Рецептор глюканового активатора и кодирующая его молекула днк

Рецептор глюканового активатора и кодирующая его молекула днк

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в биотехнологии растений, в частности для получения растений, устойчивых к грибковым заболеваниям. Определены аминокислотная последовательность рецептора глюканового активатора; нуклеотидная последовательность молекулы ДНК, кодирующей рецептор глюканового активатора; молекула ДНК, кодирующая рецептор глюканового активатора, включенная в плазмиду р ER 23-1; вектор, содержащий молекулу ДНК, кодирующую рецептор глюканового активатора. Молекулы ДНК настоящего изобретения, введенные и экспрессированные в растения, приводят к повышению устойчивости растений к грибкам. 4 с. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение относится к рецептору глюканового активатора (здесь и далее именуемому иногда как "ER"), к молекулам ДНК, кодирующим ER, к векторам, содержащим эти молекулы ДНК и к растительным клеткам, трансформированным этими молекулами ДНК. Более конкретно настоящее изобретение относится к ER, полученным из фракции плазматической мембраны корней сои, молекулам ДНК, кодирующим ER, векторам, содержащим ДНК-молекулы и к растительным клеткам, трансформированным молекулами ДНК.

Предпосылки изобретения Известно, что растения синтезируют и накапливают антибиотический агент, называемый фитоалексином, как реакцию на инфицирование патогеном (M.Yoshikawa, 1978, Nature 257:546). Было обнаружено, что некоторые патогены растений содержат вещества, которые заставляют их осуществлять такие реакции "сопротивления" (или устойчивости) (N.T.Keen (1975) Science 187:74), которые называют "активаторами" ("elicitors"). Считают, что биохимический процесс, начиная от инфицирования растений патогенами, до синтеза и накопления фитоалексина состоит в следующем.

Когда мицелий патогена вторгается в растительную клетку, глюканаза в растительной клетке работает таким образом, чтобы расщепить полисахариды на поверхности стенки мицелия патогена и за счет этого высвободить активатор. Если активатор связывается с рецептором в растительной клетке, продуцируется второй мессенджер, который участвует в трансдукции сигнала. Вещество трансдукции сигнала включается в ядро растительной клетки и активирует транскрипцию генов, кодирующих энзимы, синтезирующие фитоалексин, для того, чтобы индуцировать синтез фитоалексина. В то же самое время происходит ингибирование деградации фитоалексина. В результате происходит эффективное накопление фитоалексина.

Фитоалексин, играющий важную роль в устойчивости сои, называют глицеолином, и его строение известно (M.Yoshikawa et.al.(1978) Physiol.Plant.Pathol. 12: 73). Активатор является полисахаридом глюкозы и, как сообщается, представляет собой глюкан, содержащий -1,6- и -1,3 связи (J.K.Sharp et.al. (1984) J. Biol. Chem. 259 : 11321, M.Yoshikawa (1990) Plant Cell Technology 1,2 : 695). Специфическим рецептором для глюканового активатора, полученного из патогенов сои плесневых грибков Phytophthora megasperma f.sp.glycinea, как считают, является протеин, который играет важную роль в синтезе и накоплении антибиотического агента - глицеолина. Способ выделения ER, специфического для этого активатора, был раскрыт (E.G.Cosio et.al., (1990) FEBS 264: 235, E. G. Cosio et al. (1992) Eur.J.Biochem. 204:1115, T.Frey et al. (1993) Phytochemistry 32:543). Однако аминокислотная последовательность ER не была определена, и до сих пор не известен ген, кодирующий его.

Целью настоящего изобретения является создание рецептора глюканового активатора.

Другой целью изобретения является создание молекулы ДНК, кодирующей рецептор глюканового активатора.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание векторов, содержащих молекулу ДНК, кодирующую рецептор глюканового активатора.

Еще одной целью изобретения является получение растительных клеток, трансформированных ДНК-молекулами, кодирующими рецептор глюканового активатора.

Описание изобретения В результате различных исследований, проведенных для решения вышеуказанных проблем, авторам удалось выделить из корней сои ER и клонировать ген ER из кДНК библиотеки сои, что и составляет предмет настоящего изобретения. В настоящем изобретении предложен рецептор глюканового активатора с аминокислотной последовательностью, которая представлена как последовательность ID N 1. В настоящем изобретении предложены также молекулы ДНК, кодирующие рецептор глюканового активатора с аминокислотной последовательностью, представленной как последовательность ID N 1, и их фрагменты. Далее в настоящем изобретении предложены молекулы ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора, которые включены в плазмиду pER23-1, и их фрагменты. В настоящем изобретении предложены также векторы, содержащие ДНК-молекулы, кодирующие рецептор глюканового активатора, и растительные клетки, трансформированные ДНК-молекулами, кодирующими рецептор глюканового активатора.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет картины трех стадий очистки за счет электрофореза на SDS-полиакриламидном геле.

На фиг. 2 представлены карты плазмид pER23-1 и pER23-2.

На фиг. 3 представлена схема конструирования плазмиды pK V1-ER23.

На фиг. 4 представлено кратковременное повышение концентрации внутриклеточного Ca²⁺ после добавления активатора к культивируемым клеткам сои.

Фиг. 5 представляет кратковременное повышение концентрации внутриклеточного Ca²⁺ после добавления активатора к культивируемым трансформированным клеткам табака.

На фиг.6 представлены активатор-связывающие активности полной длины или частичной длины ER, экспрессированных в E.coli.

На фиг. 7 представлено ингибирование связывания активатора со связывающим активатор протеином в мембранной фракции семядолей сои за счет антитела против активатор-связывающего домена.

На фиг. 8 представлено ингибирование накопления фитоалексина, индуцированное активатором, в семядолях сои за счет антитела против активатор-связывающего домена.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения Рецептор глюканового активатора настоящего изобретения представляет собой протеин, обладающий функцией рецептора для глюкановых активаторов, полученный из патогенов растений, в частности Phytophthora. Более конкретно, он представляет собой протеин, который связывается с глюкановым активатором, полученным при расщеплении частей стенки мицелия патогена за счет - 1,3-глюканазы в растительных клетках во время внедрения растительных патогенов, особенно микроорганизмов, принадлежащих к роду Phytophthora, и который затем заставляет микросомы и ядра продуцировать повышенное количество фитоалексина в растительных клетках. Рецептор глюканового активатора настоящего изобретения содержит аминокислотную последовательность, представленную как последовательность ID N 1. "Аминокислотная последовательность практически в соответствии с последовательностью ID N 1'' включает аминокислотные последовательности, как представлено последовательностью ID N 1, в которой могут быть делеции, замены или добавления аминокислоты (аминокислот), при условии, что они сохраняют функции рецептора глюканового активатора.

Рецептор глюканового активатора настоящего изобретения можно получить, например, частично модифицированным способом Козио (E.J.B.Cosio (1992), 204: 1115). Короче, корни, листья и стебли сои, предпочтительно сорта green homer, гомогенизируют, и мембранную часть собирают из полученной суспензии, очищают с помощью ионообменной хроматографии, и далее очищают с помощью афинной хроматографии, используя в качестве лиганда активатор. Активатор, который используют в афинной хроматографии, предпочтительно получают из Phytophthora megasperma f.sp.glycinea расы 1 (АТСС 34566), так как она демонстрирует несовместимость с green homer (т.е. устойчивость к патогену).

Полученную таким образом аминокислотную последовательность рецептора глюканового активатора можно определить следующим образом.

Очищенный ER переносят на PVDF в мембрану (Миллипор Ко) с помощью электроблоттинга и переваривают лизилендопептидазой (АР-1). Фрагментированные пептиды выделяют из PVDF мембраны и фракционируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (-Bondasphere 5 мк C8). Пиковые фракции анализируют с помощью газофазного протеинового секвенатора (Applied Biosystems Co) ER настоящего изобретения пригодны для выяснения механизма устойчивости растений к грибкам и для создания производных активатора, способных вызывать устойчивость к грибкам, и их можно использовать в качестве антигена для получения антител против ER.

Настоящее изобретение охватывает ДНК-молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора, и их фрагменты. ДНК-молекулы настоящего изобретения содержат, предпочтительно, по крайней мере один стоп кодон (например, TAG), соседний c 3' концом.

Более конкретно, настоящее изобретение охватывает ДНК-молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора, содержащего аминокислотные последовательности, практически в соответствии с представленной последовательность ID N 1, и их фрагменты. "ДНК-молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора" включает все дегенеративные изомеры. Термин "дегенеративные изомеры" относится к ДНК-молекулам, кодирующим один и тот же полипептид с различной вырожденностью кода. Если в качестве примера взять ДНК-молекулу, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID N 2, ДНК-молекула, в которой кодон для любой аминокислоты, например, ААС для Asn изменен на дегенеративный кодон AAT, будет называться дегенеративным изомером. Примеры таких дегенеративных изомеров включают ДНК-молекулы, содержащие нуклеотидную последовательность, представленную как последовательность ID N 2 (SEQ ID N 2).

В другом аспекте в настоящем изобретении предложены ДНК-молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецепторы глюканового активатора, которые включены в плазмиду pER23-1, и их фрагменты. E.coli ДН5- EKB633, трансформированная плазмидой pER23-1, была депонирована в Национальном институте Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Sience and Technology 15 июня 1994 г. под регистрационным номером FERM BP-4699.

Фрагменты ДНК-молекул, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора настоящего изобретения, могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность ID N 1 (SEQ ID N 1).

ДНК-молекулы настоящего изобретения, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора и их фрагменты, могут необязательно связываться с ATG кодоном для инициирования метионина вместе с трансляционной рамкой в участке в обратном направлении от 5' конца и также связываться с другими ДНК-молекулами, имеющими соответствующие длины в качестве нетранслируемых районов в участке в обратном направлении от 5' конца и в участке в прямом направлении от 3' конца.

ДНК-молекулы настоящего изобретения, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора и их фрагменты, можно представить в форме частей, составляющих плазмидные или фаговые ДНК-молекулы или в форме частей, составляющих плазмидные, фаговые или геномные ДНК-молекулы, которые введены в микроорганизмы (в частности, бактерии, включая E.coli и Agrobacterium), фаговые частицы или растения.

Для стабильной экспрессии ДНК-молекул, кодирующих рецептор глюканового активатора и их фрагментов в растениях, промотор, ДНК-молекулу (ATG), кодирующую кодон инициирования и терминатор, можно добавить к ДНК-молекулам настоящего изобретения и их фрагментам в соответствующих комбинациях. Примеры промоторов включают промотор генов, кодирующих малую субъединицу рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы (Fluhr et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986); 83:2358), промотор гена нопалинсинтазы (Langridge et al., Plant Cell Rep. (1985) 4:355), промотор продуцирования вируса мозаики цветной капусты 19S-RNA (Guilley et al., Cell (1982) 30:763), промотор продуцирования вируса мозаики цветной капусты 35S-RNAI Odell et al., Nature (1985) 313:810) и т.п. Примеры терминаторов включают терминатор гена нопалинсинтазы (Depicker et al. , J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1:561) и терминатор гена октопинсинтазы (Gielen et al., EMBO J. (1984) 3:835).

ДНК-молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую рецептор глюканового активатора, можно получить способом, который включает стадии химического синтеза по крайней мере части ДНК-молекулы, в соответствии с обычными способами синтеза нуклеиновых кислот, и получение целевой ДНК-молекулы из соответствующей кДНК-библиотеки с использованием синтезированных ДНК-молекул в качестве зондов обычными способами, например иммунологически или способом гибридизации.

Некоторые плазмиды, различные типы рестрикционных энзимов, Т4ДНК-лигаза и другие энзимы для использования в этом способе, коммерчески доступны. Клонирование ДНК, конструирование плазмид, трансфекцию хозяев, культивирование трансфектантов, выделение ДНК-молекул из культуры и другие стадии можно осуществить в соответствии со способами, описанными в книге Самбрука (Molecular Cloning, J.Sambrook et al., CSH Laboratory (1989), Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., John Wiley and Sons (1987)) и др.

Более конкретно, ДНК-молекулы настоящего изобретения, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора, можно получить следующим образом.

Два типа частичных аминокислотных последовательностей выбирают из аминокислотных последовательностей рецептора глюканового активатора. Приготавливают праймеры, состоящие из комбинаций всех оснований, которые могут кодировать C-конец выбранной частичной последовательности, и праймеры, состоящие из комбинаций всех оснований, которые могут кодировать N-конец выбранной частичной последовательности. Эти синтезированные праймеры используют в качестве смешанных праймеров для осуществления двух PCR с использованием ДНК-молекул подходящей кДНК-библиотеки сои в качестве матрицы. Затем два амплифицированных фрагмента заданной длины, амплификацию которых ожидают (эти фрагменты соответствуют ДНК-молекулам, кодирующим вышеуказанные две частичные аминокислотные последовательности), выделяют и определяют их нуклеотидные последовательности. На основании определения нуклеотидных последовательностей синтезируют праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую C-конец аминокислотной частичной последовательности, расположенной у C-конца рецептора глюканового активатора, и праймер, содержащий аминокислотные последовательности, кодирующие N-конец аминокислотной частичной последовательности, расположенной у N-конца рецептора глюканового активатора. Эти два синтезированных праймера используют для осуществления PCR, с использованием ДНК-молекул вышеуказанной соевой кДНК-библиотеки в качестве матрицы. Полученные амплифицированные фрагменты используют в качестве зондов для гибридизации вышеуказанной соевой кДНК- библиотеки, в результате чего получают ДНК-молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора.

Полученные ДНК-молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рецептор глюканового активатора, можно секвенировать любым известным способом, например способом Максам-Джилберта (Maxam-Gilbert Method Enzymol. , 65:499, 1980), методом терминации дидеоксинуклеотидной цепи, используя М13 фаг (J.Messing et al., Gene, 19:269, 1982) и т.п.

Так как результаты различных исследований глюканового активатора предполагают, что рецептор глюканового активатора играет важную роль в устойчивости растений по отношению к грибкам, ожидается, что ДНК-молекулы, кодирующие рецептор глюканового активатора настоящего изобретения, и их фрагменты могут придавать растениям устойчивость к грибкам, если их ввести и экспрессировать в растительных клетках (особенно в клетки высших растений), которые не содержат рецептора глюканового активатора, в соответствии с обычной процедурой. Было выдвинуто предположение, что грибки, способные инфицировать растения, обычно имеют супрессоры, за счет чего обладают способностью подавлять устойчивость растений по отношению к грибкам. Ожидается, что новые растения, обладающие устойчивостью к грибкам, можно будет получить за счет введения и экспрессии ДНК-молекул, кодирующих рецептор глюканового активатора настоящего изобретения и их фрагментов так, чтобы ER работал, или за счет модификации ДНК-молекул и их фрагментов, или за счет регулирования их экспрессируемых количеств. Более того, если ДНК-молекулы настоящего изобретения и их фрагменты вводят и экспрессируют в растительных клетках, особенно в клетках высших растений, наряду с генами, повышающими устойчивость к грибкам, или такие свойства, как те, которыми обладает ген глюканазы, который придает растениям устойчивость к грибкам, ожидается, что в таком случае растениям можно придать более высокую устойчивость к грибкам нежели в том случае, когда вводят ген глюканазы.

Векторы, которые используют для введения молекул ДНК, кодирующих рецептор глюканового активатора, и их фрагментов можно сконструировать так, чтобы рецептор глюканового активатора мог быть стабильно экспрессирован в растения. Более конкретно, промотор, ДНК-молекула, кодирующая кодон инициирования (ATG) и терминатор можно вводить в ДНК-молекулы, кодирующие рецептор глюканового активатора, и их фрагменты, в соответствующих комбинациях. Примеры таких промоторов включают промотор генов, кодирующих малую субъединицу рибозо-1,5-бис-фосфаткарбоксилазы (Fluhr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:2358), промотор гена нопалин-синтазы (Langridge et al. , Plant Cell Rep. (1985) 4:355), промотор для продуцирования вируса мозаики цветной капусты 19S-RNA (Guilley et al., Cell. (1982) 30:763), промотор для продуцирования вируса мозаики цветной капусты 35S-RNA (Odell et al., Nature (1985) 313:810) и т.п. Примеры терминаторов включают терминатор гена нопалин-синтазы (Depicker et al., J.Mol. Appl. Gen. (1982) 1:561) и терминатор гена октопин-синтазы (Gielen et al., EMBO J. (1984) 3:835).

ДНК-молекулы, кодирующие рецептор глюканового активатора и их фрагменты можно ввести в растительные клетки обычными хорошо известными способами, например способом, указанным в "Plant genetic transformation and gene expression; a laboratory manual", J. Draper et al. eds., Blackwell Scientific Publications, 1988. Примеры таких способов включают такие биологические способы, как те, которые используют вирусы или Agrobacteria, и такие физико-химические способы, как электропорация, способ с использованием полиэтиленгликоля, микроинъекции и т.п.

Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно со ссылками на следующие примеры, которые никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения.

Пример 1 Очистка ER, полученного из корней сои.

1) Определение активности связывания глюканового активатора ER.

Комплекс активатора (средний молекулярный вес :10000) и тирамина (TOKYO KAS EI KOGYO CO., LTD) синтезируют способом Jong-Joo Cheong (The Plant Cell (1991) 3:127). Комплекс активатор-тирамин метят иодом, используя хлорамин T.

Образец (количество протеина менее 500 мкг) суспендируют в 500 мкл аналитического буфера (50 мМ Tris - HCl pH 7,4, 0,1 М сахароза, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ PMSF и 5 мМ ЕДТА) и инкубируют при 0^oC в течение 2 часов. Меченый иодом комплекс активатор-тирамин в количестве 7,0 нМ (70 Кюри/ммоль, число молей рассчитывают в предположении, что молекулярный вес активатора составляет 10000, и это значение используют во всем описании) добавляют к суспензии, и полученную смесь инкубируют при 4^oC в течение 2 часов. Реакционный раствор фильтруют через Watman GF/B и обрабатывают 0,3% раствором полиэтиленимина в течение по крайней мере 1 часа. Остаток трижды промывают 5 мл буфера, охлажденного льдом (10 мМ Tris - HCl pH 7,0, 1 М NaCl, 10 мМ MgCl₂). Определяют радиоактивность, сохранившуюся на фильтре, с помощью гамма-счетчика (отсчет A). Для того чтобы исключить эффект неспецифического связывания, осуществляют ту же процедуру, что и раньше, за исключением того, что к каждому образцу добавляют 17 мкМ рецептора, полученную смесь суспендируют в аналитическом буфере, и полученную суспензию инкубируют при 0^oC в течение 2 часов. Полученную величину вычитают из отсчета A, что дает величину ( срм=число импульсов в минуту). Эту полученную величину ( срм) делят на полное количество импульсов, а затем умножают на полное количество активаторов, использованных в эксперименте, для того, чтобы рассчитать количество протеина, связывающего активатора (в молях).

Степень чистоты ER проверяют вышеуказанным способом.

2) Выделение ER, полученных из корней сои Семена сои (Glycine max. CV. Green Homer) (Takayama Seed Co.) культивируют на вермикулите в течение 1 недели, а затем ведут аквакультуру на вермикулите в течение 15 дней для сбора корней (около 40 кг влажного веса). Собранные корни хранят при -80^oC до тех пор, пока их не используют для выделения ER. К корням (2 кг влажн. вес) добавляют охлажденный льдом буфер (25 мМ Tris - HCl pH 7,0, 30 мМ PMSF) в количестве 1,25 л, и полученную смесь гомогенизируют в смесителе Waring в течение 2 минут.

Полученную суспензию фильтруют через Miracloth (Calbiochem Co.), и полученный фильтрат центрифугируют со скоростью 9000 об/мин при 4^oC в течение 15 минут. Надосадочную жидкость ультрацентрифугируют со скоростью 37000 об/мин при 4^oC в течение 20 минут. Осадок суспендируют в 160 мл охлажденного льдом буфера (25 мМ Tris - HCl pH 7,4, 0,1 М сахарозы, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ PMSF и 5 мМ EDTA) до получения мембранной фракции. К мембранной фракции добавляют амфолитический детергент ZW3-12 (Boehringer Co.) до получения финальной концентрации 0,25% для солюбилизации ER из мембранной фракции, и полученную смесь перемешивают при 8^oC в течение 30 минут. Полученную смесь ультрацентрифугируют со скоростью 37000 об/мин при 4^oC в течение 20 минут для того, чтобы собрать надосадочную жидкость, содержащую солюбилизированные ER (растворимая фракция). 165 мл растворимой фракции диализуют против 2 л буфера (50 мМ Tris - HCl pH 8,0, 0,2% ZW3-12, 4^oC) 4 раза. К образцу добавляют 5 мл Protrap (TAKARA SHUZO Co., ТД), и полученную смесь перемешивают при 8^oC в течение 30 минут для удаления протеаз из образца и для стабилизации ER. Полученную смесь центрифугируют при 2800 об/мин при 4^oC в течение 2 минут для того, чтобы собрать надосадочную жидкость. Полученную надосадочную жидкость (160 мл) концентрируют до примерно 50 мл, используя ультрафильтрационную мембрану VM-10 (Amicon Co. ), и концентрат диализуют против A-буфера (50 мМ Tris - HCl pH 8,0, 0,1 М сахарозы, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ PMSF, 5 мМ EDTA и 0,2% ZW3-12, 4^oC).

Полученный диализат наносят на Q-Sepharose HP 26/10 (Pharmacia Co.), и ER элюируют с линейным градиентом 0-1 М NaCl (Q-Sepharose активная фракция). ER элюируют при концентрации NaCl около 0,45 М. Q-Sepharose активную фракцию разбавляют в 3 раза буфером A, и разбавленную фракцию наносят на Mono Q 10/10 (Pharmacia Co.). ER элюируют с линейным градиентом 0-1 М NaCl (Mono Q активная фракция, 8 мл). ER элюируют при концентрации NaCl около 0,25 М.

ER очищают с помощью афинного геля, используя активатор в качестве лиганда, следующим образом.

Активатор приготавливают в соответствии со способом N.T.Keen с некоторыми модификациями (Plant Physiol. (1983) 71:460, Plant Physiol. (1993) 71: 466). Короче, стенки мицелия патогенной Phytophthora megasperma f.sp. glycinea paca 1 (ATCC 34566) обрабатывают зимолиазой 100T (KJRJN BREWERY CO. , LTD) для высвобождения активатора. После обработки зимолиазу (Zymolyase 100T) удаляют с помощью СМ-целлюлозы, набитой в колонку. Полученную после пропускания через колонку фракцию очищают с помощью гель-проникающей хроматографии G75 (Pharmacia Co.) для отбора той фракции активатора, средний молекулярный вес которой составляет 10000 Да. Индуцирующую глицеолин активность активатора собранной фракции определяют по способу M.Yoshikawa (Nature (1978) 257:546). Добавление 8 мкг активатора к семядолям сои вызывает индуцирование около 550 мкг глицеоллина после 24 часов инкубирования.

Для исключения неспецифической адсорбции на геле-носителе, Mono Q активную фракцию собирают и перемешивают с примерно 33 мг соединенного с мальтозой стеклянного геля (объем слоя около 100 мкл) при 8^oC в течение 1 часа. Этот гель осаждают центрифугированием (1000 об/мин, 4^oC, 2 минуты) для сбора надосадочной жидкости (фракция, пропущенная через соединенный мальтозой стеклянный гель). Соединенный мальтозой стеклянный гель получают по способу А. М. Jeffrey et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1975) 62:608). Короче, 120 мг мальтозы и 6 г Glass Aminopropyl (Sigma Co.) суспендируют в 36 мл H₂O, и полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. К полученной суспензии добавляют 36 мл этанола. Сразу после этого к смеси добавляют раствор боргидрида натрия (864 мг) в 72 мл этанола. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 часов. Добавляют 288 мл воды к реакционной смеси, и полученную смесь охлаждают льдом и доводят до pH 5,6 уксусной кислотой. Этот гель промывают примерно 1,8 л H₂O для удаления свободной мальтозы. Мальтозу, содержащуюся в промывочном растворе определяют количественно по способу J.H.Roe (J.Biol. Chem. (1955) 212:335), используя реагент антрон. Количество соединенной в геле мальтозы определяют, учитывая количество мальтозы, содержащееся в промывочном растворе. В результате оказывается, что 60 мг мальтозы соединилось с 6 г Glass Aminopropyl.

Около 17 мг соединенного с активатором стеклянного геля (объем слоя около 50 мкл) добавляют к 8 мл фракции, пропущенной через соединенный с мальтозой стеклянный гель, и полученную смесь осторожно перемешивают при 8^oC в течение ночи. Гель собирают центрифугированием (1000 об/мин, 4^oC, 2 минуты) и промывают 2 объемами слоя буфера A дважды. Этот гель промывают дополнительно 4 объемами слоя 0,1% SDS трижды для сбора соединенных с гелем ER (фракции, элюированные из соединенного с активатором стеклянного геля). Объединенный с активатором стеклянный гель получают по способу A.M.Jeffrey et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1975) 62:608). Короче, активатор (37 мг) и Glass Aminopropyl. (490 мг) суспендируют в 6 мл H₂O и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. К суспензии добавляют 6 мл этанола, и немедленно после этого добавляют раствор боргидрида натрия (144 мг) в 12 мл этанола. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 часов. К полученной смеси добавляют 48 мл воды. Эту смесь охлаждают льдом и pH устанавливают 5,6 за счет уксусной кислоты. Свободный активатор определяют количественно реагентом антроном. Количество объединенного с гелем активатора оценивают из количества свободного активатора, содержащегося в промывочном растворе. В результате оказывается, что 34 мг активатора соединилось с 490 мг Glass Aminopropyl.

Количества протеина и ER на вышеуказанных стадиях очистки представлены в таблице 1.

Mono Q активная фракция, фракция, пропущенная через соединенный с мальтозой стеклянный гель, и фракция, элюированная из соединенного с активатором стеклянного геля (по 10 мкл каждая), были обработаны электрофоретически на электрофоретическом градиентном геле, SDS-PAGE пластине 10/20 (Daiich Kagaku Jakuhin Co.) и окрашены серебром (Daiich Kagaku Jakuhin Co.). Картины электрофореза представлены на фиг. 1. На фиг. 1 полоса 1 представляет Mono Q активную фракцию; полоса 2 - пропущенную через соединенный с мальтозой стеклянный гель; полоса 3 - фракцию, элюированную из соединенного с активатором стеклянного геля.

Из фиг. 1 видно, что ER полосы детектируются с молекулярным весом около 70000 Да.

Протеин с молекулярным весом около 70000 метят иодом-125, используя при этом ¹²⁵I-меченый комплекс фотоафинного реагента SASD (Pierce Co.) и активатор. SDS-PAGE полосу мембранной фракции переносят на PVDF мембрану с помощью Вестернблоттинга и инкубируют с тем же самым ¹²⁵I-меченым активатором, который используют при определении активатор-связывающей активности ER на PVDF мембране так, чтобы протеин с молекулярным весом около 70000 Да был помечен иодом-125. Эти факты показывают, что протеин с молекулярным весом около 70000 Да обладает активатор-связывающей активностью.

Около 4 мкг ER выделяют из примерно 40 мг (влажный вес) соевых корней вышеуказанным способом.

3) Анализ ER-фрагментированных пептидов ER фрагментируют за счет переваривания протеазой до пептидов. Аминокислотные последовательности фрагментированных пептидов определяют по способу Jwamatsu (Akihiro Jwamatsu, Seikagaku (1991) 63:139, A.Jwamatsu, Electrophoresis (1992) 13:142). Раствор ER, очищенных вышеуказанным способом, концентрируют до около 100 мкл на Centricon-30 (Amicon Co.) и обрабатывают электрофоретически на 10 - 20% SDS полиакриламидном геле. Полученные протеиновые полосы переносят на PVDF мембрану (Millipore Co.) с помощью аппарата электроблоттинга (Sartrius Co.). Перенесенные на PVDF мембрану полосы окрашивают 0,1% Ponceau S (Sigma Co.)/ 1% уксусной кислотой. Основную полосу с молекулярным весом 70000 Да вырезают и обесцвечивают 0,5 мМ NaOH. Эту полосу восстановительно S-карбоксиметилируют. К полученной полосе добавляют лизилендопептидазу (AP-1) при отношении энзим:субстрат (мол:мол) 1:100, и полученную смесь подвергают взаимодействию при 30^oC в течение 16 часов. Полученные фрагментированные пептиды вводят в мк-Bondasphere 5 мкм C8-300 (2,1 х 150 мм Waters) колонку, уравновешенную 98% растворителя A и 2% растворителя B, и элюируют с 2 - 50% линейным градиентом растворителя B в течение 30 минут при скорости потока 0,25 мл/минуту (растворитель A: 0,05% TFA раствор, растворитель B: 0,02% TFA в 2-пропанол/ацетонитриле = 7:3 (объем/объем)). Элюированные пептиды определяют по поглощению на 214 нМ, фракции каждого пика собирают вручную. Полученные пиковые фракции анализируют на газофазном секвенаторе протеинов (Модель 470 A Applied Biosystem). В результате анализа всех полученных пиковых фракций точно определяют следующие аминокислотные последовательности фрагментированных пептидов: N 1: Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Asn Ile Ser Pro Gln (N-конец) N 5: Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Ser N 6: Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp N 7: Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile Lys (смешанная последовательность).

Пример 2 Клонирование ER гена сои Семена сои (Glycine max cv. Green Homer) (Takayama Seed Co.) культивируют на вермикулите в течение 1 недели, а затем ведут водную культуру в течение 15 дней для сбора корней (около 40 кг, влажный вес). Часть собранных корней хранят при -80^oC до использования. Полную РНК получают по способу Ishida (Cell Technology Laboratory Manipulation Manual, Kodansha Scientific). Короче, хранившиеся корни (28,5 г влажный вес) измельчают в ступке, добавляя жидкий азот. К полученному порошку добавляют 35,6 мл GTC раствора, хранившегося при 65^oC, и полученную смесь гомогенизируют в смесителе Waring. Полученную суспензию центрифугируют со скоростью 6000 об/мин при комнатной температуре в течение 15 минут до сбора 40 мл надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость осторожно наносят на слой раствора цезия в центрифужной ампуле и центрифугируют со скоростью 35000 об/мин при 25^oC в течение 20 часов. Полученный осадок растворяют в 9 мл TE/ 0,2% SDS. После того, как дважды проводят экстракцию смесью фенол/хлороформ, полную РНК выделяют осаждением этанолом (4,37 мг).

Полученную полную РНК (2,2 мг) очищают с помощью олиготекса (Oligotex dT30, Japan Roche Co.) в соответствии с указаниями изготовителей, до получения 60 мкг poly (A) + RNK.

2) Получение библиотеки кДНК сои Молекулы кДНК синтезируют из 5 мкг poly (A) + RНК с помощью набора для синтеза кДНК (Pharmacia Co.) в соответствии с указаниями изготовителей. Синтезированные фрагменты кДНК лигируют с лямбда-фаговым вектором gt10 (Stratagene Co. ) с помощью T4 лигазы (TAKARA SHUZO CO., LTD). Для упаковки смеси ДНК в фаговые частицы используют Gigopack (Stratagene Co.) и получают кДНК библиотеку сои - примерно 1,5 10⁶ б.о.е. Эту библиотеку амплифицируют до 160 мл библиотеки кДНК сои 1,6 10¹¹ б.о.е./мл.

Полную ДНК в библиотеке кДНК получают следующим образом: смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1) добавляют к 500 мкл раствора фага (1,6 10¹¹ б.о.е./мл) в равном количестве. Полученную смесь встряхивают в течение 30 секунд и центрифугируют для сбора водного слоя. Водный слой снова экстрагируют смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1). К полученному водному слою добавляют 5 мкл 3 М раствора ацетата натрия (pH 5,4) и 125 мкл этанола, и полученную смесь центрифугируют для сбора осадка. Полученный осадок промывают 70% этанольным раствором и растворяют в 10 мМ Tris -HCl раствора (pH 8), содержащего 1 мкг/мл RN-ase A (RNA e A, Sigma Co.). Полученный раствор используют в качестве PCR матрицы.

3) Амплификация и клонирование кДНК-фрагментов ER сои за счет PCR Нижеследующие четыре олигодеоксинуклеотида (смешанные праймеры U5, U7, U10 и U12) синтезируют с помощью автоматического синтезатора нуклеиновых кислот (модель 394 Applied Biosystems Co.) на основании аминокислотных последовательностей фрагментированных пептидов, полученных в примере 1 (N 5 и N 6): Праймер 5 5'-AARAGYATHGAYGGNGA-3' Праймер 7 5'-WRTCNCCNACNAC-3' Праймер 10 5'-GTNAAYAARATNCARAC-3' Праймер 12 5'-ARRTTNAGRAARTCYTC-3' (R:A/G, Y:C/T, W:A/T, H:A/C/T, N:A/G/T/C) Полную ДНК в 0,5 мкг кДНК библиотеки растворяют в 79 мкл дистиллированной воды. К 8 мкл 2,5 мМ dNTP в 10 мкл 10хPCR буфера (присоединенного к Tag ДНК полимеразе TAKARA SHUZO CO., LTD) добавляют либо комбинацию праймеров U5 и U7, либо комбинацию праймеров U10 и U12 (по 100 пмолей каждого) и 0,5 мкл Tag ДНК полимеразы (TAKARA SHUZO CO., LTD) до конечного объема 100 мкл. PCR реакцию ведут с помощью Gene Amp. PCR System 9600 (Perkin - Elmer Co.) в 50 циклов 1) денатурирование при 94^oC х 30 секунд, 2) ренатурирование при 47^oC х 30 секунд и 3) удлинение при 72^oC х 1 минуту. После реакции 15 мкл реакционного раствора обрабатывают электрофоретически на 15% полиакриламидном геле. Этот гель подкрашивают 0,5 мкг/мл этидиумбромидного раствора в течение 10 минут. Полосы, демонстрирующие специфические амплифицированные фрагменты 40bp и 47bp, амплификацию которых ожидали, вырезают, наблюдая под УФ-светом. Кусочки геля снимают пластиковым стержнем и элюируют элюирующим буфером (0,5 М ацетат аммония, 10 мМ ацетат магния, 1 мМ ЕДТА и 0,10 SDS) в течение ночи для того, чтобы собрать ДНК-содержащий раствор.

Собранные ДНК-фрагменты клонируют в плазмиду pT7Blue (R) с помощью pT7Blue T-Vector набора (Novagene Co.). Полученные плазмиды pN 5 - 1, 2 и pN 6 - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 секвенируют на флуоресцентном автоматическом ДНК секвенаторе (модель 373A Applied Biosystem Co.). Полученные результаты показывают, что полученные амплифицированные ДНК-фрагменты, отличные от праймеров, также кодируют аминокислотные последовательности фрагментированных пептидов N 5 и N 6.

Два нижеследующих олигодеоксинуклеотида (смешанные праймеры U18 и U19) были синтезированы с помощью автоматического синтезатора нуклеиновых кислот на основании результатов ДНК секвенирования.

Праймер U18 5'-AAGTAYAAGCCRCAAGCCTATTCA-3' Праймер U19 5'-ATCGCCRACAACMCCAA-3' (Y и R имеют указанные ранее значения, M:A/C).

Полную ДНК в 0,5 мкг кДНК-библиотеки растворяют в 79 мкл дистиллированной воды. Комбинацию праймеров U18 и U19 (100 пмолей каждого) и 0,5 мкл Tag ДНК полимеразы добавляют к 8 мкл 2,5 мМ dNTP в 10 мкл 10хPCR буфера до получения конечного количества 100 мкл. PCR реакцию осуществляют в 40 циклов 1) денатурирование при 94^oC х 30 секунд, 2) ренатурация при 52^oC х 30 секунд и 3) удлинение при 72^oC х 1 минуту. Пятнадцать микролитров реакционного раствора обрабатывают электрофоретически на 1% агарозном геле.

Гель окрашивают 0,5 мкг/мл этидиумбромидного раствора в течение 15 минут. Полосу, демонстрирующую специфический амплифицированный фрагмент около 540bp вырезают, наблюдая под УФ-светом. Кусочки геля обрабатывают Gene Clean 11 (Bio 101 Co.) для сбора ДНК-содержащего раствора.

Собранный ДНК- фрагмент клонируют в плазмиду pT7Blue (R) с помощью pT7Blue T-Vector набора. Полученную плазмиду pN 5 - pN 6 секвенируют флуоресцентным секвенатором. Полученные результаты показывают, что амплифицированный ДНК-фрагмент состоит из 539 bp и кодирует не только аминокислотные последовательности фрагментированных пептидов N 5 и N 6 с обеих сторон, но также и пептида N 7 в амплифицированной части.

4) Скринирование и клонирование библиотеки за счет гибридизации.

Плазмиду N 5 - N 6, в которую был клонирован ER кДНК- фрагмент, переваривают рестрикционными энзимами Bam H1 и Pst 1. Выделяют ДНК фрагмент около 540bp и используют в качестве зонда. Выделенный ДНК-фрагмент метят [^-32P] dCTP с использованием системы введения метки в ДНК Megaprime (Amersham Co.) в соответствии с инструкциями изготовителей, и реакционный раствор используют в экспериментах по гибридизации.

Фаг кДНК-библиотеки инфицируют E.coli C600 hfl (Invitrogen Co.) и инокулируют в 10 мг/мл MgCl₂-содержащей Z-среды на пластинах диаметром около 15 см, до получения вс