Изолированная последовательность днк (варианты), рекомбинантная двунитевая молекула днк и способ получения генетически трансформированных растений

Изолированная последовательность днк (варианты), рекомбинантная двунитевая молекула днк и способ получения генетически трансформированных растений

Реферат

 

Последовательности ДНК предназначены для экспрессии ферментов ЕРSРS нового класса и могут быть использованы для получения растений, устойчивых к гербициду глифосату. Ферменты EPSPS этого класса (II) характеризуются большей кинетической эффективностью, чем известного класса (I), в присутствии глифосата. 4 с. и 13 з.п. ф-лы, 17 ил, 13 табл.

Изобретение относится в общем к молекулярной биологии растений и, более конкретно, к новому классу глифосат толерантных 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаз.

Последние достижения генетической инженерии обеспечили необходимые средства для трансформации растений для введения чужеродных генов. Теперь возможно получать растения, которые обладают уникальными характеристиками агрономической важности. Несомненно одним таким выгодным путем является более эффективный, совместный с окружающей средой контроль сорняков через толерантность к гербицидам. Гирбицидтолерантные растения могут уменьшить необходимость в обработке земли для контроля сорняков, в результате чего эффективно снижается эрозия почвы.

Гербицидом, который является объектом многих исследований в этом отношении, является N-фосфонометилглицин, обычно называемый глифосат. Глифосат ингибирует путь шикимовой кислоты, который приводит к биосинтезу ароматических соединений, включая аминокислоты, гормоны растений и витамины. Особенно глифосат ограничивает конверсию фосфоенолпировиноградной кислоты (РЕР) и 3-фосфошикимовой кислоты в 5-енолпирувил-3-фосфошикимовую кислоту при ингибировании фермента 5-енол-пирувилшикимат-3-фосфат синтазы (здесь далее упоминается как EPSP синтаза или EPSPS).

Уже было показано, что глифосат толерантные растения могут быть получены путем внесения в геном растения способности продуцировать более высокий уровень EPSP синтазы в хлоропласте клетки (Shah et al. ., 1986), этот фермент является предпочтительно толерантным к глифосату (Kishore et al., 1988). Были выделены варианты дикого типа EPSPS фермента, которые являются глифосат толерантными в результате изменений в кодирующей аминокислотной последовательности EPSPS (Kishore and Shah 1988; Schulz et al., 1984; Sost et al. 1984; Kishore et al., 1986). Эти варианты обычно имеют более высокий Ki для глифосата, чем фермент EPSPS дикого типа, который придает фенотипу толерантность к глифосату, но эти варианты также характеризуются высоким K_m для PEP, который делает фермент кинетически менее эффективным (Kishore and Shah 1988; Sost et al., 1984; Schulz et al., 1984; Kishore et al., 1986; Sost and Amrhein, 1990). Например, кажущийся K_m для PEP и кажущийся K_i для глифосата для нативного EPSPS из E.coli равны 10 мкМ и 0,5 мкМ, тогда как для толерантного к глифосату изолята, имеющего единственное аминокислотное замещение аланина на глицин в положении 96, эти величины равны 220 мкМ и 4,0 мМ соответственно. С помощью мутагенеза был сконструирован ряд глифосаттолерантных вариантов EPSPS генов растений. Снова глифосат толерантный EPSPS снижается благодаря увеличению K_m для PEP и незначительного снижения V_max нативного фермента растения (Kishore and Shah, 1988), в результате чего снижается каталитическая эффективность (V_max/K_m) фермента. Поскольку кинетические константы вариантов ферментов ухудшились в отношении PEP, было предположено, что высокие уровни сверхпродукции варианта фермента, 40-80-кратные, будут требоваться для поддержания нормальной каталитической активности в растениях в присутствии глифосата (Kishire et al., 1988).

Хотя было показано, что такие варианты EPSP-синтаз являются полезными для получения трансгенных растений, толерантных к глифосату, было бы крайне интересно получить EPSP-синтазу, которая является высоко толерантной к глифосату, в то время как еще кинетически эффективной, чтобы снизилось то количество толерантных к глифосату EPSPS, которое должно быть продуцировано для сохранения нормальной каталитической активности, или чтобы была получена улучшенная толерантность с тем же самым уровнем экспрессии.

Предшествующие исследования показали, что EPSPS-ферменты из различных источников сильно меняются в отношении степени их чувствительности к ингибированию глифосата. Изучение активности растительного и бактериального EPSPS-фермента как функции концентрации глифосата показало, что имеется очень широкий интервал степени чувствительности к глифосату. Степень чувствительности не показывает корреляции с какими-либо генами или испытанными видами (Schulz et al., 1985). Уже сообщалось о нечувствительности к ингибированию глифосата активности EPSPS из Pseudomonas sp.PG2982, но не проводились детали исследования (Fitzgibbon, 1988). В общем, хотя известна такая природная толерантность, не сообщалось предположений о кинематическом превосходстве EPSPS- ферментов природного бактериального происхождения, толерантных к глифосату, по сравнению с мутированными EPSPS-ферментами, не были охарактеризованы какие-либо гены. Подобным образом, не имеется сообщений об экспрессии природно толерантных к глифосату EPSPS-ферментов в растениях для придания толерантности к глифосату.

Имеется молекула ДНК, представляющая собой ДНК, кодирующую кинетически эффективную толерантную к глифосату EPSP-синтазу. EPSP-синтазы настоящего изобретения снижают количество сверхпродукции EPSPS-фермента в трансгенном растении, необходимое для фермента, чтобы поддерживать каталитическую активность при придании к тому же толерантности к глифосату. Эта и другие EPSP-синтазы, описанные здесь, представляют собой новый класс EPSPS-ферментов, упоминаемых здесь далее как класс II EPSPS-ферментов. Класс II EPSPS-ферментов обладает малой гомологией к известным бактериальным или растительным EPSPS-ферментам и показывает толерантность к глифосату при сохранении подходящих интервалов K_m(PEP). Подходящие интервалы K_m (PEP) для EPSPS-ферментов настоящего изобретения находятся между 1-150 M при более предпочтительном интервале между 1-35 M и наиболее предпочтительном интервале между 2-25 M. Эти кинематические константы определены в опытных условиях, определенных здесь далее. V_max фермента должна быть предпочтительно по крайней мере 15% неингибированного фермента растения, а более предпочтительно более 25%. EPSPS настоящего изобретения предпочтительно имеет K_i для глифосатного интервала между 25-10000 M. Отношение K_i/K_m может быть между 3-500, а более предпочтительно между 6-250. V_max предпочтительно может быть в интервале 2-100 единиц/кг/ моль/мин.мг при 25^oC/ и K_m для шикимат-3-фосфата может быть предпочтительно в интервале от 0,1 до 50 М.

Гены, кодирующие ферменты класса II EPSPS, были выделены из трех (3) различных бактерий: Agrobacterium tumefaciens sp. штамм CP4, Achromobacter sp. штамм LBAA и Pseudomonas sp. штамм PG2982. Гены LBAA и PG2982 класса II EPSPS были определены для идентификации, а белки, кодируемые этими двумя генами, очень похожи на CP4 белок и имеют примерно 84% аминокислот, идентичных им. Класс II EPSPS-ферментов может быть легко разграничен от класса I EPSPS по их неспособности к взаимодействию с поликлональными антителами, приготовленными из ферментов класса I EPSPS в условиях, когда другие ферменты класса I EPSPS будут легко реагировать с антителами класса I.

Другие ферменты класса II EPSPS могут быть легко выделены и идентифицированы при использовании зонда нуклеиновой кислоты из одного из генов класса II EPSPS, описанного здесь с использованием стандартной методики гибридизации. Такой зонд из CP4 штамма был приготовлен и использован для выделения генов класса II EPSPS из штаммов LBAA и PG2982. Эти гены также могут быть приспособлены для повышения экспрессии в растениях по известной методологии. Такой зонд также был использован для идентификации гомологичных генов в бактериях, изолированных de novo из почвы.

Класса II EPSPS-ферменты предпочтительно сливают с хлоропластным транзитным пептидом (СТР), имея в виду получить белок в хлоропластах растений, в которые он может быть введен. Химерные гены, кодирующие этот СТР-класс II EPSPS слитый белок, могут быть приготовлены с подходящим промотором и 3'-сайтом полиаденилирования для введения в желаемое растение по стандартным методикам.

Следовательно, в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает новый класс EPSP-синтаз, который показывает низкий K_m для фосфоенолпирувата (PEP), высокое отношение V_max/K_m и высокое K_i для глифосата, таких, что при введении в растение, растение становится толерантным к глифосату, так что сохраняются по существу в нормальном состоянии каталитическая активность фермента и метаболизм растения. При настоящем обсуждении высокая эффективность EPSPS относится к его эффективности в присутствии глифосата.

В другом аспекте настоящего изобретения обсуждается двунитевая молекула ДНК, представляющая собой ДНК, кодирующую фермент EPSPS класса II. Последовательность ДНК ферментов EPSPS класса II раскрыта из трех источников: штамм Agrobacterium sp. , обозначенный CP4, штамм LBAA Achromobacter sp. и штамм PG2982 Pseudomonas sp.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения представлен нуклеиново-кислотный зонд из гена EPSPS класса II, пригодный для применения в скрининге генов EPSPS класса II в других источниках посредством анализа на способность последовательности ДНК из другого источника гибридизоваться с зондом.

В еще одном аспекте настоящего изобретения описаны трансгенные растения и трансформированные клетки растений, которые обеспечивают толерантность к глифосату за счет введения гена EPSPS класса II в геном растения. Генетически трансформированные растения, толерантные к гербициду глифосату, могут быть получены способом, включающим стадии: а) введение в геном клетки растения рекомбинантной двунитевой молекулы ДНК, включающей: i) промотор, функционирующий в растительной клетке, обеспечивающий продукцию последовательности РНК; ii) структурную последовательность ДНК, обеспечивающую продукцию последовательности РНК, которая кодирует слитый полипептид, включающий аминоконцевой транзитный пептид хлоропласта и EPSPS-фермент класса II; iii) 3'-нетранслируемую последовательность ДНК, функционирующую в растительной клетке, обеспечивающую добавление тяжа поли-A к 3'-концу последовательности РНК; причем промотор является гетерологичным по отношению к структурной последовательности ДНК и адаптирован таким образом, чтобы обеспечить достаточную экпрессию слитого пептида для повышения толерантности к глифосату клеток растений, трансформированных указанным геном; b) получение трансформированной растительной клетки; c) регенерацию из трансформированной растительности клетки генетически трансформированного растения, которое обладает повышенной толерантностью к глифосату.

Структурная последовательность ДНК, кодирующая фермент EPSPS класса II, может быть выбрана из группы последовательностей, включающих SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6.

Промотор может быть получен из ДНК вируса растения и может быть промотором CaMV 35D или FMV 35S.

В еще одном аспекте настоящего изобретения рекомбинантная двунитевая молекула ДНК включает: a) промотор, функционирующий в растительных клетках и обеспечивающий продукцию последовательности РНК; b) структурную последовательность ДНК, обеспечивающую продукцию последовательности РНК, кодирующей фермент EPSPS класса II; и c) 3'-нетранслируемую область, функционирующую в растительных клетках, обеспечивающую добавление тяжа поли-A к 3'-концу последовательности РНК, причем промотор является гетерологичным по отношению к структурной последовательности ДНК и адаптирован таким образом, чтобы обеспечить достаточную экспрессию слитого пептида для повышения толерантности к глифосату растительных клеток, трансформированных указанной молекулой ДНК.

В еще одном аспекте настоящего изобретения представлен способ селективного контроля за сорняками путем посадки семян растений или растений, трансформированных геном EPSPS класса II, для придания толерантности к глифосату растениям, что позволяет наносить глифосатсодержащие гербициды на растения для уничтожения чувствительных к глифосату сорняков, но не культурных растений.

Способ селективного контроля за сорняками в полевых условиях, предусматривающий посадку семян или растений, может включать следующие стадии: a) посадку указанных семян растений или растений, толерантных к глифосату, вследствие введения в указанные семена или растения рекомбинантной двунитевой молекулы ДНК, включающей: i) промотор, функционирующий в растительных клетках и обеспечивающий продукцию последовательности РНК; ii) структурную последовательность ДНК, обеспечивающую продукцию последовательности РНК, кодирующей полипептид, который включает аминоконцевой транзитный пептид хлоропласта и EPSPS фермент класса II; iii) 3'-нетранслируемую последовательность ДНК, функционирующую в растительных клетках, обеспечивающую добавление тяжа поли-A к 3'-концу последовательности РНК; причем промотор является гетерологичным по отношению к структурной последовательности ДНК и адаптирован таким образом, чтобы обеспечить достаточную экспрессию слитого полипептида для повышения толерантности к глифосату растительных клеток, трансформированных указанным геном; и b) нанесение на указанные растения и сорняки достаточного количества глифосата для обеспечения контроля за сорняками, но без существенного влияния на культурное растение.

Структурная последовательность ДНК, кодирующая SPSPS фермент класса II, может быть выбрана из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:2, SEQ IN NO:4 или SNQ ID NO:6.

Молекула ДНК может дополнительно включать промотор, выбранный из группы, состоящей из промоторов CAMV 35S и FMV 35S. Культурное растение может быть выбрано из группы, состоящей из кукурузы, пшеницы, риса, сои, хлопка, сахарной свеклы, масличного рапса, канолы, льна, подсолнечника, картофеля, табака, томатов, люцерны, тополя, сосны, яблони и винограда.

Другие и дополнительные объекты, преимущества и аспекты изобретения будут очевидны из приложенных чертежей и описания изобретения.

На фиг. 1 показана последовательность ДНК (SEQ ID N 1) для полной длины промотора мозаичного вируса норичника (FMV 35S).

На фиг. 2 показан космидный вектор клонирования pMON 17020.

На фиг. 3 показана последовательность структурной ДНК (SEQ ID N 2) для гена класса 11 EPSPS из бактериального изолята Agrobacterium sp. штамм CP4 и происходящая из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID N 3).

На фиг. 4 показана последовательность структурной ДНК (SEQ ID N 4) для гена класса II EPSPS из бактериального изолята Achromobacter sp. штамм LBAA и происходящая из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID N 5).

На фиг. 5 показана последовательность структурной ДНК (SEQ ID N 6) для гена класса II EPSPS из бактериального изолята Pseudomonas sp. штамм PG2982 и происходящая из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID N 7).

На фиг. 6 показано сравнение Бетфита аминокислотной последовательности E.coli EPSPS (SEQ ID N 8) с последовательностью CP4 EPSPS (SEQ ID N 3).

На фиг. 7 показано сравнение Бестфита аминокислотной последовательности CP4 EPSPS (SEQ ID N 3) с последовательностью LBAA EPSPS (SEQ ID N 5).

На фиг. 8 показана структурная последовательность ДНК (SEQ ID N 9) для синтетического гена CP4 класса II EPSPS.

На фиг. 9 показана последовательность ДНК (SEQ ID N 10) хлоропластного транзитного пептида (CTP) и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID N 11), происходящая из Arabidopsis thaliana EPSPS CTP и содержащая SphI сайт рестрикции в сайте переработки хлоропласта, здесь далее упоминаемая как CTP2.

На фиг. 10 показана последовательность ДНК (SEQ ID N 12) хлоропластного транзитного пептида и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID N 13), происходящая из Arabidopsis thaliana EPSPS-гена и содержащая Sco RI сайт рестрикции в зрелой области EPSPS, здесь далее упоминаемая как CTP3.

На фиг. 11 показана последовательность ДНК (SEQ ID N 14) хлоропластного транзитного пептида и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID N 15), происходящая из Petunia hybrida EPSPS CTP и содержащая SphI-сайт рестрикции в сайте переработки хлоропласта и в которой аминокислоты в сайте переработки заменены на -Cys-Met, здесь далее упоминаемая как CTP4.

На фиг. 12 показана последовательность ДНК (SEQ ID N 16) хлоропластного транзитного пептида и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID N 17), происходящая из Petunia hybrida EPSPS-гена с сайтом ScoRI природного происхождения в зрелой области EPSPS-гена, здесь далее упоминаемая как CTP5.

На фиг. 13 показана плазмидная карта CP4 трансформации растения/вектор экспрессии pMON 17110.

На фиг. 14 показана плазмидная карта CP4 EPSPS синтетического гена трансформации растения/вектор экспрессии pMON 17131.

На фиг. 15 показана плазмидная карта CP4 EPSPS свободная ДНК трансформации растения/вектор экспрессии pMON 13640.

На фиг. 16 показана плазмидная карта CP4 трансформации растения/вектор прямой селекции pMON 17227.

На фиг. 17 показана плазмидная карта CP4 трансформации растения/вектор экспрессии pMON 19653.

Экспрессия растительного гена, который существует в форме двуниточной ДНК, включает синтез матричной РНК (мРНК) из одной нити ДНК с помощью фермента РНК полимеразы, и последующий прессинг мРНК продукта транскрипции внутрь ядра. Этот процессинг включает 3'-нетранслируемую область, которая дополняет полиаденилированные нуклеотиды к 3'-концу РНК.

Транскрипция ДНК в мРНК регулируется областью ДНК, обычно упоминаемой как "промотор". Область промотора содержит последовательность оснований, которая сигнализирует РНК полимеразе ассоциировать с ДНК и инициировать транскрипцию в мРНК, используя одну нить ДНК в качестве матрицы, чтобы получить комплементарно соответствующую нить РНК.

В литературе был описан ряд промоторов, которые активны в клетках растений. Они включают промоторы нопалин синтазу (NOS) и октопин синтазу (OCS) (которые переносятся индуцирующими опухоль плазмидами Agrobacterium tumetaciens), промоторы вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 19S и 35S, индуцируемый светом промотор из малой субъединицы рибулоза бис-фосфат карбоксилазы (ss RUBISCO, очень часто встречающийся полипептид растений) и промотор транскрипции полной длины из вируса мозаики норичника (FMV35S). Все эти промоторы были использованы для создания различных типов конструкций ДНК, которые были экспрессированы в растениях, смотри, например, PCT публикацию WO 84/02913 (Роджерс с сотр., Монсанто).

Промоторы, которые являются известными или вызывающими транскрипцию ДНК в клетках растений, могут быть использованы в настоящем изобретении. Такие промоторы могут быть получены из множества источников, таких как растения и ДНК вирусов растений, и включают, но не ограничиваются промоторами CaMV35S и FMV35S и промоторы, выделенные из генов растений, таких, как ssRUBISCO-гены. Как описано ниже, предпочтительно, чтобы конкретный выбранный промотор мог быть способен вызывать достаточную экспрессию, чтобы получить в результате эффективное количество класса II EPSPS, чтобы придать растению значительную толерантность к глифосатным гербицидам. Количество класса II EPSPS, необходимое для индукции желаемой толерантности, может варьировать с видом растения. Предпочтительно, чтобы использованные промоторы имели относительно высокую экспрессию во всех меристематических тканях в дополнение к другим тканям, так как теперь известно, что глифосфат транслокирован и аккумулирован в тканях растений этого типа. Альтернативно может быть использовано сочетание химерных генов для совокупного результата при необходимом общем уровне экспрессии выбранного фермента класса II EPSPS, чтобы получить в результате толерантный к глифосату фенотип.

Продуцированная конструкцией ДНК настоящего изобретения мРНК также содержит 5'-нетранслируемую лидерную последовательность. Эта последовательность может происходить из промотора, выбранного для экспрессии гена, и может быть специально модифицирована, чтобы увеличить трансляцию мРНК. 5'-нетранслируемые области также могут быть получены из вирусных РНК, из подходящих эукариотных генов, или из синтетических генных последовательностей. Настоящее изобретение не ограничивается конструкциями, которые представлены в следующих примерах, где нетранслируемая область происходит из обеих 5'-нетранслируемой последовательности, которая сопровождает промоторную последовательность, и части 5'-нетранслируемой области гена белка оболочки вируса. Скорее нетранслируемая лидерная последовательность может происходить из неродственного промотора или кодирующей последовательности, как обсуждено выше.

Предпочтительным промотором для использования в настоящем изобретении является матричный промотор полной длины (SEQ ID N 1) из вируса мозаики норичника (FMV35S), который функционирует как сильный и равномерный промотор с особенно хорошей экспрессией в меристематической ткани для химерных генов, вставленных в растения, особенно двудольные. Полученное в результате трансгенное растение в общем экспрессирует белок, кодируемый вставленным геном, на более высоком и однородном уровне в тканях и клетках трансформированного растения, чем тот же самый ген под действием усиленного CaMV35S - промотора. Сссылаясь на фиг. 1, последовательность ДНК (SEQ ID N 1) FMV35S промотора локализована между 6368 и 6930 нуклеотидами FMV генома. 5'-нетранслируемая лидерная последовательность предпочтительно связана с промотором. Лидерная последовательность может быть из самого генома FMV35S или может быть из другого источника, чем FMV35S.

3'-Нетранслируемая область химерного гена содержит сигнал полиаденилирования, который функционирует в растениях, вызывая присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу вирусной РНК. Примерами подходящих 3'-областей являются (1) 3'-транскрибированные нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования генов, вызывающих опухоль, плазмиды (Ti) Agrobacterium, такие, как ген нопалин синтазы (NOS), и (2) растительные гены, подобные генам запасных белков сои и маленькой субъединицы гена рибулоза-1,5-бисфосфат карбоксилазы (ssRUBISCO). Примером предпочтительной 3'-области является таковая из ssRUBISCO гена гороха (E9), более детально описанная ниже.

Конструкция ДНК настоящего изобретения также содержит структурную кодирующую последовательность в виде двуниточной ДНК, которая кодирует толерантный к глифосату высоко эффективный фермент класса II EPSPS.

Идентификация толерантных к глифосату, высоко эффективных EPSPS ферментов.

При попытке идентифицировать и выделить толерантные к глифосату, высоко эффективные ферменты EPSPS провели кинетический анализ EPSPS ферментов из ряда бактерий, обладающих толерантностью к глифосату или выделенных из подходящих источников. Было обнаружено, что в некоторых случаях ферменты EPSPS не показывают толерантность для ингибирования глифосата, и был сделан вывод, что толерантность фенотипа бактерии возникает благодаря непроницаемости глифосата или других факторов. Однако в ряде случаев были идентифицированы микроорганизмы, у которых фермент EPSPS показал более высокую степень толерантности к ингибированию глифосата и которые показывают низкий K_m для PEP при сравнении с ранее приведенным для других микробных и растительных источников. EPSPS ферменты из этих микроорганизмов затем были подвергнуты дополнительному изучению и анализу.

В таблице 1 приведены данные, полученные для EPSPS ферментов, идентифицированных и выделенных в результате описанного выше анализа. В таблице 1 включены данные для трех идентифицированных ферментов класса II EPSPS, для которых наблюдалось, что они имеют высокую толерантность к ингибированию глифосфата и низкую K_m для PEP, а также данные для нативного EPSPS петунии и толерантного к глифосату варианта EPSPS петунии, упоминаемого как GA101. Вариант GA101 был так назван потому, что в нем имеется замещение аланинового остатка на остаток глицина в положении 101 (в отношении петунии) в инвариантной области. При внесении изменения EPSPS петунии (GA101) в ряд других ферментов EPSPS наблюдались подобные изменения в кинетике, повышение K_i для глифосата и K_m для PEP.

Первоначально идентифицируют Agrobacterium sp. штамм CP4 по его способности расти на глифосате как источнике углерода (10 мМ) в присутствии 1 мМ фосфата. Штамм CP4 был идентифицирован из коллекции, полученной из колонки со стационарным слоем иммобилизованных клеток, в которой применены шарики диатомитовой земли Маннвилл K-635. Колонку гоняли три месяца на сбросовой воде с установки по производству глифосата. Колонка содержала 50 мг/мл глифосата и NH₃ и NH₄Cl. Общий органический углерод составляет 300 мг/мл и БПК (биологическое потребление кислорода - мера доступности "мягкого" углерода) составляет менее 30 мг/мл. Обработанная таким образом колонка была описана (Heitkamp et al., 1990). Минимальна солевая среда Дворкина-Фостера, содержащая глифосат в количестве 10 мМ и 1 мМ фосфата, была использована для отбора микробов из промывки этой колонки, которые способны расти на глифосате в качестве единственного источника углерода. Минимальную среду Дворкина-Фостера готовят объединением в 1 л (с автоклавной водой) по 1 мл каждого из A, B и C и 10 мл D (см. ниже) и 5 мг тиамина HCl.

A. Д-Ф соли (1000Х stock; на 100 мл; автоклавированная): H₃BO₃ - 1 мг MnSO₄ 7 H₂O - 1 мг ZnSO₄ 7 H₂O - 12,5 мг CuSO₄ 5 H₂O - 8 мг NaMoO₃ 3 H₂O - 1,7 мг B. FeSO₄ 7 H₂O (1000Х stock; на 100 мл; автоклавированная): 0,1 г C. MgSO₄ 7 H₂O (1000Х stock; на 100 мл; автоклавированная): 20 г D. (NH₄)₂SO₄ (1000Х stock; на 100 мл; автоклавированная): 20 г Дрожжевой экстракт (УЕ, Дифко) прибавляют до конечной концентрации 0,01 или 0,001%. Штамм CP4 также выращивают на среде, составленной из Д-Ф солей, исправленной, как описано выше, содержащей глюкозу, глюконат и нитрат (каждый по 0,1%) в качестве источников углерода и неорганический фосфат (0,2-1,0 мМ) в качестве источника фосфора.

Другие микроорганизмы, содержащие класс II EPSPS, были идентифицированы как Achromobacter sp. штамм LBAA, который был взят из коллекции бактерий, ранее описанной (Hallas et al., 1988), и Pseudomonas sp. штамм PG2982, который был описан в литературе (Moore et al., 1983; Fitzgibbon, 1983). Ранее уже сообщалось, из измерений в сырых лизатах, что EPSPS фермент из штамма PG2982 был менее чувствительным к ингибированию глифосатом, чем штамм из E. coli, но не сообщались детали этой потери чувствительности и не приводились данные о K_m для PEP для этого фермента или о последовательности ДНК для гена этого фермента (Fitzgibbon, 1988; Fitzgibbon and Braymer, 1990).

Отношение класс II EPSPS к ранее изученным ферментам Все EPSPS белки, изученные до сегодняшнего дня, показали замечательную степень гомологии. Например, бактериальные и растительные EPSPS примерно на 54% являются идентичными и при таком высоком подобии, как 80%. Внутри самих бактериальных EPSPS и растительных EPSPS степень идентичности и подобие являются очень высокими (смотри таблицу 2).

При зондировании сырых экстрактов CP4 и LBAA бактерий (50 г белка) с использованием анти-EPSPS антител кролика (Padgette et al., 1987) белков EPSPS петунии с помощью анализа Вестерна, не смогли определить положительный сигнал даже при увеличенном времени экспозиции (Белок A - ¹²⁵I проявляющая система) и в условиях, когда контроль EPSPS (20 нг EPSPS петунии, класс I EPSPS) легко осуществим. Наличие EPSPS-активности в этих экстрактах подтверждают ферментным анализом. Этот неожиданный результат, указывающий на потерю подобия между EPSPS из этих бактериальных изолятов и ранее изученными EPSPS, ассоциируемый с сочетанием низкой K_m для PEP и высокой K_i для глифосата, иллюстрирует, что эти новые EPSPS-ферменты отличаются от известных EPSPS-ферментов, теперь упоминаемых как класс I EPSPS.

Толерантные к глифосату ферменты в микробных изолятах Для ясности и краткости изложения последующее описание выделения генов, кодирующих класс II EPSPS-ферментов, относится к выделению такого гена из бактериального изолята. Специалисты в данной области должны понимать, что такая же или подобная стратегия может быть использована для выделения таких генов из других микробных изолятов, из растительных и грибных источников.

Клонирование Agrobacterium sp. штамм CP4 EPSPS гена(ов) в E.coli.

После установления существования подходящего EPSPS в Agrobacterium sp. штамм CP4, были сделаны две параллельные попытки проклонировать ген: клонирование, основанное на ожидаемом фенотипе толерантного к глифосату EPSPS; и очистка фермента, чтобы получить материал для извлечения антител и получения аминокислотных последовательностей из белка для облегчения подтверждения клонов. Клонирование и генетические методики, если нет других указаний, в общем являются такими, как описано у Маниатиса с сотр., 1982 или у Самбрука с сотр., 1987. Стратегия клонирования является следующей: введение космидного банка штамма Agrobacterium sp. штамм CP4 в E.coli и селекция EPSPS гена с помощью селекции роста на ингибирующих концентрациях глифосата.

Готовят хромосомальную ДНК из штамма Agrobacterium sp. штамм CP4 следующим образом: Повторно суспендируют клеточный шарик из 200 мл L-бульона (Miller, 1972) последней лог-фазы культуры Agrobacterium sp. штамм CP4 в 10 мл раствора 1; 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЕДТА, 25 мМ Трис-Cl pH 8,0 (Birnboim and Doly, 1979). Прибавляют SDS до конечной концентрации 1% и суспензию подвергают трем циклам замораживание-оттаивание, каждый состоит в погружении в сухой лед на 15 минут и в воду при 70^oC на 10 минут. Затем лизат четыре раза экстрагиурют равными объемами фенола : хлороформа (1:1, фенол, насыщенный TE, TE = 10 мМ Трис, pH 8,0; 1 мМ ЕДТА) и разделяют фазы центрифугированием (15000 g; 10 минут). Осажденный эталоном материал собирают в шарик, отделяя от супернатанта краткосрочным центрифугированием (8000 g, 5 минут) с последующим добавлением двух объемов этанола. Шарик повторно суспендируют в 5 мл TE и диализуют в течение 16 часов при 4^oC против 2 л TE. Этот препарат представляет собой 5 мл раствора ДНК 552 мкг/мл.

Следующим образом готовят частично рестриктированную ДНК. Обрабатывают три аликвотных образца 100 мкг CP4 ДНК в течение 1 часа при 37^oC рестрикционной эндонуклеаной Hind III при дозах 4, 2 и 1 единица фермента/мкг ДНК соответственно. Собирают образцы ДНК, устанавливая 0,25 мМ ЕДТА, и экстрагируют равным объемом фенола:хлороформа. После добавления ацетата натрия и этанола осаждают ДНК двумя объемами этанола и центрифугируют для получения шарика (12000 g, 10 минут). Сухой шарик ДНК повторно суспендируют в 500 мкл TE и наслаивают на градиент 10-40% сахарозы (с 5% инкрементами 5,5 мл каждого) в 0,5 М NaCl, 50 мМ Трис pH 8,0, 5,0 мМ ЕДТА. После центрифугирования в течение 20 часов при 26000 об/мин в SW 28 роторе трубки прокалывают и собирают фракции примерно 1,5 мл. Образцы (20 мкл) каждой второй фракции наносят на 0,7% агарозный гель и определяют размер ДНК путем сравнения с линеаризованной лямбда ДНК и Hind III-переваренной лямбда ДНК в качестве стандартов. Собирают фракции, содержащие фрагменты ДНК 25-35 ко, обессоливают на колонках AMICON10 (7000 об/мин, 20^oC, 45 минут) и концентрируют осаждением. Эта процедура дает 15 мкг CP4 ДНК требуемого размера. Составляют банк космид, используя вектор pMON17020. Этот вектор, карта которого представлена на фиг. 2, основан на pBR327-репликоне и содержит спектиномицин/стрептомицин (Sp^r, spc) ген устойчивости из Тп7 (Fling et al., 1985), ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm^r, cat) из Тп9 (Alton et al., 1985), промоторную область гена 10 из фага Т7 (Dunn et al., 1983) и cos-фрагмент 1,6 ко Bgl II фага лямбда из pHC79 (Hohn and Collins, 1980). Ряд сайтов клонирования локализованы ниже cat-гена. Поскольку преобладающий блок экспрессии генов из других микробных источников должен появиться в E.coli на уровне транскрипции, применение T7 промотора и подача T7 полимеразы в in trans от pGP1-2 плазмиды (Tabor and Richardson, 1985) делают возможной экспрессию больших сегментов ДНК от чужеродной ДНК, даже тех, что содержат терминальные последовательности транскрипции РНК полимеразы. Экспрессия spc гена ослабляется транскрипцией от Т7 промотора, так что только Cm^r может быть селектирован в нитях, содержащих pGP1-2. Использование устойчивости к антибиотикам, такой как Cm^r устойчивость, которая не использует мембранный компонент, является предпочтительным благодаря наблюдению, что высокий уровень устойчивости генов, которые включают мембранный компонент, а именно устойчивость к -лактамазе и Amp-устойчивость, приводит к увеличению толерантного к глифосату фенотипа. По-видимому это происходит благодаря исключению глифосата из клетки с помощью мембраны, локализующей устойчивость белка. Также предпочтительно, чтобы отбираемый маркер был ориентирован в том же самом направлении, что и T7 промотор. Затем вектор отрезают Hind III и обрабатывают щелочной фосфатазой теленка (CAP) в препарате для клонирования. Последовательности вектора и мишени лигируют путем сочетания следующего: Вектор ДНК (Hind III/CAP) - 3 мкг Фракционированные по размерам фрагменты СР4 Hind III - 1,5 мкг 1OX буфер лигирования - 2,2 мкл T4 ДНК лигаза (Нью Инглэнд Биолабс) (400 E/мкл) - 1,0 мкл и добавления воды до - 22,0 мкл Эту смесь инкубируют в течение 18 часов при 16^oC. 10X буфер лигации представляет собой 250 мМ Трис-HCl, pH 8,0; 100 мМ MgCl₂; 100 мМ дитиотрейтола; 2 мМ спермидина. Упаковывают 5 мкл лигированной ДНК в частицы лямбда фага (Стратаген, Джигапакк Голд), используя процедуру производителя.

Образец 200 мкл E.coli HB101 (Boyer and Rolland-Dussoix, 1973), содержащий плазмиду экспрессии pGP1-2 T7 полимеразы (Tabor and Richardson, 1985) и выращенную в течение ночи в L-бульоне (с 0,2% мальтозы и 50 мкг/мл канамицина), инфицируют 50 мкл упакованной ДНК. Трансформанты отбирают при 30^oC на M9 (Miller, 1972) агаре, содержащем 50 мкг/мл канамицина. 25 мкг/мл хлорамфеникола, 50 мкг/мл L-пролина, 50 мкг/мл L-лейцина и 5 мкг/мл B1 и 3,0 мМ глифосата. Также высевают на ту же среду, лишенную глифосата, аликвотные образцы, чтобы оттитровать упакованные космиды. Изолируют космидные трансформанты на этой последней среде в количестве 510⁵ на мкг CP4 Hind III ДНК после 3 дней при 30^oC. Колонии выращивают на глифосатном агаре от 3 до 15 дней при конечном количестве от 1 на 200 космид. ДНК получают из 14 толерантных к глифосату клонов и после подтверждения этого фенотипа трансформируют в E.coli GB100 (pGP1-2), E.coli GB100 является aro A производным MM294 (Talmadge and Gilbert, 1980) и испытывают на комплементарность для роста в отсутствие добавленных ароматических аминокислот и аминобензойных кислот. Могут быть использованы другие aro A штаммы, такие как SR481 (Bachman et al. , 1980; Padgette et al., 1987), и они будут пригодными для этого эксперимента. Использование GB 100 приведено только в качестве примера и не должно рассматриваться в ограничивающем смысле. Такой aro A штамм обычно требует, чтобы среда роста была дополнена L-фенилаланином, L-тирозином и L-триптофаном, каждой по 100 мкг/мл, и п-оксибензойной кислотой, 2,3-диоксибензойной кислотой и п-аминобензойной кислотой, по 5 мкг/мл каждой, для роста на минимальной среде. Из четырнадцати испытанных космид только одна показала комплементарность aro-A-фенотипу. Трансформанты этой космиды, pMON17076, показали слабый, но равномерный рост на недополненной минимальной среде после 10 дней.

Белки, кодируемые космидами, были определены in vivo с использованием T7 системы экспрессии (Tabor and Richardson, 1985), а тестовые и контрольные космиды были выращены при 30^oC на 2 мл L-бульона с 25 и 50 мкг/мл соответственно хлорамфеникола и канамицина для считывания Клетта 50. Извлекают аликвот и собирают клетки центрифугированием, промывают M9 солями (Miller, 1972) и повторно суспендируют в 1 мл среды M9, содержащей 0,2% глюкозы, 20 мкг/мл тиамина и содержащей по 0,01% 18 аминокислот (минут цистеин и метионин). После инкубации при 30^oC в течение 90 минут культуры переносят на водяную баню при 42^oC и оставляют на 15 минут. Прибавляют рифампицин (Сигма) до 200 мкг/мл и оставляют культуры при 42^oC на дополнительные 10 минут, а затем переносят на 20 минут при 30^oC. Клетки собирают центрифугированием и суспендируют в 60-120 мкл дробящего буфера 60 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 1% SDS, 1% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 0,01% бромфенольного голубого. Аликвотные образцы подвергали электрофорезу на 12,5% SDS-PAGE и смачивают потом в течение 60 минут 10 объемами уксусной кислоты-метанола-воды (10:30:60), гель смачивают ENLIGHTNING^TM (Дюпон), следуя инструкциям производителя, сушат и выдерживают при -70^oC на рентгеновской пленке. Белки около 45 кд размером, м