc, NMe₂, CF₃CONH, OR, SR, SO₂Me, CF₃, F, Cl, Br, I, OTs, ⁺NMe₃, CH=chr, C=CR, где R представляет собой алкил; R₂ может быть H, ОН, алкокси-, арилоксигруппой; R₃ может быть ОН, O-TBDMS, O-CEPA; R₄ может быть ОН, CHO или гидроксилблокирующей группой; В представляет собой гетероциклическое нуклеозидное основание; X может быть О, S, NH или CH₂; где атом углерода, соединенный с обоими R₁ и R₄ заместителями, находится или в R или в S-конфигурации.

Другим воплощением данного изобретения являются нуклеозиды формулы: где R₁ может быть алкилом, аралкилом, арилом, замещенным алкилом, замещенным аралкилом, замещенным арилом, в которых заместителями могут быть NO₂, CN, N₃, COOEt, ОН, SH, CONH₂, CONHR, CONR₂, COOH, OAC, NH₂, NHAc, NMe₂, CF₃CONH, OR, SR, SO₂Me, CF₃, F, Cl, Br, I, OTs, ⁺NME₃, CH=chr, C=CR, где R представляет собой алкил; R₂ может быть H, ОН, алкокси-, арилоксигруппой; R₃ может быть ОН, OTBDMS, O-CEPA; R₄ может быть ОН или гидроксилблокирующей группой; В представляет собой гетероциклическое нуклеозидное основание; X может быть О, S, NH или CH₂.

Другой аспект изобретения охватывает нуклеотиды формулы: где R₁ может быть алкилом, аралкилом, арилом, замещенным алкилом, замещенным аралкилом, замещенным арилом, в которых заместителями могут быть NO₂, CN, N₃, COOEt, ОН, SH, CONH₂, CONHR, CONR₂, COOH, OAC, NH₂, NHAc, NMe₂, CF₃CONH, OR, SR, SO₂Me, CF₃, F, Cl, Br, I, OTs, ⁺NMe₃, CH=chr, C=CR, где R представляет собой алкил; R₂ может быть H, ОН, алкокси-, арилоксигруппой; R₃ может быть ОН, O-MBn, O-CEPA; R₄ может быть ОН или гидроксилблокирующей группой; В представляет собой гетероциклическое нуклеозидное основание; X может быть О, S, NH или CH₂.

Еще один аспект данного изобретения охватывает различные эпоксипроизводные модифицированных по сахарной составляющей нуклеозидов по изобретению следующих формул: где R выбран из CH₂OH, CH₂ODMTr, CHO, COOH и COOEt; а X выбран из О и CH₂. Эпоксиды могут находиться в любой из двух возможных стереохимических ориентаций.

Модифицированный по сахарной составляющей нуклеозид по изобретению может быть синтезирован в соответствии с примерами, приведенными в разделе "Примеры" настоящей заявки. Лицо с обычной квалификацией в области органической химии может, опираясь на приведенный здесь пример, синтезировать многочисленные соединения по изобретению, для которых не приведены подробные описания синтезов.

Олигонуклеотиды, содержащие нуклеозиды с модифицированными сахарными составляющими Полинуклеотиды по изобретению содержат один или большее число нуклеозидов с модифицированной в соответствии с данным изобретением сахарной составляющей, в которых модифицированный нуклеозид соединен либо с другим модифицированным нуклеозидом, либо с немодифицированным нуклеозидом посредством межнуклеозидной связи. Строение модифицированных нуклеозидов, входящих в состав олигонуклеотидов по изобретению, охватывается формулами 45, 46, 47 и 48. Аналоги полинуклеотидов по изобретению не ограничиваются числом возможных нуклеозидных субъединиц индивидуального полинуклеотидного аналога, тем не менее в общем более удобно синтезировать короткие полинуклеотидные аналоги, например аналоги полинуклеотидов, содержащие менее 50 оснований.

Индивидуальные нуклеозиды по изобретению могут быть соединены друг с другом посредством межнуклеозидных связей таким образом, чтобы получались новые олигонуклеотиды с желаемой последовательностью нуклеозидных оснований. Межнуклеозидные связи могут быть связями между C3' и C5' или между C2' и C5'. Используемый здесь термин "межнуклеозидная связь" относится не только к фосфодиэфирной связи типа межнуклеозидной связи в ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоте) и РНК (рибонуклеиновой кислоте), но также ко множеству других связей, удовлетворяющих тем же структурным требованиям, что и фосфодиэфирные связи в ДНК и РНК. Примеры соединений с другими межнуклеозидными связями, пригодными для объединения олигонуклеотидов по изобретению, включают фосфоротиоаты, метилфосфонаты, фосфородитиоаты, борфосфонаты, селенфосфонаты, фосфорамидаты, ацетамидаты и им подобные. Описания синтеза и применения соединений с различными межнуклеозидными связями могут быть найдены среди прочего в следующих публикациях: патент США 5256775, международная публикация WO 93/24507, международная публикация WO 92/05186, патент США 5264562, международная публикация WO 92/02534, международная публикация WO 94/06811, международная публикация WO 93/17717, патент США 5212295, патент США 5292875, патент США 5218103, патент США 5166387, патент США 5151516, патент США 4814448, патент США 4814451, патент США 4096210, патент США 4094873, патент США 4092312, патент США 4016225, патент США 4007197 и т.п.

Полинуклеотиды по изобретению с желаемой последовательностью оснований могут быть без труда получены с помощью методик синтеза нуклеиновых кислот, хорошо известных специалистам средней квалификации в области органической химии. Предпочтительным при синтезе полинуклеотидов по изобретению является использование фосфорамидного способа с целью включения одного или более новых нуклеозидов по изобретению в полинуклеотидный аналог. Разветвленные заместители в положениях C3' или C5' нуклеозидов могут, в зависимости от их размеров, снижать скорость реакции присоединения. Вследствие этого для некоторых нуклеозидов с разветвленными заместителями большого объема может потребоваться увеличение времени проведения реакции присоединения в 10 или более раз. При необходимости для увеличения скорости реакции присоединения можно также использовать повторное связывание со свежими реагентами или проведение реакции с реагентами в более высоких концентрациях. По окончании синтеза олигонуклеотиды можно обрабатывать точно так же, как это делается для стандартных немодифицированных олигонуклеотидов, т.е. отщепить от нерастворимой подложки, используя 30% аммиак, провести снятие защитных групп при 55^oC в течение 8 ч и очистить с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Для проверки как чистоты олигонуклеотидов, так и факта включения в них желаемых нуклеозидов с модифицированной сахарной составляющей, очищенные олигонуклеотиды могут быть охарактеризованы путем анализа продуктов ферментативного расщепления, проведенного с использованием для расщепления олигонуклеотидов таких ферментов, как фосфодиэстераза змеиного яда и щелочная бактериальная фосфатаза. Продукты деградации затем могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ (или другой методики разделения) в сравнении с истинными нуклеозидными образцами. Структура очищенных олигонуклеотидов также может быть проверена с помощью масс-спектрометрии, с использованием такой методики, как электрораспыление.

Другим аспектом данного изобретения являются конъюгаты олигонуклеотидов с модифицированными сахарными составляющими, охватываемых изобретением. Амино-, гидрокси-, тио- или карбоксиалкилсодержащие линкеры могут быть присоединены в положениях C1', C3', C4' и C5' рассматриваемых нуклеозидов, обеспечивая таким образом сайт для конъюгации последних с представляющим интерес соединением. Линкеры в положениях C1' и C3' могут быть использованы для направления конъюгированного соединения в малые бороздки двунитевой молекулы нуклеиновой кислоты, в то время как линкеры, присоединенные в положение C4', - в большие бороздки. Линкеры, связанные с положением C5', можно использовать для направления конъюгированного соединения как в большие, так и в малые бороздки двунитевой молекулы нуклеиновой кислоты в зависимости от стереохимии линкера в данном положении. С использованием линкеров большое разнообразие функциональных соединений, таких как искусственные нуклеазы, сшивающие агенты, интеркалирующие соединения и репортерные молекулы, могут быть присоединены и размещены в желаемом месте.

Применимость и воздействие В силу того, что олигонуклеотиды по изобретению способны проявлять значительную активность в отношении связывания с однонитевой и двунитевой нуклеиновой кислотой-мишенью с образованием дуплексов, триплексов и других форм стабильной ассоциации с природными полинуклеотидами и их структурными аналогами, данные олигонуклеотиды по изобретению могут быть применены в большинстве методик, использующих обычные олигонуклеотиды. Так, олигонуклеотиды по изобретению могут применяться, например, как полинуклеотидные гибридизационные зонды, праймеры для полимеразной цепной реакции (и схожих циклических амплификационных реакций), праймеры для секвенирования и т.д. Олигонуклеотиды по изобретению также могут быть использованы в диагностике и терапии заболеваний. Терапевтические применения олигонуклеотидов по изобретению включают специфическое ингибирование экспрессии генов (или ингибирование трансляции последовательностей РНК, кодирующих такие гены), связанных или с возникновением, или с поддержанием патологического состояния, за счет использования этих олигонуклеотидов в качестве антисмысловых. Олигонуклеотиды по изобретению могут применяться для осуществления антисмыслового ингибирования многочисленных генетических мишеней. Типичные гены или кодируемые теми генами РНК, которые могут быть мишенями для антисмыслового связывания олигонуклеотидов по изобретению, включают олигонуклеотиды, кодирующие ферменты, гормоны, белки крови, трансмембранные белки, молекулы адгезии (LFA-1, GPII_b/III_a, ELAM-1, VACM-1, ICAM1, E-селектин и им подобные), молекулы рецепторов, включающие рецепторы цитокинов, цитокины (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6 и им подобные), онкогены, факторы роста и интерлейкины. Гены-мишени или соответствующие РНК могут быть связаны с любым из патологических состояний, таких как состояния, ассоциированные с воспалением, сердечно-сосудистыми заболеваниями, иммунными реакциями, раком, вирусными инфекциями, бактериальными инфекциями, дрожжевыми инфекциями, инфекциями-паразитами и им подобными.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению пригодны для терапевтического применения как in vivo, так и ex vivo. Показания на применение ex vivo включают обработку клеток, таких как клетки костного мозга или периферической крови, в таких состояниях, как лейкоз (хронический миелогенный лейкоз, острый лимфолейкоз) или вирусная инфекция. Гены-мишени или молекулы РНК, кодируемыми теми генами, которые могут служить мишенями для противораковых лекарств, включают онкогены, как, например, ras, k-ras, bcl-2, c-myb, bcr, c-myc, c-abl, или сверхэкспрессируемые последовательности типа mdm2, онкостатина М, IL-6 (саркома Капоши), HER-2 и транслокации, как, например, bcr-abl. Подходящими мишенями являются также последовательности вирусных генов или молекул РНК, ими кодируемых, как, например, гены полимеразы или обратной транскриптазы герпес-вирусов типа CMV, HSV-1, HSV-2, ретровирусов типа HTLV-1, HIV-1, HIV-2 или других ДНК- или РНК-содержащих вирусов, как, например, HBV, HPV, VZV, вирус гриппа, аденовирусы, флавивирусы, риновирусы и им подобные. Специфически связывающиеся олигонуклеотиды могут применяться в сочетании с другими терапевтическими средствами. Другие терапевтические применения олигонуклеотидов по изобретению включают: (1) модуляцию воспалительных ответов с помощью регуляции экспрессии таких генов, как IL-1 рецептор, IL-1, ICAM-1 или E-селектин, играющих роль в опосредовании воспаления и (2) модуляцию клеточной пролиферации в таких состояниях, как артериальная окклюзия (рестеноз) после пластической операции на сосудах, с помощью регуляции экспрессии (а) ростовых или митогенных факторов, как, например, немышечный миозин, myc, fox, PCNA, PDGF или FGF или других рецепторов, или (б) клеточных факторов пролиферации типа c-myb. Другие подходящие факторы пролиферации или сигнальные факторы трансдукции, как, например, TGFa, IL-6, gINF, протеинкиназа С, тирозинкиназы (например, p210, p190) могут служить мишенью при лечении псориаза и других состояний. Кроме этого, EGF-рецептор, TGFa или MHC аллели могут служить мишенью при лечении аутоиммунных заболеваний.

Олигонуклеотиды по изобретению также могут быть с успехом применены для замены обычных олигонуклеотидов во многих нетерапевтических методиках, таких как детектирование последовательностей нуклеиновых кислот методом гибридизации, полимеразная цепная реакция и им подобных. Эти нетерапевтические методики хорошо известны специалистам средней квалификации в области молекулярной биологии и могут быть найдены, например, в Sambrook et al. "Molecular Cloning Techniques", 2nd Edition, Clod Spring Harbor (1989).

Доставка олигонуклеотидов по изобретению в клетки может быть облегчена любым соответствующим способом, включающим использование трансфекции с фосфатом кальция, DMSO, глицерином или декстраном, электропорации или катионо-анионных и/или нейтральных липидных составов или липосом методами, описанными в литературе (Международные публикации NN WO 90/14074, WO 91/16024, WO 91/17424, патент США 4897355). Олигонуклеотиды могут быть введены в клетки с помощью комплексообразования с катионными липидами, такими как DOTMA (которые могут образовывать, а могут и не образовывать липосомы), а такие комплексы затем приводят в контакт с клетками. Соответствующие катионные липиды включают, но этим не ограничиваются, N-(2,3-ди(9-(Z)-октадеценилоксил))-проп-1-ил-N, N, N-триметиламмоний (DOTMA) и его соли, 1-O-олеил-2-O-олеил-3-диметиламинопропил -- гидроксиэтиламмоний и его соли и 2,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмонио)пропан и его соли.

Усиленная доставка в клетки олигонуклеотидов по изобретению может также быть опосредована использованием (i) вирусов, таких как вирус Sendai (Bartzatt R. Biotechnol. Appl. Biochem. (1989), 11, 133-135) или аденовирус (Wagner E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89, 6099-6013); (ii) полиаминных или поликатионных конъюгатов с применением соединений типа полилизина, протамина или Na,N₁₂-бис(этил)спермина (Wagner E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88, 4255-4259; Zenke M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87, 3655-3659; Chank В.К. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1988), 157, 264-270; патент США 5138045); (iii) липополиаминных комплексов с применением соединений типа липоспермина (Behr J.-P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86, 6982-6986; Loeffler J.P. et al. J. Neurochem. (1990), 54, 1812-1815); (iv) анионных, нейтральных или pH-чувствительных липидов с применением соединений, включающих анионные фосфолипиды типа фосфатидилглицерина, кардиолипина, фосфатидной кислоты или фосфатидилэтаноламина (Lee K.-D. et al. Biochem. Biophys. ACTA (1992), 1103, 185-197; Cheddar G. et al. Arch. Biochem. Biophys. (1992), 294, 188-192; Yoshimura Т. et al. Biochem. Int. (1990), 20, 697-706); (v) конъюгатов с соединениями типа трансферрина или биотина или (vi) конъюгатов с белками (включающими альбумин или антитела), гликопротеинами или полимерами (включающими полиэтиленгликоль), усиливающими фармакокинетические свойства рассматриваемых олигонуклеотидов. Используемый здесь термин "трансфекция" относится к любому методу, пригодному для доставки олигонуклеотидов в клетки. Любой реагент типа липида или любой агент типа вируса, который может быть использован при проведении трансфекции, называется здесь общим термином "усиливающий проницаемость агент". Доставка олигонуклеотидов в клетки может осуществляться посредством котрансфекции с другими нуклеиновыми кислотами, такими как (i) экспрессируемые фрагменты ДНК, кодирующие белок (белки) или фрагмент белка, или (ii) транслируемые РНК, кодирующие белок (белки) или фрагмент белка.

Олигонуклеотиды по изобретению могут таким образом быть введены в любой подходящий состав, усиливающий доставку олигонуклеотидов в клетки. Соответствующие этой цели фармацевтические составы включают также те составы, которые обычно применяются при доставке соединений в клетки или ткани путем местного введения. Такие соединения, как полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, азон, ноноксонил-9, олеиновая кислота, DMSO, полиамины или липополиамины, могут быть использованы в составах для местного применения, содержащих олигонуклеотиды.

Синтез 3'-C-разветвленных нуклеозидов Замещение гидроксильной группы в положении C3' нуклеозидов другими функциональными группами с сохранением водорода в положении C3' было описано, в частности, в De Clercq Е. Antiviral Res. (1989), 12, 1-20. О замещении водорода в положении C3' нуклеозидов другими функциональными группами сообщалось в Fedorov I.I., Kazmina Е.М., Novicov N.A., Gurskaya G.V., Bochkarev A.V., Jasko M. V. , Victorova L.S., Kuhkanova M.K., Balzarini J., De Clercq E. J. Med. Chem. (1992), 35, 4567-4575. Настоящее изобретение охватывает способы получения большого числа различных 3'-C-разветвленных нуклеозидов. Примеры способов получения 3'-C-разветвленных тимидинов представлены на реакционных схемах 1 и 2 (фиг.2 и 3, соответственно). Эти методики могут без труда быть адаптированы для синтеза других нуклеозидов по изобретению, включая воплощения изобретения, в которых нуклеозиды содержат основание, отличное от тимина. Соединение 4 было получено из тимидина в три стадии, как описано в Jorgensen P. N., Thrane Н., Wengel J. J. Am. Chem. Soc. (1994), 116, 2231. Обработка соединения 4 тозилхлоридом в пиридине позволила получить тозилат, соединение 5. Реакция соединения 5 с цианидом калия в DMF дала 3'-C-цианометилтимидиновое производное, соединение 6. Реакция соединения 5 с азидом натрия в DMF дала 3'-C-азидометилтимидиновое производное, соединение 7. Подобным же образом в реакциях соединения 5 с различными нуклеофильными реагентами может быть получен широкий круг разнообразных 3'-C-разветвленных производных тимидина, в которых 3'-C-гидроксильная группа остается в той же ориентации, что и в тимидине. Обработка соединения 6 2-цианоэтил-N,N-диизопропилхлорфосфорамидитом и диизопропилэтиламином в дихлорметане позволила получить фосфорамидит, соединение 8, являющееся строительным блоком в олигонуклеотидном синтезе. Подвергнутое такой же обработке соединение 7 дало соединение 9. Аналогичным образом посредством стандартных методик остальные 3'-разветвленные производные тимидина могут быть превращены в соответствующие фосфорамидиты (Eckstein F. "Oligonucleotide synthesis", Oxford University Press (1991)). Обработка соединения 5 гидридом натрия в THF позволила получить эпоксидное производное, соединение 10. Взаимодействие соединения 10 с алюмогидридом лития в THF позволило получить 3'-C-метилтимидиновое производное, соединение 11, которое переводили в фосфорамидит, соединение 12. Реакция соединения 10 с аммиаком в метаноле позволила получить 3'-C-аминометилтимидиновое производное, соединение 13, которое обрабатывали этилтиотрифторацетатом в THF, получая защищенное аминопроизводное, соединение 14. Соединение 14 переводили в фосфорамидит, соединение 15. Аналогично в результате взаимодействия соединения 10 с различными нуклеофильными реагентами может быть получен широкий круг разнообразных 3'-C-разветвленных производных тимидина, в которых 3'-C-гидроксильная группа остается в той же ориентации, что и в тимидине, так как нуклеофилы атакуют менее закрытый атом углерода эпоксидного кольца. Так, взаимодействие соединения 10 со спиртами в присутствии основания дает алкоксиметилтимидины. Для получения 3'-C-замещенных алкоксиметилтимидинов также могут быть использованы замещенные спирты. Заместители могут включать, но этим не ограничиваться, NO₂, CN, COOEt и защищенные аминогруппы. Реакция соединения 10 с диолами позволяет получить 3'-C-гидроксиалкоксиметилтимидины, которые легко могут быть превращены в 3'-C-галоалкоксиметилтимидины. Реакция соединения 10 с нитрометаном дает 3'-C-нитроэтилтимидин. Восстановление 3'-C-нитроалкилтимидинов позволяет получить 3'-C-аминоалкилтимидины. Реакция соединения 10 с цианозамещенными органокадмиевыми реагентами дает 3'-C-цианоалкилтимидины. Реакция соединения 10 с этоксикарбонилалкилцинковыми реагентами позволяет получить 3'-C-этоксикарбонилалкилтимидины, которые легко гидролизуются в щелочных условиях до 3'-C-карбоксиалкилтимидинов.

В некоторых реакциях с участием литий органокупратных реагентов амидная группа тимидина может нуждаться в защите. Предпочтительным является использование в качестве защитной группы т-бутилдиметилсилоксиметила (TBDMSM), так как эта группа может быть легко снята после последующих превращений с помощью фторида тетрабутиламмония (TBAF). N-TBDMSM группа может быть введена в результате взаимодействия 3,5-биацилированного тимидина с т-бутилдиметилсилоксиметилхлоридом в пиридине.

N-TBDMSM тимидин подвергают похожей обработке, описанной выше для тимидина, с целью получения тозилата, промежуточного производного соединения 5, и эпоксида, промежуточного производного соединения 10, соответственно, которые оба могут быть использованы для получения 3'-C-алкилтимидинов и 3'-C-алкенилтимидинов реакцией с литиевыми реагентами. Гидроборирование или окислительное расщепление полученных 3-C-(- алкенил)тимидинов дает гидроксиалкилтимидины, гидроксильная группа которых может быть превращена в разнообразные функциональные группы типа NH₂, OR, SR, SH и X, где R представляет собой H или алкил, а X является F, Cl, Br, I, OTs.

Синтез 4'-C-разветвленных нуклеозидов О ряде 4'-C-разветвленных нуклеозидов сообщалось в O-Yang С., Wu H.Y., Fraser-Smith Е.В., Walker К.А.М. Tetrahedron Letts (1992), 33, 37-40. Настоящее изобретение охватывает методики получения многих новых 4'-C-разветвленных нуклеозидов. Способ получения 4'-C-разветвленных тимидинов показан на Реакционных схемах 3, 4 и 5 (фиг.4, 5, 6 и 7, соответственно). Эти методики могут быть легко адаптированы для синтеза других нуклеозидов по изобретению, включая воплощения изобретения, в которых нуклеозиды содержат другое основание, нежели тимин. Соединение 16, полученное из тимидина, обрабатывали диметокситритилхлоридом, получая соединение 17. т-Бутилдиметилсилильную (TBDMS) группу соединения 17 удаляли обработкой TBAF, получая соединение 18, которое окисляли до альдегида, соединения 19, обработкой диметилсульфоксидом, DCC, трифторуксусной кислотой и пиридином. Соединение 19 было превращено в соединение 20, 4'-C-гидроксиметилтимидиновое производное, по методике, аналогичной описанным в O-Yang С., Wu H.Y., Fraser-Smith Е.В., Walker К.А.М. Tetrahedron Letts (1992), 33, 37-40 и Jones G.H., Taniguchi M., Tegg D., Moffatt J.G. J. Org. Chem. (1979), 44, 1309-1317. Диметокситритильную группу соединения 20 удаляли с помощью 80%-ной уксусной кислоты, получая соединение 21, 4'-C-гидроксиметилтимидин. Селективное бензоилирование соединения 21 с помощью бензоилангидрида позволяет получить соединение 22, 3'- и 5'-гидроксил