Фармацевтическая композиция, активная в отношении рецептора кальция, способ лечения пациента, способ анализа соединения оказывать влияние на активность рецептора неорганического иона, нуклеиновая кислота, кодирующая рецептор, рецептор кальция

Фармацевтическая композиция, активная в отношении рецептора кальция, способ лечения пациента, способ анализа соединения оказывать влияние на активность рецептора неорганического иона, нуклеиновая кислота, кодирующая рецептор, рецептор кальция

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, точнее препаратам и способам лечения и исследования, связанным с рецепторами кальция и др. неорганических ионов. Предпочтительно молекула способна воздействовать как селективный агонист или антагонист на Са⁺²-рецептор одной или более, но не всех клеток, выбранных из группы, состоящей из паратироидных клеток, костных остеокластов, окологломерулярных почечных клеток, проксимальных канальцевых почечных клеток, периферических канальцевых почечных клеток, клеток толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в тироиде (С-клеток), интестинальных клеток, трофобласта в плаценте, тромбоцита, клетки сосудов гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клеток, секретирующих гастрин и глюкагон, почечной, мезангиальной клетки и клетки грудной железы. Изобретение расширяет арсенал средств, способных блокировать активность внеклеточных ионов кальция, при различных патологиях. 6 с. и. 50 з.п. ф-лы, 47 ил., 6 табл.

Изобретение относится к конструкции, разработке, композиции и применению новых кальцимиметических молекул, способных воздействовать аналогичным образом на внеклеточные ионы кальция на клетках, к кальцилитическим молекулам, которые блокируют активность внеклеточных ионов кальция на клетки, и к способам их применения и идентификации.

Оно также относится к новому суперсемейству рецепторов неорганических ионов, которое включает среди других рецепторы кальция, нуклеиновым кислотам, кодирующим такие рецепторы, к клеткам, тканям и животным, содержащим такие нуклеиновые кислоты, к антителам к рецепторам, к анализу с использованием рецепторов и к способам, относящимся ко всему вышесказанному.

Последующее описание предоставляет краткую информацию, относящуюся к настоящему изобретению. Это не означает, что любая приведенная здесь информация представляет собой уровень техники для заявляемого изобретения, ни то, что любая из публикаций специально или безоговорочно относятся к уровню техники этого изобретения.

Некоторые клетки в организме отвечают не только на химические сигналы, но также на ионы, такие как внеклеточные ионы кальция /Ca²⁺/. Изменения концентрации внеклеточного Ca²⁺ (упоминаемой здесь как "/Ca²⁺/") изменяют функциональные ответы этих клеток. Одной такой специализированной клеткой является паратироидная клетка, которая секретирует паратироидный гормон /ПТГ/. ПТГ является принципиальным эндокринным фактором, регулирующим Ca²⁺ гомеостаз в крови и внеклеточных жидкостях.

ПТГ при действии на клетки кости и почек увеличивает уровень Ca²⁺ в крови. Такое увеличение /Ca²⁺/ затем действует как сигнал отрицательной обратной связи, подавляя секрецию ПТГ. Обратное соотношение между /Ca²⁺/ и секрецией ПТГ образует основной механизм поддержания гомеостаза Ca²⁺ в целом.

Внеклеточный Ca²⁺ действует непосредственно на паратироидную клетку, регулируя секрецию ПТГ. Было предположено существование белка поверхности паратироидной клетки, который определяет изменение /Ca²⁺/. Этот белок действует как рецептор внеклеточного Ca²⁺ /"рецептор Ca²⁺"/ и предполагают, что он определяет изменения /Ca²⁺/ и инициирует функциональный клеточный ответ, секрецию ПТГ. Например, роль рецепторов Ca²⁺ и внеклеточного Ca²⁺ при регулировании внеклеточного Ca²⁺ и функции клетки рассмотрена Неметом с сотр., 11 Cell Calcium 319, 1990, роль Ca²⁺-рецепторов в парафолликулярных и паратироидных клетках рассмотрена Неметом с сотр., 11 Cell Calcium 323, 1990, и роль Ca²⁺-рецепторов на костные остеокласты рассмотрены Зайди, 10 Biosceince Reports 493, 1990.

Другие клетки организма, особенно остеокласт в кости, окологломерулярные, проксимальные канальцевые клетки в почках, кератиноцит в эпидермисе, парафолликулярная клетка в щитовидной железе, интестинальные клетки, трофобласт в плаценте, обладают способностью чувствовать изменения /Ca²⁺/. Было предположено, что рецепторы Ca²⁺ поверхности клеток также могут присутствовать на этих клетках, придавая им способность определять и инициировать или быть способными давать ответ на изменения /Ca²⁺/.

В паратироидных клетках, остеокластах, парафолликулярных клетках (C-клетках), кератиноцитах, окологломерулярных клетках в трофобластах увеличение /Ca²⁺/ вызывает увеличение концентрации внутриклеточного свободного Ca²⁺ ("/Ca²⁺/_в"). Такое увеличение может быть вызвано притоком внеклеточного Ca²⁺ или мобилизацией Ca²⁺ из внутриклеточных органелл. Изменения /Ca²⁺/_в легко контролируются и количественно определяются при использовании флуориметрических индикаторов, таких как fura-2 или indo-1 (Molecular Probes, Eugene, OR). Измерение /Ca²⁺/_в обеспечивает анализ для оценки способности молекул действовать как агонисты или антагонисты на рецептор Ca²⁺.

В паратироидных клетках увеличение концентрации внеклеточного Ca²⁺ вызывает быстрое и временное увеличение /Ca²⁺/_в, за которым следует более низкое, но еще продолжительное повышение /Ca²⁺/_в. Кратковременное повышение /Ca²⁺/_в возникает из-за мобилизации внутриклеточного Ca²⁺, тогда как более низкое продолжительное повышение является результатом притока внеклеточного Ca²⁺. Мобилизация внутриклеточного Ca²⁺ осуществляется за счет повышенного образования инозитол-1,4,5-трифосфата /ИФ₃/ и диацилглицерина, двух биохимических индикаторов, которые ассоциированы с рецепторзависимой мобилизацией внутриклеточного Ca²⁺ в других различных клетках.

В дополнение к Ca²⁺ другие двух- и трехвалентные катионы, такие как Mg²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, La³⁺ и Gd³⁺, также вызывают мобилизацию внутриклеточного Ca²⁺ в паратироидных клетках. Mg²⁺ и La³⁺ также повышают образование ИФ₃, все эти неорганические катионы подавляют секрецию ПТГ. Постулированный Ca²⁺-рецептор на паратироидной клетке, следовательно, является смешанным, поскольку он определяет различные внеклеточные двух- и трехвалентные катионы.

Способность различных соединений подражать внеклеточному Ca²⁺ in vitro обсуждалась Неметом с сотр. /спермин и спермидин/ в Calcium-Binding Proteins in Health and Disease 1987, Academic Press, Inc. p.p. 33-35, Брауном с сотр. /например, неомицин/ 128, Endocrinology 3047, 1991, Ченом с сотр. /дильтиазем и его аналог, TA-3090/ 5, J. Bone and Mineral Res. 581, 1990, и Зайди с сотр. /верапамил/ 167, Biochem. Biophys Res. Comm. 807, 1990.

Браун с сотр., 6, J. Bone and Mineral Res. 11, 1991, обсуждает существующие теории, относящиеся к воздействиям ионов Ca²⁺ на паратироидные клетки, и предлагает, что результаты могут быть объяснены как рецепторподобным механизмом, так и рецепторнезависимым механизмом следующим образом.

Поливалентные катионы /например, двухвалентные и трехвалентные катионы/ оказывают различные воздействия на паратироидную функцию, такие как ингибирование секреции паратироиодного гормона (ПТГ) и аккумуляция цАМФ, стимуляция аккумуляции инозитолфосфатов и повышение концентрации цитозолического кальция. Полагают, что эти воздействия должны быть опосредованы через "рецепторподобный" механизм. Ингибирование агонистстимулированной аккумуляции цАМФ двухвалентными и трехвалентными катионами, например, блокируется последующей предварительной инкубацией с коклюшным токсином. Итак, putative рецептор поливалентного катиона может быть соединен для ингибирования аденилатциклазы с регуляторным белком /G/ ингибирования гуанинового нуклеотида, G_в.

Недавно мы показали, что поликатионный антибиотик, неомицин, подобен по воздействиям двух- и трехвалентным катионам в некоторых аспектах паратироидной функции. Для определения, являются ли эти воздействия специфическими для этого агента или представляют собой более общее воздействие поликатионов, мы испытали воздействия сильноосновных пептидов, полиаргинина и полилизина, а также протамина на одинаковые параметры в диспергированных бычьих паратироидных клетках. Результаты показывают, что паратироидная клетка отвечает на различные поликатионы, а также на поливалентные катионы возможно по подобным биохимическим путям. Эти результаты были обсуждены в терминах недавно постулированной, "рецепторнезависимой" модуляции белков поликатионами в других системах.

Предполагалось, что Ca²⁺-рецептор должен быть аналогичным другим G-белоксвязанным рецепторам /например, гликопротеин/, но недавние исследования с другими типами клеток выдвинули возможность, что поликатионы могут модулировать клеточную функцию по альтернативным или дополнительным механизмам. Например, в маст (mast) клетках различные амфипатические катионы, включая мастопаран, пептид из яда осы, 48/80, синтетический поликатион и полилизин, повышают секрецию по чувствительному к коклюшному токсину механизму, предполагая включение G-белка. Не было идентифицировано классического рецептора поверхности клетки, который мог бы медиировать воздействия этих различных агентов. Кроме того, было показано, что эти же соединения активируют непосредственно очищенные G-белки в растворе или в искусственных фосфолипидных везикулах. На основании этих наблюдений было предложено, что амфипатические катионы активируют G-белки и, в свою очередь, секрецию маст-клеток по "рецепторнезависимому" механизму.

Было также показано, что поликатионы интенсивно взаимодействуют с кислыми фосфолипидами. Полилизины с различной длиной цепи /20-1000 аминокислот/ связываются с искусственными фосфолипидными везикулами с константами диссоциации в интервале от 0,5 нМ до 1,5 М. Способность к связыванию непосредственно зависит от длины полилизиновой цепи, у полимеров из 1000 аминокислот K_d 0,5 нМ, более короткие полимеры имеют более высокие величины K_d, а лизин не вступает в реакцию в заметной степени. Такое соотношение между активностью и длиной цепи подобно наблюдаемому для эффектов полилизина₁₀₂₀₀, полилизина₃₈₀₀ и лизина на паратироидную функцию.

Возможно, что связыванием поликатионов с биомембранами продуцирует некоторые из их биологических действий. Было постулировано, что проницаемость плазматических мембран, индуцированная у некоторых типов клеток различными порообразующими агентами, включая поликатионы, будет способствовать их взаимодействию с фосфатидилсеринподобной структурой. Кроме того, "рецепторнезависимая" активация очищенных G-белков амфипатическими катионами будет возможной, когда эти белки включены в фосфолипидные везикулы.

Ионы кальция в миллимолярном интервале концентраций также вызывают заметные изменения структуры мембраны. В некоторых случаях кальций может или антагонизировать или усиливать взаимодействие поликатионов с мембранными липидами. Эти выводы приводят к возможности, что воздействия как поливалентных катионов, так и поликатионов на паратироидные клетки могут включать рецепторнезависимый механизм, не требующий наличия классического G-белоксвязанного рецептора на поверхности клетки. Однако требуются дополнительные исследования, чтобы объяснить молекулярную основу Ca²⁺ чувствительности этих и других типов клеток. /Цитирования опущены/.

Шобэк и Чен /6/ Supplement 1/, J. Bone and Mineral Res. 1991, 5135 и Pakke с сотр. /6/ Supplement 1/ J. Bone and Mineral Res. 1991, 5118/ описали эксперименты, в которых было указано, что Ca²⁺-рецептор или Ca²⁺-сенсор присутствует в паратироидных клетках. Матричная РНК, изолированная из таких клеток, может быть экспрессирована в ооцитах, и требуется получить такие ооциты с фенотипом, который может быть объяснен наличием Ca²⁺-рецепторного белка.

Краткое изложение изобретения Заявитель показал, что Ca²⁺-рецепторные белки у определенных специализированных клеток включены целиком в Ca²⁺-метаболизм, чтобы определять и отвечать на изменения концентрации внеклеточного Ca²⁺. Хотя эти рецепторы принимают участие в некоторых общих характеристиках, они могут подвергаться селективному воздействию различных фармакологических агентов. Как будет детально описано ниже, некоторые молекулы идентифицируются по селективной активности на Ca²⁺-рецепторы паратироидных клеток, остеокластов и C-клеток.

Ca²⁺-рецепторы представляют собой дискретные молекулярные мишени для нового класса молекул, которые имитируют /"кальцимиметики"/ или антагонизируют /кальцилитики"/ воздействия внеклеточного Ca²⁺. Такие рецепторы находятся на поверхности клетки и имеют низкое сродство к внеклеточному Ca²⁺ (кажущаяся K_d обычно больше, чем примерно 0,5 мМ). Такие рецепторы могут включать механизм свободного или связанного эффектора, как определено Купером, Блумом и Ротом "The Biochemical Basis of Neuropharmacology", Ch. 4. Итак, такие рецепторы отличаются от рецепторов внутриклеточного Ca²⁺, например кальцимодулина и трипонинов. Кальциметики, например, действуют на Ca²⁺-рецепторы селективно, чтобы непосредственно или не непосредственно снизить фунцию паратироидных клеток или остеоскластов или стимулировать функцию C-клеток. Кальцимиметики и кальцилитики настоящего изобретения позволяют создать новую терапию для гиперпаратироидизма, остеопороза и других Ca²⁺-зависимых заболеваний. Настоящая заявка в одном аспекте относится к конъюгированию лекарственного препарата с антителом, обеспечивая ему направленную доставку препарата к Ca²⁺-рецепторам у каждого из этих трех типов клеток и других типов клеток, которые определяют и отвечают на изменения /Ca²⁺/.

Заявитель сначала продемонстрировал белок Ca²⁺-рецептора в паратироидных клетках и фармакологически дифференциировал такие Ca²⁺-рецепторы в других клетках, таких как C-клетки и остеокласты. Заявитель также в первую очередь описал способы, по которым могут быть идентифицированы молекулы, активные у этих Ca²⁺-рецепторов, и использованы в качестве ведущих молекул при обнаружении, разработке, конструировании, модификации и/или конструкции полезных кальцимиметиков или кальцилитиков, которые являются активными у Ca²⁺-рецепторов. Такие кальцимиметики или кальцилитики являются полезными при лечении различных болезненных состояний, характеризующихся аномальными уровнями одного или более компонентов, например полипептидов, таких как гормоны, ферменты или факторы роста, экспрессия и/или секреция которых регулируется или находится под воздействием одного или нескольких Ca²⁺-рецепторов. Далее, идентификация различных Ca²⁺-рецепторов в различных типах клеток и специфический ответ таких рецепторов на различные ведущие молекулы позволяет дать замысел и конструкцию специфических молекул, активных при лечении специфических заболеваний, которые могут находиться под влиянием таких специфических Ca²⁺-рецепторов. Например, аномальные уровни секреции паратироидного гормона могут быть подвергнуты действию таких специфических молекул без воздействия на уровни секреции других регулируемых Ca²⁺ гормонов и т.п.

Идентификации таких ведущих молекул препятствовало отсутствие до настоящего времени системы скрининга с большим количеством исходного материала для обнаружения активных молекул и отсутствие основных структурных данных, на базе которых конструируют эффективные кандидаты в лекарства. Теперь эти преграды сняты с помощью клонирования Ca²⁺-рецептора паратироидных клеток и функционально родственных рецепторов и систематического исследования структурных признаков некоторых ведущих молекул, которые активируют такие клонированные Ca²⁺-рецепторы и функционально родственные рецепторы. Клонирование Ca²⁺-рецептора также дает возможность разработать трансфекционные клеточные линии, пригодные для скрининга с большим количеством исходного материала природного продукта или молекулярных библиотек и синтетических молекул. Это вместе с исследованиями структура - активность, обсужденными выше, обеспечивает технологию, необходимую для разработки новых кальцимиметиков и кальцилитиков.

Заявитель приспособил такие процедуры в этой заявке. кДНК кальциевого рецептора бычьей паратироидной клетки была клонирована и депонирована в АТСС под номером хранения АТСС 75416. При использовании этого клона легко могут быть получены рецепторы неорганических ионов в других тканях и видовых гомологах. Например, Ca²⁺-рецептор человеческой паратироидной клетки может быть клонирован при скрининге библиотек нуклеиновых кислот или при скрининге функциональной экспрессии в Xenopus ооцитах и могут быть определены структурные признаки органических молекул, необходимые для активности на Ca²⁺-рецепторе, с помощью испытаний выбранных природных продуктов или библиотек других молекул и последующих исследований структура - активность.

Итак, в первом аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу, которая или обладает активностью, подобной внеклеточному Ca²⁺, вызывая увеличение /Ca²⁺/_в в клетке, или блокируют увеличение /Ca²⁺/_в, вызванное внеклеточным Ca²⁺. Молекула имеет ЭК₅₀ менее или равную 5 М и не является протамином.

Термин "миметический" означает, что молекула обладает одним или несколькими специфическими воздействиями внеклеточного Ca²⁺ на отвечающую на внеклеточный Ca²⁺ клетку. Термин не требует, чтобы имитировались все биологические функции внеклеточного Ca²⁺, но по крайней мере одну такую функцию имитируют. Кроме того, не требуется, чтобы молекула связывалась с тем же самым центром на Ca²⁺-рецепторе, как это делает внеклеточный Ca²⁺ (смотри, например, новое соединение NPS 467 и его действие в примере 20 ниже). Термин "блокировать" означает, что одно такое воздействие Ca²⁺ снижается или предотвращается молекулой. ЭК₅₀ может быть определена с помощью анализа, как описано ниже, где измеряется подобная активность и концентрация молекулы, которая имитирует половину максимального мимикрирующего эффекта, является ЭК₅₀. Наоборот, ЭК₅₀ кальцилитика является тем количеством, которое блокирует половину максимальной активности. Предпочтительно такие анализы измеряют возрастание /Ca²⁺/_в и подтверждают специфичность к Ca²⁺-рецепторам с помощью описанных ниже способов или их эквивалента.

В предпочтительных вариантах биоанализ, описанный здесь, показывает, что повышение /Ca²⁺/_в в клетке является кратковременным, имеющим длительность менее одной минуты, и повышение /Ca²⁺/_в является быстрым, происходящим за 30 секунд; и молекула также /а/ вызывает продолжительное (более 30 секунд) повышение /Ca²⁺/_в, /б/ вызывает увеличение уровней инозитол-1,4,5-трифосфата и/или диацилглицерина, например, за менее чем 60 секунд, и /в/ ингибирует образование допамин- или изопротеренолстимулизованного АМФ. В дополнение к этому кратковременное увеличение /Ca²⁺/_в устраняет предварительную обработку клетки в течение 10 минут 10 мМ фторида натрия или кратковременное повышение уменьшается при короткой предварительной обработке (не более 10 минут) клетки активатором протеинкиназы C, например форболмиристатацетатом (ФМА), мезерейном или /-/индолактамом V.

В паратироидной клетке эти молекулы, которые являются активными во всех анализах, описанных выше, являются особенно полезными в настоящем изобретении, поскольку они являются специфическими по своим воздействиям на Ca²⁺-рецептор такой клетки. Это особенно справедливо для описанного выше эффекта предварительной обработки ФМА.

В более предпочтительном варианте клетка является паратироидной клеткой и молекула ингибирует секрецию паратироидного гормона из клетки. Другие предпочтительные варианты включают молекулы, которые вызывают увеличение /Ca²⁺/_в, что определяется, например, как увеличение Cl^- потока, имеющегося обычно в Xenopus ооците, инъецированном мРНК из паратироидной клетки, костного остеокласта, окологломерулярной почечной клетки, проксимальной почечной канальцевой клетки, периферической канальцевой почечной клетки, клетки толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в тироидных /C-клетках/, интестинальной клетки, трофобласта в плаценте, тромбоцита, васкулярной клетки гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клетки, секретирующей гастрин и глюкагон, почечной мезангиальной клетки и клетки грудной железы.

В других предпочтительных вариантах молекула вызывает мобилизацию внутриклеточного Ca²⁺, вызывая увеличение /Ca²⁺/_в, клетка является остеобластом или C-клеткой и молекула ингибирует резорбцию кости in vivo, клетка является остеокластом и молекула ингибирует костную резорбцию in vitro или клетка является C-клеткой и молекула стимулирует секрецию кальцитонина in vitro или in vivo, и наиболее предпочтительно молекула является кальцимиметической или кальцилитической, имеющей ЭК₅₀ или ИК₅₀ при Ca²⁺-рецепторе меньше или равную 5 М и даже более предпочтительно меньшую или равную 1 М, 100 нмолярную, 10 нмолярную или 1 нмолярную. Такие низкие ЭК₅₀ или ИК₅₀ являются выгодными, потому что они позволяют использовать более низкую концентрацию молекулы in vitro или in vivo для лечения или диагностики. Открытие молекул с такими низкими ЭК₅₀ или ИК₅₀ дает возможность конструировать и синтезировать подобным образом мощные и эффективные молекулы.

Под "кальцимиметической" молекулой понимают любую молекулу, которая обладает одной или более активностями внеклеточного Ca²⁺ и предпочтительно имитирует активность Ca²⁺ у рецептора Ca²⁺. Например, при использовании в отношении паратироидной клетки она является молекулой, которая при испытании на паратироидных клетках in vitro обладает одной или более, а предпочтительно всеми из последующих характеристик, как измерено с помощью методик, хорошо известных на данном уровне техники: 1. Молекула вызывает быстрое (время до пика < 5 с) и кратковременное увеличение /Ca²⁺/_в, которое является невосприимчивым к ингибированию 1 М La³⁺ или Gd³⁺. Увеличение /Ca²⁺/_в продолжает существовать в отсутствие внеклеточного Ca²⁺, но исчезает при предварительной обработке иономицином (в отсутствие внеклеточного Ca²⁺).

2. Молекула делает возможным увеличение /Ca²⁺/_в, вызванное субмаксимальными концентрациями внеклеточного Ca²⁺.

3. Увеличение /Ca²⁺/_в, вызванное внеклеточным Ca²⁺, не ингибируется дигидропиридинами.

4. Кратковременное увеличение /Ca²⁺/_в, вызванное молекулой, снимается предварительной обработкой в течение 10 минут 10 мМ фторида натрия.

5. Кратковременное увеличение /Ca²⁺/_в, вызванное молекулой, снижается предварительной обработкой активатором протеинкиназы C /ПКС/, таким как форболмиристатацетат /ФМА/, мезерейн или /-/-индолактам V. Суммарное действие активатора протеинкиназы C является сдвигом вправо кривой концентрация - ответ на молекулу без воздействия на максимальный ответ.

6. Молекула вызывает быстрое (< 30 с) увеличение образования инозитол-1,4,5-трифосфата или диацетилглицерина.

7. Молекула ингибирует образование допамин- или изопротеренолстимулированного циклического АМФ.

8. Молекула ингибирует секрецию ПТГ.

9. Предварительная обработка коклюшным токсином (100 нг/мл в течение > 4 часов) блокирует ингибирующее действие молекулы на образование циклического АМФ, но не оказывает влияния на увеличение /Ca²⁺/_в, инозитол-1,4,5-трифосфата или диацетилглицерина, ни на снижение секреции ПТГ.

10. Молекула вызывает увеличение /Ca²⁺/_в, как определяется, например, как увеличение потока Cl^- в Xenopus ооцитах, инъецированных мРНК, обогащенной поли/A/⁺, из бычьих или человеческих паратироидных клеток, но не оказывает воздействия на Xenopus ооциты, инъецированные водой или мРНК мозга крысы или печени.

11. Подобным образом, используя клонированный рецептор из паратироидных клеток, молекула будет вызывать ответ в Xenopus ооцитах, инъецированных специфической кДНК, мРНК или синтетической смысловой РНК /кРНК/, кодирующей рецептор.

Под "кальцилитической" молекулой понимают любую молекулу, которая блокирует одну или более активностей внеклеточного Ca²⁺ на чувствительную к внеклеточному Ca²⁺ клетку, предпочтительно при действии в качестве антагониста на Ca²⁺-рецептор. Например, при использовании в отношении паратироидной клетки она является молекулой, которая при испытании на паратироидных клетках in vitro обладает одной или более, а предпочтительно всеми из следующих характеристик, как измерено с помощью методик, хорошо известных на данном уровне техники: 1. Молекула блокирует, частично или полностью, способность к увеличению концентраций внеклеточного Ca²⁺, чтобы: а) увеличить /Ca²⁺/_в, б) мобилизовать внутриклеточный Ca²⁺, в) увеличить образование инозитол-1,4,5-трифосфата, г) снизить образование допамин- или изопротеренолстимулированного циклического АМФ, и д) ингибировать секрецию ПТГ.

2. При низкой /Ca²⁺/, т.е. 0,5 мМ, молекула сама не изменяет /Ca²⁺/_в.

3. Молекула блокирует увеличение потока Cl^- в Xenopus ооцитах, инъецированных поли/A/⁺-мРНК из бычьих или человеческих паратироидных клеток, вызванного внеклеточным Ca²⁺ или кальцимиметическими соединениями, но не в Xenopus ооцитах, инъецированных водой или мРНК мозга крысы или печени/ 4. Подобным образом при использовании клонированного рецептора из паратироидных клеток молекула будет блокировать ответ в Xenopus ооцитах, инъецированных специфической кДНК, мРНК или кДНК, кодирующей Ca²⁺-рецептор, вызванный внеклеточным Ca²⁺ или кальцимиметическим соединением.

Параллельные определения полезных кальцимиметиков и кальцилитиков на Ca²⁺-рецепторы на других типах клеток являются очевидными из приведенных ниже примеров.

Рецептор Ca²⁺ способен определить и ответить на некоторые неорганические поликатионы и поликатионные органические молекулы. Например, паратироидная клетка не способна различить увеличение концентрации внеклеточного Ca²⁺ из-за добавления этих органических поликатионов возможно потому, что эти органические молекулы действуют точно подобно внеклеточному Ca²⁺ у Ca²⁺-рецепторов. Кальцимиметические молекулы настоящего изобретения являются особенно хорошими агонистами Ca²⁺-рецептора и могут быть использованы в качестве лекарств, которые изменяют выбранные клеточные функции, например секрецию ПТГ из паратироидных клеток. В противоположность Ca²⁺ большинство этих молекул действует только на один или более, но не на все Ca²⁺-рецепторы и, следовательно, обеспечивают способность специфически воздействовать на один Ca²⁺-рецептор.

Эти молекулы также обеспечивают ведущие структуры для разработки дополнительных новых лекарств, эффективных для лечения различных заболеваний, где имеют значения /Ca²⁺/_в и /Ca²⁺/, таких как гиперпаратироидизм, остеопороз, болезнь Пагета, гипертония, почечная болезнь, заболевание кожи, сердечно-сосудистое заболевание, расстройства свертывания крови, желудочно-кишечные заболевания, эндокринные заболевания, аномальности метаболизма воды и рак.

Кальцимиметики и кальцилитики могут быть сформулированы в виде фармацевтических композиций, которые являются полезными для регулирования уровня внеклеточного свободного Ca²⁺ у пациента и для мимикрирующего действия внеклеточного Ca²⁺ на клетку, выбранную в описанной выше группе, при введении пациенту такой фармацевтической композиции. До настоящего изобретения заявитель не знал о каких-либо таких молекулах, действующих на Ca²⁺-рецептор, полезных для лечения заболеваний, вызванных нерегулярностью в работе или регуляцией Ca²⁺-рецептора, или заболеваний у животных, имеющих нормальные Ca²⁺-рецепторы, но которые могут быть вылечены при активации или дезактивации таких Ca²⁺-рецепторов.

В еще одном предпочтительном варианте молекула имеет ЭК₅₀, меньшую или равную 5 М для одной или более, но не для всех клеток, выбранных в группе, состоящей из паратироидных клеток, костных остеокластов, окологломерулярных почечных клеток, проксимальных почечных канальцевых клеток, периферических канальцевых почечных клеток, клеток толстой восходящей ветви петли Хенля и/или собирающей протоки, кератиноцита в эпидермисе, парафолликулярной клетки в щитовидной железе (C-клетки), интестинальной клетки, трофобласта в плаценте, тромбоцита, васкулярной клетки гладкой мышцы, клетки сердечного предсердия, клеток, секретирующих гастрин и глюкагон, почечной мезангиальной клетки и клетки грудной железы.

Специфичность действия таких молекул является тем, что особенно выгодно в настоящем изобретении, поскольку она обеспечивает специфическое лечение и диагностику in vivo и in vitro и открытие дополнительных кальцимиметических или кальцилитических молекул.

В специальных предпочтительных вариантах молекула является положительно заряженной при физиологическом pH и выбрана в группе, состоящей из разветвленных или циклических полиаминов, положительно заряженных полиаминокислот и аралкиламинов, например разветвленный полиамин имеет формулу H₂N-/CH₂/_j -/NR_i -/CH₂/_j /_k-NH₂, где k является целым числом от 1 до 10, каждый j является одинаковым или различным и представляет собой целое число от 2 до 20, а каждый R_i является одинаковым или различным и выбран в группе, состоящей из водорода и -/CH₂/_j -NH₂, где j имеет указанные ранее значения, и по крайней мере один R_i не является водородом.

В альтернативном варианте молекула имеет формулу где каждый X независимо выбран в группе, состоящей из H, CH₃, CH₃O, CH₃CH₂O, Br, Cl, F, CF₃, CHF₂, CH₂F, CF₃O, CH₃S, OH, CH₂OH, CONH₂, CN, NO₂ и CH₃CH₂, Ar является гидрофобным фрагментом, каждый R независимо выбран в группе, состоящей из водорода, метила, этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, циклопентила, циклогексила, циклогептила, циклооктила, инденила, инданила, дигидроиндолила, тиодигидроиндолила, 2-, 3- или 4-пиперид/ин/ила, Y выбран в группе, состоящей из CH, азота и ненасыщенного углерода, Z выбран в группе, состоящей из кислорода, азота, серы, где каждый n независимо равен 1-4 включительно, а каждый m независимо равен 0-5 включительно. Наиболее предпочтительно молекула является кальцимиметической или кальцилитической.

В предпочтительных вариантах гидрофобный фрагмент выбран в группе, состоящей из фенила, 2-, 3- или 4-пиридила, 1- или 2-нафтила, 1- или 2-хинолила, 2- или 3-индолила, бензила и фенокси; молекула является производным R-фенилпропил--фенетиламина и молекула имеет формулу где каждый X предпочтительно независимо выбран в группе, состоящей из Cl, F, CF₃, CH₃ и CH₃O.

В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения новые аналоги и производные фенилпропил--фенетиламина имеют формулу где alk является алкиленом с прямой или разветвленной цепью, содержащей 1-6 атомов углерода, R₁ является низшим алкилом с 1-3 атомами углерода или низшим галоидалкилом с 1-3 атомами углерода, замещенным 1-7 атомами галоида, R₂ и R₃ являются независимо выбранными карбоциклическими арильными или циклоалкильными группами, или моноциклическими или бициклическими, имеющими 5- или 6-членные циклы, необязательно замещенные 1-5 заместителями, независимо выбранными среди низшего алкила с 1-3 атомами углерода, низшего галоидалкила с 1-3 атомами углерода, замещенного 1-7 атомами галоида, низшего алкокси с 1-3 атомами углерода, галоида, нитро, амино, алкиламино, амидо, низшего алкиламидо с 1-3 атомами углерода, циано, гидроксила, ацила с 2-4 атомами углерода, низшего оксиалкила с 1-3 атомами углерода или низшего тиоалкила с 1-3 атомами углерода. Подходящие карбоциклические арильные группы являются группами, имеющими одно или два кольца, по крайней мере одно из которых имеет ароматический характер, и включают карбоциклические арильные группы, такие как фенил, и бициклические арильные группы, такие как нафтил. Как видно из приведенной выше формулы, соединения, охватываемые ею, могут существовать в виде рацемических смесей и в виде индивидуальных изомеров. Особенно предпочтительными являются производные R-фенилпропил--фенетиламина, которые проявляют повышенную активность при понижении сывороточного ионизированного кальция.

Предпочтительные соединения включают те, у которых alk является н-пропиленом. Также предпочтительными являются соединения, у которых R₁ является метилом. Также предпочтительными являются те соединения, у которых R₂ и R₃ являются необязательно замещенными фенилами.

Особенно предпочтительные соединения включают те, у которых R₂ является монозамещенным фенилом, более предпочтительно метазамещенным. Особенно предпочтительные R₃ группы включают незамещенный или монозамещенный фенил, особенно ортозамещенный. Предпочтительные заместители для R₂ включают галогид, галоидалкил, предпочтительно тригалоидметил, и алкокси, предпочтительно метокси. Предпочтительные заместители для R₃ включают галоид, предпочтительно хлор.

Во втором родственном аспекте изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего заболевание или состояние, характеризующееся аномальной /Ca²⁺/ или /Ca²⁺/_в в одной или более клетках или в крови, или в плазме, или во внеклеточных жидкостях. Способ включает стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества молекулы, которая или имитирует активность внеклеточного Ca²⁺, вызывая повышение /Ca²⁺/_в в клетке, или блокирует повышение /Ca²⁺/_в, вызванное внеклеточным Ca²⁺.

Под "аномальным" понимают, что пациент по сравнению с общей популяцией имеет другой метаболизм Ca²⁺, который находится под воздействием одного или более белков /например, гормонов/ в крови или внеклеточных жидкостей организма, или других молекул, которые влияют на уровень внеклеточного и/или внутриклеточного Ca²⁺. Итак, заболевания включают гиперпаратироидизм, остеопороз и другие костные и минерально-зависимые болезни и т.п. (как описано, например, в стандартных медицинских справочниках, таких как "Harrison's Principles of Internal Medicine"). Такие заболевания лечат в настоящем изобретении молекулами, которые имитируют или блокируют один или несколько эффектов Ca²⁺ и в результате непосредственно или косвенно влияют на уровни белков или других молекул в организме пациента.

Под "терапевтически эффективным количеством" понимают количество, которое устраняет до некоторой степени один или более симптомов заболевания или состояния пациента. Дополнительно, под "терапевтически эффективным количеством" понимают количество, которое возвращает к нормальным, частично или полностью, физиологические или биохимические параметры, ассоциированные с или вызванные заболеванием или состоянием. Обычно это количество находится между примерно 1 нмолем и 1 молем молекулы, в зависимости от ее ЭК₅₀ и возраста пациента, его размеров и заболевания.

В предпочтительных вариантах молекула имеет ЭК₅₀ меньше или равную 5 М и она не является протамином; и наиболее предпочтительно взаимодействует с Ca²⁺-рецептором кальцимиметически или кальцилитически. Наиболее предпочтительно молекула выбрана среди одной из описанных выше.

В других предпочтительных вариантах пациент имеет заболевание, характеризующееся аномальным уровнем одного или более компонентов, уровень которых регулируется или находится под воздействием активности одного или более