Штамм streptomyces fradiae ницб 99-продуцент тилозина

Штамм streptomyces fradiae ницб 99-продуцент тилозина

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99 получен путем селекции на агаризованной среде, содержащей канамицин (10 мкг/мл), и последующего отбора среди Kan^r-мутантов штаммов с высоким уровнем активности и содержанием тилозина более 90%. Штамм характеризуется стабильно высоким уровнем продукции при ферментации в присутствии солей CaCl₂ (0,2-0,3%), продуцирует более 90% тилозина. При последовательных пересевах через каждые 3 месяца на агаризованной среде СР-15 в течение 18 месяцев штамм сохраняет основные морфологические и биохимические признаки, высокий уровень антибиотикообразования, а содержание тилозина при этом составляет более 90%. Штамм хранится в коллекции культур НИЦ "БИОАН" и коллекции культур лаборатории биотехнологии продуцентов антибиотиков ГУП "ГосНИИСинтезбелок". Штамм используют для промышленного производства ветеринарного антибиотика тилозина.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается микробиологического способа получения макролидного антибиотика тилозина.

Тилозин основание - макролидный антибиотик, в структуру которого входит: 16-членный тилополидиновый цикл, аминосахармикаминоза, нейтральные сахара - мициноза и микароза. Эмпирическая формула тилозина-основания - C₄₆H₇₇NO₁₇, молекулярная масса - 916,1 дальтон.

Тилозин имеет широкий антимикробный спектр действия, воздействует на грамположительные микроорганизмы, грибы, микоплазмы и др., затормаживает синтез белка, обладает бактериостатическим и бактерицидным свойствами. Тилозин отличается малой токсичностью, хорошо всасывается из кишечника в кровь и быстро выделяется из организма, не накапливается во внутренних органах (почки, печень, селезенка, сердце), а также в мышечной ткани, коже и сале. Препарат тилозин используется как лечебный препарат в ветеринарии для лечения ряда заболеваний животных и птиц: пневмонии, дизентерии, микоплазмов и др.

Известны штаммы-продуценты тилозина, предназначенные для промышленного производства антибиотика [1, 2]. Недостатком этих штаммов является их физиологическая нестабильность проявляющаяся в невоспроизводимости заданных показателей (уровень активности и процентное содержание тилозина А) в многократных повторных экспериментах.

Для получения высокопродуктивных штаммов со стабильными характеристиками используют различные приемы. Известен способ получения высокопродуктивных штаммов путем введения в ферментационную среду хлористого кальция (CaCl₂) [3] . Добавление CaCl₂ улучшает компонентный состав тилозинового комплекса, но вместе с тем снижает на 15-20% общий уровень активности.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Streptomyces fradiae 25-C - продуцент антибиотика тилозина, полученный методом мугагенеза [4]. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ-S-1340. Штамм Streptomyces fradiae 25-C обладает высоким уровнем антибиотикообразования, улучшенным компонентным составом тилозинового комплекса (содержание тилозина А более 90%), но вместе с тем не обладает способностью воспроизводимо демонстрировать заданный высокий уровень активности.

Цель изобретения - высокопродуктивный стабильный штамм Streptomyces fradiae - продуцент тилозина, пригодный для организации рентабельного, конкурентоспособного на мировом рынке производства антибиотика тилозина.

Штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99 получен из исходного штамма S. fradiae ВНИИгенетика 25-А, предназначенного для получения антибиотика фрадизина [2].

Исходный штамм высевают на плотную, стандартную агаризованную среду, содержащую CaCl₂ (0,2%) и антибиотик канамицин в концентрации 10 мкг/мл, и отбирают спонтанные Kan^r - мутанты, выросшие при данных условиях. Kan^r-мутанты проверяют на способность синтезировать тилозин в присутствии CaCl₂ и определяют показатели, характеризующие эту способность: уровень активности и % содержание тилозина А в тилозиновом комплексе. Отобранные Kan^r-мутанты с высоким уровнем тилозина и высоким процентным содержанием тилозина А (более 90%) проверяют на способность стабильно в течение шести поколений сохранять приобретенные признаки.

В результате отобран штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99, характеризующийся стабильно высоким уровнем продукции при ферментации в присутствии солей CaCl₂ (0,2-0,3%), продуцирующий более 90% тилозина А в сумме тилозинового комплекса и воспроизводимо демонстрирующий эти показатели при многократных проверках. При последовательных пересевах через каждые 3 месяца на агаризованной среде СР-15 в течение 18 месяцев отобранный штамм сохраняет основные морфологические и биохимические признаки, высокий уровень антибиотикообразования, а содержание тилозина при этом составляет более 90%. Штамм Steptomyces fradiae НИЦБ 99 хранится в коллекции культур НИЦ "БИОАН" и коллекции культур лаборатории биотехнологии продуцентов антибиотиков ГУП "ГосНИИСинтезбелок".

По основным морфологическим и биохимическим признакам Steptomyces fradiae НИЦБ 99 существенно не отличается от типичных продуцентов этого вида и имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Мицелий нитевидной формы, спороносцы прямые и крючкообразные, споры гладкие и овальные.

Рост на агаризованных средах Гуазе, СР-15 и Ваксмана на 14 сутки при температуре 28^oC.

На среде Гаузе образует выпуклые колонии диаметром 6-10 мм, округлые. Воздушный мицелий обильный, белого или светло-серого цвета. Обратная сторона колоний темно-серая.

На среде СР-15 образует колонии диаметром 6-12 мм, округлые, выпуклые, воздушный мицелий светло-серый с обильной споруляцией. Обратная сторона колонии темно-серая.

На среде Ваксмана слаборазвитый белый воздушный мицелий, субстратный мицелий светло-кремовый. Колонии округлые, слегка выпуклые в центре, с диаметром 6-8 мм. Диффундирующий пигмент отсутствует на всех средах. При культивировании на жидкой ферментационной среде штамм образует крупные сцепления мицелия с хорошо выраженной базофилией; гифы мицелия нитевидные, споры гладкие и овальные.

Биохимические свойства, условия поддержания и хранения.

Желатин не разжижает, крахмал гидролизует, хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, рамнозу, слабее - арабинозу, ксилозу, лактозу.

Источники азота. Хорошо растет на синтетических питательных средах, содержащих минеральные источники азота (хлористый, азотнокислый и сернокислый аммоний, азотнокислый калий).

Культура штамма S. fradiae НИЦБ 99 может храниться сроком до двух месяцев в холодильнике при температуре от 2 до 5^oC на косяках агаризованной среды СР-15 в стеклянных пробирках вместимостью 50-60 мл.

Споры штамма можно хранить в течение 1 года в замороженном 40% водном растворе глицерина в морозильнике при температуре минус 70^oC. Хранение осуществляют в герметично закрытых флаконах.

Для более длительного хранения культуру замораживают, высушивают в вакууме (сублимационная сушка, лиофилизация) и хранят в лиофильно-высушенном состоянии в запаянных стеклянных ампулах или герметично укупоренных флаконах в холодильнике при 2-5^oC.

Обновление культуры, хранящейся на косяках среды СР-15, проводят не реже 1 раза в 3 месяца. Из хранящейся партии в работу берут 2 косяка, один из которых служит маточным, другой - контрольным. Используют косяки с максимальной паспортной продуктивностью без видимых (визуально) изменений культурально-морфологических признаков колоний штамма. Первоначально готовят суспензию спор: культуру смывают с исходного маточного косяка стерильной дистиллированной водой (4-5 мл на косяк) при помощи стерильной микробиологической петли и после встряхивания фильтруют в асептических условиях через ватный, а затем бумажный фильтр для отделения мицелия. Фильтрат, представляющий собой суспензию спор, рассевают на чашки Петри с агаризованной средой СР-15 с таким расчетом, чтобы на каждой чашке выросло не более 25-30 отдельных колоний. Для этого готовят 3 разведения споровой суспензии (10^-5, 10^-6, 10^-7), каждое из которых рассеивают на 15-16 чашек, таким образом всего готовят около 50 чашек. Чашки инкубируют в течение 14-15 суток в термостате при температуре (29+1)^oC. Далее отбирают не менее 100 (100-120) типичных по морфологическим признакам колоний и пересевают их на отдельные косяки среды СР-15. Косяки-моноизоляты инкубируют в термостате в течение 14-15 суток при температуре (29+1)^oC, после чего проверяют их продуктивность (антибиотическую активность и содержание тилозина А).

Пример 1. Получение штамма Streptomyces fradiae НИИБ 99.

Исходный штамм Streptomyces fradiae ВНИИгенетика 25-А высевают на агаризованную среду СР-15 следующего состава (мас.%): соевая мука - 0,5; кукурузный экстракт - 0,05; меласа - 0,5; сернокислый магний - 0,07; хлористый натрий - 0,05; хлористый кальций - 0,2; агар - 2,0; вода (до 1 л) и канамицин в концентрации 10 мкг/мл. После 14 дней инкубации при 28+1^oC отбирают на косяки выросшие спонтанные мутанты, устойчивые к канамицину. Частота появления мутантов составляет 210^-6.

Выделенные мутанты в количестве не менее 200 проверяют на способность расти на среде СР-15 в присутствии 10 мкг/мл канамицина (Kan^r). Отобранные таким образом Kan^r-мутанты проверяют на способность синтезировать тилозин в жидкой ферментационной среде (сморти пример 2). Методом тонкослойной хроматографии в силикогеле (ТСХ) определяют суммарное содержание тилозинов и процентное содержание тилозина А в тилозиновом комплексе. На первом этапе отбирают мутанты, уровень активности которых превышает уровень активности исходного штамма, а содержание тилозина А составляет более 90%. Отобранные мутанты подвергают исследованиям на способность сохранять заданные показатели в течение шести последовательных циклов моноспорового пересева через косяки. Из 12 предварительно отобранных таким образом мутантов наиболее выраженными заданными показателями обладал штамм S. fradiae НИЦБ 99.

Определение компонентного состава тилозина, его предшественников и производных методов ТСХ показало, что содержание тилозина А составляет 90-95%, а уровень активности выше, чем у исходного штамма при росте в ферментационной среде, содержащей CaCl₂ в концентрации (0,2-0,4%).

Пример 2. Ферментация штамма Streptomyces fradiae НИЦБ 99.

Споровой суспензией засевают 10 колб емкостью 750 мл, заполненных по 50 мл посевной среды следующего состава (мас.%): соевая мука - 1; мука пшеничная - 1,5%; соевое масло (0,3 мл на колбу); CaCO₃ - 0,35%. Значение pH среды после стерилизации составляет 7,4-7,6.

Инокулят выращивают при температуре 28+1^oC в течение 48 часов на круговой качалке (количество оборотов 240-260 мин^-1; амплитуда колебаний - около 6 см). Затем инокулят в количестве 10% от объема среды засевают в ферментационную среду следующего состава (мас.%): меласса - 2%; мука пшеничная - 2%; глютен - 1,5%; дрожжи АГД - 0,2%, однозамещенный фосфорнокислый аммоний - 0,035; хлористый натрий - 0,1%; сернокислый магний - 0,3%; хлористый кальций - 0,2%; CaCO₃ - 0,3%; соевое масло (1,9 мл на колбу). Значение pH среды после стерилизации составляет 7,2.

Ферментацию проводят в течение 150 часов на круговой качалке при 240-260 об/мин и температуре +29^oC. После завершения ферментации содержание тилозина в культуральной жидкости определяют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Накопление тилозинового комплекса в фильтрате культуральной жидкости составляет в среднем по десяти колбам 12800 мкг/мл. При этом содержание тилозина составляет 93-97,5 от суммарного содержания тилозинового комплекса.

При шестикратном повторении описанного эксперимента штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99, выращенный в ферментационной среде, содержащей 0,2% CaCl₂, стабильно демонстрировал высокое содержание тилозина А в культуральной жидкости (более 90%).

Таким образом, штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99 обладает высокой способностью к биосинтезу тилозина - до 12800 мкг/мл, осуществляет процесс биосинтеза на средах, содержащих хлористый кальций (CaCl₂) в концентрации 0,2-0,3%, воспроизводимо образуя при этом более 90% тилозина А.

С учетом вышеизложенного штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99 может быть использован для промышленного производства тилозина.

Список литературы.

1. Патент РФ N 2057180. Приоритет 28.12.1993 г. МПК C 12 P 1/06. Опубл. Бюл. N 9, 27.03.1996 г.

2. Патент РФ N 2109056. Приоритет 18.05.1994 г. МПК C 12 P 1/06. Опубл. Бюл. N 11, 20.04.1998 г.

3. Миронов В.А., Антонова С.В., Бобылева Р.И. и др. Влияние ионов Ca²⁺ на биосинтез и компонентный состав тилозина у Streptomyces fradiae. - Антибиотики и химиотерапия, 1997, т. 42, N 4, стр. 3-7.

4. Патент РФ N 2065878. Приоритет 18.05.1994 г. МПК C 12 P 1/06. Опубл. Бюл. N 24, 27.08.1996 г.

Формула изобретения

Штамм Streptomyces fradiae НИЦБ 99-продуцент тилозина.