Пептиды, способ их получения, фармацевтическая композиция и способ ее получения

Пептиды, способ их получения, фармацевтическая композиция и способ ее получения

Реферат

 

Изобретение относится к области биологии клеток, в частности к новым пептидам, обладающим способностью взаимодействовать с внутриклеточным трансдуктором сигнала, препятствуя тем самым процессу передачи сигнала, приводящему к пролиферации и подвижности клеток. Описывается новый пептид, имеющий последовательность части внутриклеточной области рецептора фактора роста гепатоцидов человека общей формулы X_n - YVN (или Н) V - X_c, где X_n и X_c каждый является последовательностью 0 - 16 аминокислот. Пептиды могут быть использованы для лечения опухолевых заболеваний. Описываются способ их получения, фармацевтическая композиция и способ ее получения. 4 с. и 13 з.п. ф-лы, 16 ил.

Изобретение относится к области биологии клетки, в частности к новым пептидам, способным взаимодействовать с трансдукторами внутриклеточного сигнала и тем самым препятствовать процессу передачи сигнала, приводящему к пролиферации и подвижности клеток. Изобретение относится также к способу получения указанных пептидов, фармкомпозиции на их основе и способу получения таких композиций.

Известно, что полипептидные факторы роста опосредуют физиологические ответы путем связывания рецепторов клеточной поверхности с тирозин-киназой, обладающей ферментной активностью (см. Ullrich A. и Schlessinger J. Cell 61: 203 - 211 (1990). После связывания этих лигандов рецепторы фактора роста подвергаются димеризации с последующим аутофосфорилированием специфичных тирозиновых остатков.

Во внутриклеточной среде, окружающей белки, имеются молекулы с определенными биологическими функциями, служащие в качестве субстратов для лиганд-активированных тирозин-киназных рецепторов.

Экспериментальные данные, накопленные за последние годы, свидетельствуют о том, что после связывания с рецептором эти субстратные молекулы преобразуются в свою активированную форму и становятся важными участниками процесса передачи сигнала с использованием факторов роста для регулирования пролиферации клеток.

Показано, что некоторые цитоплазматические молекулы, которые опосредуют клеточный ответ на действие факторов роста, взаимодействуют с активированными рецепторами посредством их SRC-гомологичной области 2 (Koch C.A. et al. Science 252: 668 - 674 (1991), (SH2)-домена.

Домен SH2 представляет собой консервативную область белка, составляющую приблизительно 100 аминокислот, и обнаруживаемую в самых различных группах цитоплазматических белков, участвующих в передаче сигнала.

Белки, имеющие SH2-домены, часто обладают характерной последовательностью приблизительно в 50 остатков (домен SH3) которая также участвует в регуляции белок-белкового взаимодействия в процессе передачи сигнала (см. Clark. G. и др. Nature 356: 340 - 344 (1992) и ссылки).

Аутофосфорилирование рецептора после связывания с лигандом действует как переключение этого рецептора на создание сайтов связывания для SH2-доменов цитоплазматических сигнальных белков (Anderson D и др. Science 250: 979 - 982 (1990), которые становятся, тем самым, мишенями или активации SH2-домены способны непосредственно распознавать фосфотирозин (Matsuda. M. и др. Science 248: 1537 - 1539 (1990).

Однако для достижения высокой аффинности SH2-домена необходимо, чтобы фосфотирозин входил в состав специфической аминокислотной последовательности, как первоначально предполагалось исходя из анализа сайтов SH2-связывания (Cantley L.C. и др. Cell 64: 281 - 302 (1991).

Например, каждый из SH2-содержащих белков, а именно фосфатидилинозитол (P1)-3-киназа, Ras-G-TP-дезактивирующий белок (Ras-GAP) и фосфолипаза C-(PLC-), связывается с различными сайтами аутофосфорилирования -рецептора для тромбоцитарного фактора роста (Kashishian. A. EMBO J. 11: 1373 - 1382 (1992), Fantl. W.J. и др. Cell 69: 413 - 423 (1992).

Сайты аутофосфорилирования, действующие как специфические сайты связывания ("прикрепления") для P1-3-киназы, PIC -, и Ras-GAP, идентифицированы в рецепторе эпидермального фактора роста (EGF-R), рецепторе колониестимулирующего фактора 1 (CSF-IR) и в рецепторе фактора роста фибробластов (FGF-R) (Cantley L.C. et. al. Cell 64: 281 - 302 (1991) Mohammadi M. et. al. Mol. Cell. Biol 11: 5068 - 5078 (1991) Reedij K. M. et al., EMBO J. 1: 1365 - 1372 (1992) Rotin D. et. al. EMBO J. 11: 559 - 567 (1992).

Известно, что относительно короткие пептидные последовательности, соответствующие сайтам фосфорилирования рецептора PDGF (тромбоцитарного фактора роста), ингибируют взаимодействие между активированным PDGF рецептором и P1-3-киназой (Escobedo J. A. и др. Mol. Cell. Biol. 11: 1125 - 1132).

Очевидно, что селективность в отношении специфических SH2-доменов обеспечивается остатками, раcположенными непосредственно возле фосфотирозина с C-конца, особенно остатками в положениях + 1, + 2 и + 3.

Таким образом, элемент распознавания для p 85-субъединицы P1-3-киназы идентифицирован в PDGF-рецепторе: т. е. этот элемент представляет собой последовательность Tyr-Met/Val-Xxx-Me^t (YMXM или YVXM), где Xxx и X являются любым аминокислотным остатком в трехбуквенном или однобуквенном обозначении, соответственно (Domchek S. M. и др. Biochemistry 31: 9865 - 9870 (1992).

В настоящее время идентификация новых членов семейства SH2-содержащих молекул, а также соответствующего элемента распознавания быстро продвигается.

Известно непосредственное участие некоторых из этих молекул в выявлении биологического ответа к лиганду. Высказывают предположение, что такой молекулой является белок Grb2, который ассоциируется, посредством своего SH2-домена, с EGF-рецептором после стимуляции лигандом.

Микроинъекция белков Grb2 и H-ras в клетки млекопитающего приводит к стимуляции синтеза ДНК и тем самым к митогенному эффекту (Lowenstein E.J и др. Cell 70, 431 - 442 (1992).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что Grb2 играет важную роль в механизме регулирования фактором роста передачи ras-сигнала.

Задачей настоящего изобретения является исследование рецептора фактора роста гепатоцитов (HGF).

HGF, известный также как фактор Скаттера (Scatter) (SF), представляет собой гетеродимерный белок, выделяемый клетками мезодермального происхождения (Stoker M. и др, Nature 327: 239 - 242 (1987), Weidner K.M. и др. J. Cell Biol 111: 2097 - 2108 (1990).

Этот фактор индуцирует определенный спектр биологических активностей в эпителиальных клетках, включая митогенез, стимуляцию подвижности клеток, и стимуляцию матриксной инвазии (Makamura T. et. al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 122: 1450 - 1459 (1984), Stoker. M. et. al, Nature 327: 239 - 242 (1987), Weidner K.M. et. al. J. Cell Biol. 111: 2097 - 2108 (1990), Pubin. J. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 415 - 419 (1991).

HGF/SF также представляет собой морфогенный in vitro (Stern C.D. et. al, Development 110: 1271 - 1284 (1990) Montesano et. al. Cell 66: 697 - 711 (1991) и сильный антигенный фактор in vitro и in vivo (Bussolino. M. F. et. al. J. Cell. Biol. 119: 629 - 641 (1992).

Хотя биологическое действие HGF/SF варьируется в зависимости от клетки-мишени, однако HGF/SF сигнал опосредуется одним конкретным рецептором, а именно, рецептором тирозин-киназы, кодируемой МЕТ-протоонкогеном (см. например, Comoglio P.M. в "I.D. Goldberg. & E.M. Rosen (eds) Hepatocyte Grown Factor-Scatter Factor (HGF/SF) and C-Met Receptor, Birkhauser Verlag Basel / Switzerland".

HGF-рецептор, известный также как p190^MET, представляет собой гетеродимерный рецептор, состоящий из внеклеточной и трансмембранной -субъединиц (Giordano. S. и др. Nature 339: 155 - 156 (1989), обе из которых образуются в результате протеолитического расщепления общего одноцепочечного предшественника (170 кДА) (Giordano S. и др. Oncogene 4: 1383 - 1388 (1989).

NIH3T3-фибробласты, трансфицированные MET-кДНК человека, экспрессируют функциональные рецепторы и индуцируют реакцию на HGF/SF с увеличением подвижности и инвазии внеклеточного матрикса (Giordano S и др. PNAS, 90: 649 - 653 (1993).

Нерегулируемая тирозин-киназная активность HGF/SF-рецептора наблюдается в трансформированных клеточных линиях после хромосомных перестроек (Park и др. Cell 45: 895 - 904 (1986), сверхэкспрессии гена (Giordano S. и др. Nature 339: 155 - 186 (1989) "дефектного посттрансляционного процессинга (Mondino и др. Mol. Cell. Biol. 11: 6084 - 6092 (1991) и самосжатия петли.

Сверхэкспрессия рецептора наблюдается в ряде человеческих опухолей эпителиального происхождения (Di Renzo и др. Oncogene 6: 1997 - 2003 (1991), Di Renzo и др. Oncogene 7: 2549 - 2553 (1992) Prat и др. Int. J. Cancer, 49: 323 - 328 (1991).

Этот факт особенно явно указывает на онкогенный потенциал HGF/SF-рецептора.

Однако очень мало имеется сведений о пути трансдукции сигнала, стимулируемого HGF/SF.

Плейотропный биологический ответ, индуцируемый указанным фактором, позволяет предположить, что может быть активирован более чем один механизм традукции. Еще ранее, авторами настоящего изобретения показано, что HGF/SF-рецептор после аутофосфорилирования связывается in vitro с P1-3-киназой, ras-GAP, PLC - и Src-ассоциированной тирозин-киназой (Bardelli A. и др. Oncogene 7: 1973 - 1978 (1992).

Ассоциирование P1-3-киназы с активированным рецептором обнаружено in vivo в клетках, стимулированных HGF/SF (Graziani A. и др. J. Biol. Chem. 266: 22087 - 22090 (1991) Недавно авторами настоящей заявки показано, что HGF/SF активирует Ras путем усиления обмена между его GDP- и GTP-связанным состоянием посредством стимуляции фактора гуанин-нуклеотидного обмена (Graziani A. и др. J. Biol. Chem. в печати (1993).

Авторами настоящей заявки также обнаружено, что HGF/SF-рецептор ассоциируется с белками Shc и Gbr 2. Ген Shc млекопитающего кодирует три с высокой степени экспрессируемых перекрывающихся белка размером 66, 46 и 52 кДА (p66^Shc, p46^Shc и 52^Shc), содержащие C-концевой SH2-домен и N-концевой коллаген-подобный домен (Pel^icci и др. Cell 70: 93-104 (1992). Белки p46^Shc и p52^Shc кодируются тем же самым транскриптом с использованием двух различных ATG.

Белок p66^Shc кодируется альтернативно сплайсированным транскриптом (Migliccio и др. в работе). Экспериментальные данные указывают на то, что Shc-белки участвуют в трансдукции сигналов, генерированных рецепторами тирозин-киназы. Помимо этого наблюдается быстрое тирозин-фосфорилирование Shc-белков в ответ на активацию EGF-рецептора (PeIicci и др. см. выше) и PDGF-рецептора (неопубликованные данные), Erb-B-2-(Segatto и др. Oncogene 2105-2112 (1993), Src и Fps (McGIage и др. Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 8869-8873 (1992). Сверхэкспрессия Shc-белков индуцирует чрезмерный рост нейритов в феохромоцитомных клетках PC12, и это действие блокируется экспрессией доминант-негативного Ras-мутанта (Rozakis-Adcock и др. Nature 360: 689-692 (1992). После стимуляции клеток некоторыми факторами роста Shc-белки образуют стабильные комплексы с Grb 2//Sem5-адаптором (Lowenstein и др. Cell 70: 431-442 (1992), Rozakis-Adcock и др. см. выше). Известно, что указанный адаптор активирует функции посредством рекрутинга SoS, фактора гуанин-нуклеотидного обмена (Li и др. Nature 363: 85-87 (1993), Gale и др. Nature 363: 88-92 (1993), Rozakis-Adcock и др. Nature: 363:83-85(1993), Egan и др. Nature 363: 45-51 (1993), Simon и др. Cell 73: 169-177 (1993) Oliver и др. Cell 73: 179-191 (1993) к мембране.

Исходя из вышеуказанного очевидно, что взаимодействие между активированным рецептором тирозин-киназы и молекулой цитозольного трансдуктора является решающей стадией в процессе передачи сигнала, способствующей пролиферации клетки и ее подвижности.

Поскольку указанные биологические реакции представляют собой наиболее характерные отличительные особенности роста и распространения опухолей, то любому специалисту ясно, что необходимо разработать способы, препятствующие вышеуказанному взаимодействию.

Целью настоящего изобретения являются новые фосфопептиды, способные взаимодействовать с трансдукторами внутриклеточного сигнала, и тем самым препятствовать процессу, приводящему к пролиферации и подвижности клеток, а также к инвазии внеклеточного матрикса.

Эти биологические свойства могут быть использованы для ингибирования роста опухолевых клеток и их метастатического размножения.

Настоящим изобретением получены следующие новые сведения: (1) Shc-белки, связываются с тирозин-фосфорилированным SF/HGF -рецептором посредством SH2-домена: (2) Shc белки связываются с фосфотирозином Y¹³⁵⁶ и Y¹³⁵⁶ концевой части SF/HGF-рецептора, (3) сверхэкспрессия Shc-белков способствует усилению мотогенного ответа на SF/HGF, (4) после связывания с SF/HGF-рецептором, Shc-белки фосфорилируются в Y³¹⁷, (5) Shc-белки, фосфорилованные в Y³¹⁷, образуют специфические комплексы с белками Grb2 и (6) сайт связывания с Crb2 на Shс (Y³¹⁷ VNV) имеет последовательность, идентичную последовательности сайтов связывания с сигнальным трансдуктором, находящимся на HGF/SF рецепторе (YVNV).

Поставленная цель достигается новыми синтезированными пептидами из сайтов связывания с Crb2, находящихся в Shc и из сайтов связывания с Shc содержащих распознающие участки Y¹³⁴⁹ VHV и Y¹³⁵⁶ VNV на рецепторе фактора роста гепатоцитов. Эти пептиды обладают способностью ингибировать процессы, приводящие к пролиферации и подвижности клеток, а также к инвазии внеклеточного матрикса.

В соответствии с этим настоящее изобретение, кроме того, относится к пептиду, содержащему последовательность части Shc-белка, который обладает способностью связываться с трансдуктором цитозольного сигнала. Этот пептид, в основном, способен ингибировать связывание между белками и Crb2 или между белками Crb2 и активированным рецептором фактора роста гепатоцитов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему последовательность части внеклеточной области рецептора фактора роста гепатоцитов и обладающему способностью связываться с трансдуктором цитозольного сигнала.

Указанный пептид, в основном, способен ингибировать связывание между Shc-белками или p85-субъединицей фосфатидил-инозитол-3-киназы и активированным рецептором фактора роста гепатоцитов, либо между Shc и другими трансдукторами цитозольного сигнала.

Пептидами настоящего изобретения являются, в основном, тирозин-содержащие молекулы, представляющие собой сайты фосфорилирования тирозина. Эти пептиды имеют длину, например, в 4-20 аминокислот, в частности 8-12 аминокислот.

Из таких пептидов, в основном, продуцируются потенциальные участки распознавания для SH2-доменов трансдукторов внутриклеточного сигнала.

Указанные пептиды могут содержать 4-20 аминокислот и иметь последовательность X_N-YVN (или H)_V-X_c, где X_N и X_c каждый представляют собой последовательности, состоящие из 0-16 аминокислот.

Предпочтительно, если X_N и X_c представляют собой последовательности, фланкирующие одну из последовательностей Y_VN (или H)_V в HGF-/SF-рецепторе и Shc-белка. Взаимодействие трансдуктора с активированным рецептором тирозин-киназы стимулирует рекрутинг и активацию самого трансдуктора.

Активация HGF/SF-рецептора может быть физиологической (т.е. является результатом связывания с лигандом и димеризации рецептора), либо конститутивной (т. е. рецептор непрерывно активируется даже в отсутствие лиганда). Причем конститутивная активация может происходить в том случае, когда рецептор не содержит внеклеточного домена связывания с лигандом, например в случае онкогенного рецептора, либо после хромосомной транслокации (например, в случае TPP-МЕТ-слияния, описанного ниже). Установлено, что большинство трансдукторов внутриклеточного сигнала коррелирует с клеточным ростом и онкогенной трансформацией (Fantl W.J. и др. Cell, 69: 413-423 (1992) Reedijk и др. MoI Cell. Bioll 10: 5601-5608 (1990) Lowenstein E.J. и др. Cell 70: 431-442 (1992) Таким образом, ингибирование связывания с активированным рецептором тирозин-киназы или связывания между Shc-белком, и другими трансдукторами приводит к ингибированию клеточного митогенеза и мотогенеза, а поэтому пептид настоящего изобретения позволяет предотвратить развитие опухоли.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пептид выбирают из следующих пептидов (см. табл. 1 в конце описания).

Из всех известных трансдукторов внутриклеточного сигнала P1-3-киназа связывается с HGF рецепторами либо in vitro, либо in vivo после стимулирования лигандом. Однако распознающий эту киназу элемент на HGF/SF рецепторе еще не определен.

Предыдущее исследование, приведенное с использованием PDGF - рецептора, показывает, что аминокислотная последовательность, состоящая из 4 аминокислот, а именно, Tyr-Xxx-Xxx-Met (YXXM), где (Xxx или X представляют собой любой аминокислотный остаток в трехбуквенном или однобуквенном обозначении, соответственно) представляет собой каноническую консенсусную последовательность для P1-3-киназы.

В HGF-рецепоре имеется потенциальный участок распознавания Ter-Glu-Val-Met (Y¹³¹³ EVM), который может представлять собой сайт связывания с P1-3-киназой.

Экспериментальные результаты неожиданно показали, что хотя синтетический фосфопептид, содержащий консенсусную последовательность Y^{1313 EVM}, способен связываться без какого-либо воздействия на связывание с P1-3-киназой.

Используя синтетический фосфопептиды настоящего изобретения и рецепторные Tyr-Phe-мутанты, идентифицированы сайты связывания для P1-3-киназы с двумя фосфотирозинами в положении 1349 и 1356, что иллюстрируется с помощью данных ингибирования, полученных с использованием фосфопептидов: H-Tyr^*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH, H-Tyr^*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH и H-Tyr^*-Val-His-Val-Ash-Ala-Thr-Tyr^*-Val-Asn-Val-Lys-OH.

Таким образом, эти остатки идентифицируют новый участок распознавания для P1-3-киназы Tyr-Val-(Asn или His)-Val-[YV(N или H)V], а соответствующие фосфопептиды могут быть с успехом использованы в качестве ингибиторов связывания HGF-рецептора с P1-3- киназой.

Поэтому в соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительно использован фосфопептид, имеющий формулу: H-Tyr^*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH или H- Tyr^*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala-OH или H-Tyr^*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr^*-Val-Asn-Val-Lys-OH, где Tyr^* означает остаток фосфорилированного тирозина.

В еще одном предпочтительном варианте настоящего изобретения пептид имеет формулу: H-Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr^*-Val-Asn-Val-Glu-OH (DDPSY^*VNVQ), где Tyr^*(Y^*) представляет собой фосфорилированный или нефосфорилированный тирозин.

Пептиды настоящего изобретения могут быть получены в виде их фармацевтически приемлемых солей. Подходящими для этих целей солями являются основные соли, такие как соли щелочных металлов (например, соли натрия или калия) и соли аммония, а также кислые аддитивные соли, также как гидрохлоридные и ацетатные соли.

Пептиды настоящего изобретения могут быть синтезированы стандартным методом, например, таким как метод, описанный Escobedo J.A. и др. Mol. Cell, Biol. 11:1125-1132 (1991) или Turck C.W. Peptid Res. 5:156-160 (1992), например, с использованием защищенного предварительно фосфорилированного тирозинового остатка.

В частности, указанные пептиды могут быть получены с использованием жидкостного или твердофазного методов, известных каждому специалисту (Schroeder et al "The Peptides" Vol. 1, Academic Press 1965, или Bodanszky et al. "Peptide Synthesis", Interscience Publiscers 1966, или Meomie (ed) "Protective Group in Organic Chemistry", Plenum Press, 1973, или Barany et al. , "The Peptiodes: Analysis, Synthesis, Boibogy" 2, Chapter 1, Academic Press 1980).

Настоящее изобретение относится также к способу получения пептида настоящего изобретения путем химического синтеза пептида из отдельных аминокислот и/или из предварительно cинтезированных пептидов, состоящих из двух или более аминокислотных остатков.

Если необходимо получить пептид, в котором тирозиновый остаток является фосфорилированным, то предварительно фосфорилированный защищенный тирозиновый остаток может быть введен в процессе твердофазного синтеза, либо тирозиновый остаток в предварительно полученном защищенном пептиде может быть фосфорилирован, после чего указанный пептид может быть присоединен к твердому носителю.

В случае твердофазного синтеза может быть использован любой ручной или автоматический синтезатор пептидов, с помощью которого может быть осуществлен постадийный синтез пептидов на полимерном носителе с использованием BOc- или Fmoc-стратегии.

Все реагенты, используемые в качестве исходных материалов, являются коммерческими продуктами, либо они могут быть получены и очищены в соответствии со стандартной технологией.

При получении фосфопептида во избежание отщепления фосфатной группы в процессе разблокирования защищенных пептидов используют раствор трифторметансульфоновой кислоты/ трифторуксусной кислоты, содержащий соответствующую смесь акцепторов.

Разблокированные пептиды очищают с помощью обращенно-фазовой высокоразрешающей жидкостной хроматографии на C18-уоас-колонке (Hesperia Calif) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте, используя линейный градиент ацетонитрила, после чего эти пептиды выделяют и подвергают лиофилизации. Все фосфолипиды получают в виде полигидратированных политрифторацетатов. Содержание пептидов во всех продуктах составляет 65-90%, а хроматографическая чистота составляет более чем 95% при относительной интеграции ВЭЖХ-пиков при = 225 нм. Аминокислотный анализ осуществляют на гидролизатах кислоты (110^oC, 22 час, в 6 н. HCl+0,1% фенол). Альтернативно, сначала может быть синтезирован пептид, содержащий нефосфорилированный тирозин, а затем в тирозиновый остаток может быть введена фосфатная группа с помощью ферментного или химического метода в этом случае, другие функциональные группы, восприимчивые к реакции с фосфорилирующим гаентом, должны быть соответствующим образом защищены.

В настоящем описании обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с IUPAC-IUB по биологической номенклатуре (см. Eur. J. Biochem vol. 138-9-37, 1984). В частности, в тексте настоящего описания использованы следующие обозначения: Вос-т-бутилоксикарбонил: t Bu-трет-бутил, BzI-бензил, ClZ-4-хлорбензилоксикарбонил, DPCDI-диизопропилкарбодиимид, ДХМ-дихлорметан, ДМФ-диметилформамид, ДНФ-динитрофенил, Fmoc-9-флуоренилметоксикарбонил, ОФ-ВЭЖХ-обращенно-фазовый высокоразрешающая жидкостная хроматография, Trt-тритил.

Способность фосфопептидов настоящего изобретения ингибировать связывание внутриклеточных трансдукторов с рецептором тирозин-киназы или Shc - белком может быть экспериментально проанализирована на конкуретное связывание, как показано в экспериментальной части, посвященной связыванию с рецептором тирозин-киназы.

Биологическое значение сайтов аутофосфорилирования на рецепторе тирозин-киназы проиллюстрировано ниже (см. экспериментальную часть) с помощью анализа на фокус-образование.

Этот анализ, в частности, иллюстрирует каким образом трансформирующая активность нативного активированного HGF-рецептора может быть эффективно ингибирована посредством мутации специфических сайтов аутофосфорилирования на самом рецепторе (мутация Tyr-Phe).

Пептид, репродуцирующий один из свойств фосфорилирования HGF - /SF-рецептора или Shc, может затем препятствовать связыванию трансдукторов, ингибируя, тем самым, передачу "вниз по течению" митогенного и мотогенного сигнала.

Поэтому пептиды настоящего изобретения могут быть использованы для лечения опухолевых заболеваний у человека или животных Пептиды настоящего изобретения могут быть фосфорилированными или нефосфорилированными. Активная форма пептидов обычно является фосфорилированной, но может оказаться предпочтительным вводить пептид в нефосфорилированной форме для того, чтобы он затем фосфорилировался в организме человека. Преимущество такого введения заключается в том, что в нефосфорилированном виде пептиды легче поглощаются клетками.

Пептиды настоящего изобретения могут быть введены пациенту любым традиционным парентеральным способом, либо для повышения ферментной стабильности и клеточной проницаемости эти пептиды могут быть соответствующим образом конъюгированы.

Выбор типа парентерального введения (т.е. подкожного, внутривенного или внутримышечного введения), дозы и частоты введения зависит от ряда факторов. Такими факторами являются цель введения, возраст, вес и состояние пациента. И в соответствии с этими факторами определяется терапевтически эффективное количество данного пептида. Однако, в основном, пептид вводят в количестве от 10 до 1000 мкг на дозу, а предпочтительно от 50 до 500 мкг на дозу (для каждого способа введения).

Пептид настоящего изобретения может быть введен в виде фармацевтической композиции. Такая фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Выбор соответствующего носителя или разбавителя зависит от способа введения композиции.

Настоящее изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами.

Описание чертежей.

Фиг. 1. Ингибирование связывания p 85 с HGF /SF-рецептором с использованием тирозин-фосфорилированных пептидов.

Рекомбинатный HGF /SF-рецептор выделяют путем иммунопреципитации из инфицированных бакуловирусных клеток Sf9 с использованием кроличьей поликлональной антисыворотки и фосфорилируют холодным ATP. Лизаты клеток Sf9, экспрессирующих p 85, предварительно инкубируют с каждым из фосфопептидов (10 мкМ). Затем эти лизаты оставляют для связывания с иммобилизованными рекомбинантными HGF/SF рецепторами. После связывания комплекс промывают и связанный с рецепторами p85-белок детектируют с помощью киназного анализа in vitro, как описано в "Материалах и методах" примера 4. Фосфопептиды идентифицированы.

Фиг. 2. Ингибирование связывания p85 с HGF/SF-рецептором с использованием различных концентраций тирозин-фосфорилированных пептидов.

Фосфопептиды, которые успешно конкурируют, с p85 в связывании с HGF/SF-рецептором (фиг. 1), используют в возрастающих концентрациях (10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, слева направо) для того чтобы определить их относительное сродством к p85. Условия эксперимента аналогичны условиям, описанным в фиг. 1, фосфопептид 1365 используют в качестве негативного контроля при взаимодействии с p 85.

Фиг. 3. Ингибирование связывания P1-3 -киназного холофермента с HGF /SF-рецептором тирозин-фосфорилированными пептидами.

Фосфопептиды, которые успешно конкурируют с p85 (фиг.1), анализируют на их способность ингибировать связывание P1-3-киназного хлорфермента с HGF /GF рецептором. Цитозольные экстракты, полученные от клеток A549, которые были в течение трех дней культивированы в минимальной среде, предварительно инкубируют с каждым из фосфопептидов (10 мкМ), после чего эти экстракты инкубируют с иммобилизованным рекомбинантным HGF /SF-рецептором. Присутствие ассоциированной с рецептором P1-3-киназы в иммунокомплексах определяют с помощью анализа на P1-3-киназную активность, описанного в примере 4, в главе "Материалы и методы". На чертеже показано положение фосфатидилинозитол-3-фосфатного (PIP)продукта P1-3-киназной реакции.

Фиг. 4. Влияние Tyr-Rhe-мутаций на взаимодействие HGF /SF-рецептора с p85.

Клетки COS 7 трансфецированы плазмидами, кодирующими HGF /SF рецептором дикого типа (wt) или рецепторы, в которых тиразиновый кодон в указанном положении превращен в фенилаланиновый кодон отдельно или в комбинации. Клетки COS 7 экспрессируют эндогенный HGF /SF-рецептор. Однако обезьяний белок не распознается моноклональным антителом, направленным против карбоксиконцевого человеческого пептида. Эти антитела используют для селективной иммунопреципитации человеческого HGF /SF-рецептора из трансфецированных клеток COS 7. Иммобилизованные предварительно фосфорилированные рецепторы инкубируют с лизатами клеток Sf9, экспрессирующих p85. Панель A: рецептор и p85 подвергают мечению с помощью киназного in vitro - анализа, описанного в примере 4 в "Материалах и методах". Панель B: присутствие p85 в рецепторном иммуном комплексе определяют путем иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител против p85.

Фиг. 5. in vivo - влияние Tyr-Phe- -мутаций на взаимодействие HGF /SF-рецептора с P1-3-киназным холоферментом.

Клетки COS 7, экспрессирующие рецептор дикого типа или мутированные рецепторы, стимулируют с использованием HGF /SF и лизируют. Рецепторы осаждают посредством иммунопреципитации с использованием античеловеческого моноклонального антитела.

Панели A и B: присутствие P1-3-киназы, связанной с рецептором, определяют с помощью анализа на P1-3-киназную активность, описанного в примере 4 ("Материалы и методы"). На чертеже показано положение фосфатидилинозитол-3-фосфатного (PIP) продукта P1-3-киназной реакции. Панели C и D: с помощью иммуноблоттинга (с использованием античеловеческого моноклонального антитела) показано, что образцы, проанализированные на P1-3-киназную активность, содержат эквивалентные количества рекомбинантного рецептора. Мутантный TK^--рецептор получают путем замены аспарагиновой кислоты в положении 1204 на аспарагиновый остаток. Эта мутация приводит к инактивации HGF/SF-рецептора в отношении киназы.

Фиг. 6. Идентификация Y₁₃₄₉ и Y₁₃₅₆ как сайтов in vitro-фосфорилирования в HGF /SF-рецепторе путем триптического фосфопептидного картирования.

Профиль A иллюстрирует ВРЖХ (при 214 нм) синтетического нефосфорилированного пептида (124 K), который соответствует триптическому пептиду, содержащему тирозин Y₁₃₄₉ и Y₁₃₅₆ в HGF/SF-рецепторе. 124 K элюирует из ВРЖХ-колонки через 65 минут. B и C иллюстрируют профили радио -ВРЖХ-элюции триптических фосфопептидов, полученных in vitro от [V³²P]ATP-фосфорилированного рецептора дикого типа (B) и Phe_1349-1356-мутантного рецептора (C) Фиг. 7 Оценка относительных аффинитетов фосфотиразина 1313, 1349 и 1356 в отношении N- и C -SH2-доменов p85-белка.

Аффинитеты определяют с помощью анализа на биоспецифическое взаимодействие с использованием прибора BIAcore (Jonsson. U. Fagerstam L, Roos H, Ronnberg J, Sjolander, Stenber E, Stahlberg R, UrbaniczKy C, Octlin H и Halmguist. 1991, Surface plasmon reasonance and microfluidics for real time biospecific interaction analysis. Aiotechnigues 11: 520-527, Jonsson U. &c. M. Malmguist 1992 Real time biospecitic ana lysis. The intergration of surface plasmon resonance detection, general biospecific interface chemistry and microfluidics into one analytic system p. 291-336. B" F. Turner(ed) Advaces in Bioslnsors, vol. 2. JAI Press, London, Karlsson, R. Michaelsson A. &c. L. Mattsson. 1991. Kinetic analisis of monoclonal antibody-antigen interaction with a new biosensor based analytical system. J. Jmmunol. Meth. 145: 229-246) Относительные аффинитеты определяют путем оценки способности фосфопептидов ингибировать взаимодействие SH2-доменов с иммобилизованным фосфопептидом (DMSKDESVDVVPMLDMK), который включает в себя Y₇₅₁ чел. PDGF-рецептор. На фиг. 7A и 7B показаны результаты этой оценки, выраженные как % ингибирования связывания с Y₇₅₁ фосфопептида. На фиг. 7C показаны концентрации фосфопептида, составляющего половину от максимального ингибирования связывания.

Фиг. 8. Анализ на фокус-образование с использованием различных TPR-MET-конструкций.

В TPT-MET¹³⁴⁹, TPR-MET-Phe¹³⁵⁶ и TTP-MET-Phe^1349-1356, тирозиновые остатки, соответствующие Tyr₁₃₄₉ и/или Tyr₁₃₅₆ HGF/SF-рецептора, подвергают мутагенезу путем замены на фенилаланин.

Фиг. 9. SF/HGF индуцирует фосфорилирование Shc и связывание с SF/HGF-рецептором и Crb2.

Клетки A549 (контрольные или экспрессирующие Y₃₁₇--->F-мутантную Shc-кДНК (A549/Y317 F) культивируют в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем подвергают лизису. Знак (+) означает, что клетки стимулированы с 5¹-конца 200 ед/мл очищенного SF/HGF. Иммунокомплексы, осажденные с помощью первого антитела (IPP), разделяют путем электрофореза в 9% ДСН-ПААГ, а затем анализируют путем иммуноблотирования с использованием второго антитела (WB), как показано на чертеже. Стрелками показаны эндогенные Shc-изоформы (p46, p52, p56), -цепь SF/HGF-рецептора (p145), трансфецированные меченые мутантные Shc-изоформы (p53 и p58), и Crb2-белок (p23).

Фиг. 10. Связывание и тирозин-фосфорилирование Shc зависит от киназной активности SF/HGF-рецептора.

Лизаты клеток COS-1, кратковременно экспрессирующие кДНК SF/HGF-рецептора дикого типа (WT) или киназа-дефектного мутантного рецептора (LYS), подвергают иммунопрецитации с использованием анти-Met моноклонального антитела (A и B) или поликлональной анти- Shc-сыворотки (C и D), затем подвергают Вестерн-блотированию, и зондируют с использованием либо анти-Met, либо P-Tyr-антитела, как показано на чертеже. Стрелками показан белок-предшественник (p170), который в клетках COS-1 представляет собой диминирующую, полностью функциональную форму SF/HGF-рецептора (Ponzetto и др. Mol. Cell. Biol. 13: 4600-4608(1993) и Shc-изоформы (p46, p 52 и p56).

Фиг. 11. Связывание Shc и Crb2-SH2-доменов с белками, солюбилизированными из SF/HGF-обработанных клеток.

Лизаты получают из слитых монослоек нестимулированных (-) или SF/HGF-стимулированных (+) клеток A549. Эксперименты на связывание осуществляют путем инкубирования полного клеточного белка с рекомбинантными GST-SH2. Shc(A) или GST-SH2. Crb2 (B), иммобилизованными на глутатионсефарозе. Связанные белки элюируют и анализируют путем вестерн-блотирования с использованием вышеуказанных антител.

Фиг. 12. Картирование сайтов Shc-связывания на SF/HGF-рецепторе.

Клетки COS-1, экспрессирующие SF/HGF-рецепторы (либо дикого типа (WT), либо мутированные Y ---> F в остатках, указанных сверху) подвергают совместной иммунопреципитации с антителами против Shc, блотируют и обнаруживают с помощью антител против Met. Стрелками показан предшественник рецептора (p170).

Фиг. 13. Shc-H2-домен, связывается с сайтом связывания SF/HGF рецептора (Y¹³⁵⁶), но не со своим собственным сайтом Y³¹⁷).

На поверхности двух биосенсоров, на которых были иммобилизованы два фосфопептида, наносят равные концентрации Shc-H2. Y1356P получают из концевой последовательности рецептора (VNATY¹³⁵⁶VNVK), а Y317P получают из последовательности DDPSY³¹⁷VNVQ. При этом следует отметить, что оба пептида содержат одинаковую сердцевину (YVNV), но различные последовательности, расположенные "вверх по течению". Быстрое начальное усиление ответа обусловлено "эффектом набухания" инъецированного раствора.

Фиг. 14. Сверхэкспрессия Shc способствует усилению мотогенного ответа на SF/HGF.

Камеры Бойдена с полупроницаемыми перегородками укомплектовывают поликарбонатными фильтрами (с порами размером 8 мкм), покрытыми желатином. Клетки подвергают мечению 5-[¹²⁵I] йодо-2'-дезоксиуридином (см. "Методы") и засевают в верхнюю камеру. Нижнюю камеру заполняют бессывороточной средой, в которую добавляют указанные концентрации очищенного SF/HGF. Через 6 часов после инкубирования, при 37^oC, клетки, прикрепленные к верхней стороне фильтров, механически удаляют, а клетки, переместившиеся к нижней стороне фильтра, фиксируют и подсчитывают с использованием гамма-счетчика (ось Y: связанные клетки, число импульсов в минуту, имп./мин) В нижней части чертежа показаны клетки (микрофотография с низким увеличением (4 х ), переместившиеся к нижней стороне фильтров в присутствии 40 ед/мл SF/HGF. Клетки инфицируют либо ретровирусом, несущим SHC-кДНК (SHC-pIXSN), либо "пустым" вирусом (МОСК).

Фиг. 15. SH2-домен Crb2 связывается с сайтом связывания Y³¹⁷Shc.

Панель A: показаны сенсограммы, полученные путем нанесения ряда концентраций Gst-SH2. Crb2. на иммобилизованный фосфопептид, происходящий от Shc-последовательности DDPSY³¹⁷-VNVQ. Панель B: проиллюстрировано действие конкурирующего пептида на скорость диссоциации. После нанесения Crb2. наносят буфер или 20 М небиотинилированного фосфопептида. Панель C: проиллюстрирован анализ данных, представленных на панели A. В левой части панели C представлен график зависимости скорости связывания от относительного ответа (для шести различных сенсограмм). В правой части панели C показан график зависимости углов наклона каждой линии от концентрации, при этом новый угол наклона представляет собой величину константы скорости ассоциации.

Фиг. 16. Модель взаимодействия между SF/HGF-рецептором и SH2-содержащими адапторными молекулами Shc и Crb2.

Crb2 с высокой степенью аффинности связывается с сайтом присоединения Y¹³⁵⁶ , расположенным в концевой части рецептора. Адапторная молекула Shc может взаимодействовать либо с фосфотирозином Y¹³⁴⁹, либо с Y¹³⁵⁶. После связывания, Shc перефосфорилируют с помощью рецептора на Y¹³⁷, восстанавливая сайт присоединения с высокой степенью аффиности для Crb2. Таким образом, указанный рецептор может активировать мотогенный ответ посредством Shc-метаболизма, не препятствуя, при этом Ras-опосредованному митогенному ответу, обусловленному Crb2-SoS.

Пример 1 Получение H-Tur^*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-OH (формула I) 0,89 г (0,5 мМ) Fmoc-Tyr (tBu)-4-(оксиметил)фенокси-метил-сополи(стирол-1% дивинилбензол)-смолы (0,56 мМ/г) подвергают следующей обработке (стадии 1-5): (1) диметилформамидом, (2) пиперидином (20%) в ДМФ (3) диметилформамидом, (4) предварительно полученным 1-гидроксибензотриазольным сложным эфиром (2,0 мМ) Fmoc-аминокислоты в ДМФ.

Объемы промывок и реагентов составляют от 10 до 20 мл. Каждую стадию повторяют несколько раз, либо для полного завершения реакции смолы (стадии 2-4), либо для полной замены предыдущего реагента смолой (стадии 1, 3, 5). После каждого цикла берут образцы смолы и контролируют на полное завершение реакции с помощью нингидринового теста. 1-Гидроксибензотриазольные сложные эфиры Fmoc-аминокислот получают непосредственно перед использованием посредством реакции Froc-аминокислоты (2,0 мМ) 1-гидроксибензотриазола (2,0 мМ) и DPCDI (2,0 мМ) в ДМФ.

Цикл реакций (1) - (5) по