Лечебные средства против хронического ревматоидного артрита, содержащие антагонист il-6 в качестве эффективного компонента

Лечебные средства против хронического ревматоидного артрита, содержащие антагонист il-6 в качестве эффективного компонента

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтической композиции для лечения хронического ревматоидного артрита и ингибитору роста синовиальных клеток. Композиция содержит в качестве эффективного компонента антитело против рецептора интерлейкина-6, а ингибитор содержит антагонист интерлейкина-6, выбранный из группы, состоящей из антитела интерлейкина-6, антитела рецептора интерлейкина-6, антитела gp130, модифицированного интерлейкина-6, антисмыслового рецептора интерлейкина-6, неполного пептида интерлейкина 6 и неполного пептида рецептора интерлейкина-6. Изобретение обеспечивает возможность подавления аномального роста синовиальных клеток у пациентов с ревматоидным артритом. 2 c. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.

Настоящее изобретение относится к лечебному средству против хронического ревматоидного артрита или к ингибитору роста синовиальных клеток, содержащему антагонист интерлейкина-6 в качестве эффективного компонента.

Предпосылки создания изобретения Ревматоидный артрит является системным хроническим воспалительным заболеванием, при котором имеет место аномальный рост в суставах соединительной ткани, в том числе синовиальной ткани (Melnyk et al. Arthritis Rheum 33; 493-500, 1990). Показано, что в суставах пациентов с ревматоидным артритом происходит заметный рост синовиальных клеток, образование многослойной структуры вследствие аномального роста синовиальных клеток (образование паннуса), инвазия синовиальных клеток в хрящевую ткань и костную ткань, васкуляризация в направлении синовиальной ткани и инфильтрация воспалительных клеток, таких как лимфоциты и макрофаги. Сообщается, что механизмы возникновения ревматоидного артрита основаны на таких факторах, как наследственность, бактериальная инфекция и способствование ему различных цитокинов и факторов роста, но в целом механизм возникновения заболевания остается неясным.

В последние годы в синовиальной оболочке и в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом обнаружены цитокины и факторы роста, в том числе интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-8 (IL-8), - фактор некроза опухоли (-ФHO), трансформирующие - факторы роста (TGF ), фактор роста фибробласта (FGF) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) (Nouri et al., Clin. Exp. Immunol. 55; 295-302, 1984; Thornton et al., Clin. Exp. Immunol. 86: 79-86, 1991; Saxne, et al. Arthritis Rheum. 31:1041-1045, 1988; Seitz et al., J. Clin. Invest. 87: 463-469, 1991; Lafyatis et al.,J.lmmunol. 143:1142-1148, 1989; Melnyk et al., Arthritis Rheum. 33:493-500, 1990).

Считается, что IL-1, -ФHO и PDGF являются особенно мощными факторами роста синовиальных клеток (Thornton et al., Clin. Exp. lmnunol. 86:79-86, 1991; Lafyatis et al., J.lmmunol. 143:1142-1148, 1989; Gitter et al. Immunology 66:196-200, 1989). Также предполагают, что стимуляция за счет IL-1 и ФИО приводит в результате к продуцированию интерлейкина-6 (IL-6) синовиальными клетками (lto et al. Arthritis Rheum. 35:1197-1201, 1992).

IL-6 является цитокином, известным так же как фактор 2, стимуляции В-клеток или интерферон 2 . IL-6 описан как фактор дифференцировки, способствующий активации В-лимфоцитов (Hira-no,T., et al. Nature 324, 73-76, 1986), и, как было обнаружено позднее, является многофункциональным цитокином, который влияет на функционирование ряда клеток различных типов (Akira, S. et al., Adv.in Immunology, 54, 1-78, 1993). Для индукции активности IL-6 необходимы две функционально различные мембранные молекулы. Одной из них является IL-6 рецептор (IL-6R) с молекулярной массой приблизительно в 80 кД, который специфически связывается с IL-6.

IL-6R существует в мембранофиксирующей форме, которая экспрессируется на клеточной мембране и пронизывает клеточную мембрану, а также в форме растворимого IL-6R (sIL-6R), которая состоит главным образом из внеклеточного домена. Еще один белок представляет gp130 с молекулярной массой приблизительно 130 кД, который не является лиганд-фиксирующим, а скорее функционирует как опосредующий сигнальную трансдукцию. IL-6 и IL-6R образуют комплекс IL-6/IL-6R, который в свою очередь связывается с еще одним мембранным белком gpl30, индуцируя биологическую активность IL-6 по отношению к клетке (Taga et al., J.Exp. Med.196:967, 1987).

Сообщалось, что сыворотка или синовиальная жидкость пациентов с ревматоидным артритом содержит избыточные количества интерлейкина-6 (IL-6) и растворимого IL-6-рецептора (sIL-6R) (Houssiau et al. Arthritis Rheum. 31: 784-788, 1988; Hira-no et al., Eur. J.lmmunol. 18:1797- 1801, 1988; Yoshioka et al., Japn. J.Rheumatol., в печати), и поскольку подобные результаты также получены на животных моделях ревматоидиого артрита (Takai et al. Arthritis Rheum. 32: 594-600, 1989; Leisten et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 56: 108-115, 1990), предполагается, что IL-6 так или иначе играет роль в ревматоидном артрите.

Однако в публикации не прошедшей экспертизу заявки на патент Японии N 4-89433 отмечается, что пептиды, которые в сильной степени промотируют продуцирование IL-6, являются эффективными в качестве лечебных средств против ревматоидного артрита.

Кроме того, Hiqaki с сотр. высказали предположение, что синовиальные клетки пациентов с ревматоидным артритом обладают реакцией "слабого" роста против IL-6, и что IL-6 таким образом осуществляет функцию ингибитора против роста синовиальных клеток (Clinical Immunology, 22:880-887, 1990). Таким образом, существуют разноречивые сообщения, рассматривающие отношение IL-6 к ревматоидному артриту, и это отношение все еще остается неясным.

Недавно Wendling с сотр. сообщили, что введение антител против IL-6 пациентам с ревматоидным артритом временно облегчает клинические и биологические симптомы, увеличивая также при этом уровень IL-6 в сыворотке (J. Rheumatol. 20:259-262, 1993).

В этих сообщениях не приводится никаких данных о том, ускоряет ли IL-6 рост синовиальных клеток при ревматоидном артрите или он обладает ингибирующим действием, и таким образом все еще неизвестно, оказывает или нет IL-6 непосредственное влияние на синовиальные клетки пациентов с ревматоидным артритом.

Раскрытие сущности изобретения Противовоспалительные стероидные средства, такие как кортикостероиды, применялись в качестве лекарственных средств при ревматоидном артрите, но так как их длительное применение вызывает нежелательные побочные эффекты, такие как поражения кожи и ингибирование функции коркового вещества надпочечника, велись поиски лекарственных средств с меньшим побочным действием.

Целью настоящего изобретения является предоставление нового лечебного средства для лечения ревматоидного артрита, лишенного упомянутых выше недостатков. Более конкретно настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для ингибирования аномального роста синовиальных клеток при ревматоидном артрите, эффективным компонентом которой является антагонист интерлейкина- 6, а также фармацевтическую композицию для лечения ревматоидного артрита, обладающую таким же действием.

Авторы настоящего изобретения провели кропотливые исследования относительно роли IL-6 для синовиальных клеток при ревматоидиом артрите, в ходе которых не обнаружено никакого роста характерных для ревматоидного артрита синовиальных клеток с одним IL-6, и поэтому исследовали фактор, отличный от IL-6, что привело в результате к созданию настоящего изобретения на основе открытия, что хотя один IL-6 почти не обнаруживает влияния на рост синовиальных клеток, сильное влияние на рост синовиальных клеток имеет место в присутствии как IL-6, так и растворимого IL-6R, и, кроме того, что это действие на рост синовиальных клеток подавляется посредством добавления антагониста, который ингибирует активность IL-6, такого как IL-6 антитело или IL-6R антитело.

Иными словами, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения хронического ревматоидного артрита, содержащей антагонист IL-6 в качестве эффективного компонента. Конкретнее настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения ревматоидного артрита, содержащей антагонист IL-6 в качестве эффективного компонента и подавляющей аномальный рост синовиальных клеток. Настоящее изобретение также относится к ингибитору роста синовиальных клеток, эффективным компонентом которого является антагонист IL-6.

Краткое описание рисунков Фиг. 1 представляет собой график, показывающий поглощение ³H-тимидинa в синовиальных клетках в присутствии либо одного IL-6, либо sIL-6, и в присутствии как IL-6, так и sIL- 6R.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий действие антитела к IL-6 или антитела IL-6R (антитела к IL-6R) на поглощение ³Н-тимидина в синовиальных клетках в присутствии как IL-6, так и sIL-6R.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий действие антитела IL-6 или антитела IL-6R на поглощение ³Н-тимидина в синовиальных клетках в присутствии как IL-6, так и slL-6R.

На фиг. 4 приводится график, показывающий подавляющее действие антитела IL-6R на начало заболевания на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита.

На фиг. 5 приводится график, показывающий уровни антител коллагена в сыворотке мышей с индуцированным артритом.

Фиг. 6 представляет фотографическое изображение, полученное при гистопатологическом анализе сустава задней лапы мыши с артритом, вызванным коллагеном. Фотография (а) относится к мыши из группы, которой вводили антитело IL-6-peцептов, a фотография (b) относится к мыши из группы, которой вводили контрольное антитело. В группе, которой вводили антитело IL-6-рецептора, инвазия грануляционной ткани в хрящ и кость (хронический пролиферативный синовит) отчетливо подавляется.

Подробное описание изобретения Фармацевтическая композиция для лечения ревматоидного артрита согласно изобретению представляет собой лекарственное средство, которое при введении пациентам с ревматоидным артритом подавляет рост синовиальных клеток в суставах и обладает смягчающим и лечебным действием на симптомы заболевания.

Антагонист IL-6, используемый согласно изобретению, можно получить из любого источника, если он представляет собой вещество, которое блокирует передачу сигнала IL-6 и ингибирует биологическую активность IL-6. Антагонисты IL-6 включают антитело IL-6, антитело IL-6R, антитело gpl30, модифицированный IL-6, антисмысловой IL-6R и неполные пептиды IL-6R или IL-6R.

Антитело, используемое в качестве антагониста согласно изобретению, такое как антитело IL-6, антитело IL-6R или антитело gp130, может быть любого происхождения или типа (моноклональное, поликлональное), но особенно предпочтительными являются моноклональные антитела, полученные от млекопитающих. Такие антитела связываются с IL-6, IL-6R или gp130, ингибируя связывание между IL-6 и IL-6R или IL- 6R и gp130, и таким образом блокируют сигнальную трансдукцию IL- 6, ингибируя биологическую активность IL-6.

Вид животного для продуцирующих моноклональные антитела клеток особенно не ограничен, пока такое животное представляет собой млекопитающее, и могут использоваться человеческие антитела или антитела, полученные от другого млекопитающего, не являющегося человеком. Моноклональные антитела, полученные от млекопитающего, не являющегося человеком, представляют собой предпочтительно моноклональные антитела, полученные от кроликов или грызунов, поскольку их легче получать. Не существует особых ограничений по виду грызунов, но предпочтительными примерами являются мыши, крысы и хомяки.

Примеры таких антител, которые являются антителами IL-6, включают МН166 (Matasuda et al., Eur, J.Immunol. 18:951-956, 1988) и антитело SK2 (Sato et al. . Journal for the 21st General Meeting of the Japan Immunology Association, 21:116, 1991). Примеры антител к IL-6R включают антитело РМ-1 (Hirata et al. , J.lmmunol. 143:2900-2906, 1989), AUK12-20, AUK64-7 и AUK146-15 (не прошедшая экспертизу заявка на международный патент N ВОИС92-19759). Примером антитела к gp130 является антитело АМ64 (японская не прошедшая экспертизу патентная публикация N 3-219894).

Среди них предпочтительным является антитело PM-1.

Моноклональные антитела могут быть получены следующим способом, который основан на известных приемах. А именно используют IL-6, IL-6R или gp130 в качестве сенсибилизирующего антигена для иммунизации по общепринятому методу, и получающиеся в результате иммуноциты затем сливают с известными родительскими клетками посредством обычного способа слияния клеток, и продуцирующие моноклональные антитела клетки отсортировывают обычным способом скрининга, получая антитела.

Конкретнее моноклональные антитела можно получить следующим способом. Например, если сенсибилизирующим антигеном является человеческий IL-6, антитела получают с использованием генной последовательности для человеческого IL-6, описанной Hirano с сотр. Nature, 324:73, 1986. Генную последовательность человеческого IL-6 вставляют в известную экспрессионную векторную систему и используют для трансформации подходящих клеток-хозяев, после чего нужный белок IL-6 очищают от клеток-хозяев или от культурального супернатанта, и очищенный белок IL-6 затем используют в качестве сенсибилизирующего антигена.

В случае человеческого IL-6R белок IL-6R можно получить таким же способом, какой описан выше для получения человеческого IL-6, с использованием генной последовательности, описанной а заявке на европейский патент N ЕР 325474. Существует два типа IL-6R, один из которых экспрессируется на клеточной мембране, и растворимая форма (sIL- 6R), которая отделена от клеточной мембраны. sIL-6R состоит в основном из внеклеточного домена IL-6R, который присоединен к клеточной мембране, и отличается от мембраносвязанного IL-6R тем, что лишена трансмембранного домена или трансмембранного домена и внутриклеточного домена.

В случае человеческого gp130 этот белок можно получить таким же способом, как для описанного выше человеческого IL-6, с использованием генной последовательности, описанной в заявке на европейский патент N ЕР 411946.

Млекопитающие, иммунизированные сенсибилизирующим антигеном, особо не ограничиваются, но их предпочтительно выбирать, учитывая их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток, и, как правило, можно использовать мышей, крыс, хомяков и кроликов.

Иммунизацию животных сенсибилизирующим антигеном можно осуществлять широко известным способом. Например, общепринятым способом является интраперитонеальная или подкожная инъекция млекопитающим сенсибилизирующего антигена. В частности, сенсибилизирующий антиген разбавляют предпочтительно эквивалентным количеством ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) или фиаиологического раствора, суспендируют и применяют вместе с подходящим количеством обычного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, если это желательно, и затем вводят млекопитающим несколько раз каждые 4-21 дня. Для иммунизации сенсибилизирующим антигеном также можно использовать соответствующий носитель.

После такой иммунизации и подтверждения возросшего сывороточного уровня нужного антитела у млекопитающих берут иммуноциты и используют для слияния клеток, причем особенно предпочтительными иммуноцитами являются селезеночные клетки.

Родительские клетки, используемые для слияния с вышеупомянутыми иммуноцитами, могут представлять собой миеломные клетки млекопитающих, и можно использовать ряд уже широко известных клеточных штаммов, в том числе Р3 (P3x6Aq8.653) (J. Immunol. 123:1548, 1978), p3-UI (Current Topics in Microbiology and lmmunology 81: 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J.lmmunol. 6:511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8:405-415, 1976), SP2/0 (Nature, 276:269- 270, 1978), OF (J. Immunol. Meth. 35:1-21, 1980), S194 (J.Exp. Med. 148:313-323, 1978), R210 (Nature, 277:131-133,1979). Слияние иммуноцитов с миеломными клетками может иметь в основе хорошо известный способ, например способ Мильштейна с сотр. (Milstein et al. Methods Enzymol. 73:3-46, 1981).

Конкретнее вышеупомянутое слияние клеток осуществляют в традиционной питательной культуре в присутствии промотора слияния клеток. Используемый промотор слияния может представлять собой, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или вирус Сендай (HVJ), и, если желательно, также может добавляться такое вспомогательное средство, как диметилсульфоксид, чтобы увеличить эффективность слияния.

Соотношение используемых иммуноцитов и миеломных клеток составляет предпочтительно 1-10-кратное количество иммуноцитов по отношению к миеломным клеткам. Используемая культуральная среда для слияния клеток может представлять собой, например, культуральную среду RPM11640 или культуральную среду МЕМ (минимальная поддерживающая среда), которые являются подходящими для роста штаммов миеломных клеток, или другую обычную культуральную среду, применяемую для культивирования таких клеток, и, кроме того, также можно использовать добавление растворов сывороток, таких как фетальная телячья сыворотка (FCS).

Слияние клеток осуществляют посредством смешения упомянутых ранее количеств иммуноцитов и миеломных клеток в описанной выше культуральной среде, с добавлением раствора ПЭГ, предварительно нагретого до 37^oC, например, с добавлением к культуральной среде ПЭГ со средней молекулярной массой 1000-6000, обычно при концентрации 30-60% (м/о) и последующим перемешиванием с образованием нужных слитых клеток (гибридом). Далее повторяют процедуру постепенного добавления подходящей культуральной среды и центрифугирования, чтобы удалить супернатант, и осуществляют удаление средства для слияния клеток и т.п., что является неблагоприятным для выращивания гибридом.

Подходящие гибридомы отбирают выращиванием в нормальной селективной культуральной среде, такой как культуральная ГАТ-среда (содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимин) Выращивание в культуральной ГАТ-среде продолжают в течение заданного времени, обычно в течение нескольких суток или нескольких недель, достаточных для гибели других, не являющихся гибридомами клеток (неслитых клеток). Затем осуществляют обычное ограниченное разведение, и гибридомы, продуцирующие нужные антитела, "запасают" и моноклонируют.

Из продуцирующих моноклональные антитела гибридом, полученных таким способом, можно получить субкультуры в обычном растворе культуры, и их также можно поместить в жидкий азот для длительного хранения.

Чтобы получить моноклональные антитела из гибридом, последние культивируют обычным способом, после чего извлекают супертант культуры или используют другой способ, при котором гибридомы инъецируют совместимому млекопитающему, выращивают и получают асцитную жидкость. Первый способ подходит для получения высокочистых антител, в то время как последний способ подходит для массового производства антител.

Моноклональные антитела, полученные этими способами, затем можно очистить до высокой степени, используя традиционные способы очистки, такие как высаливание, гель- фильтрация, афинная хроматография или подобные способы очистки.

Моноклональные антитела, полученные таким способом, затем можно проверить на степень чувствительности и чистоты распознавания антигена обычными иммунологическими методами, такими как радиоиммуноанализ (РИА), иммуноферментный анализ (E1А, ЕL1SA), метод флуоресцирующих антител (иммунофлуоресцентный анализ), и подобными методами.

Моноклональные антитела, используемые по настоящему изобретению, не ограничиваются моноклональными антителами, продуцируемыми гибридомами, и могут также представлять собой моноклональные антитела, которые искусственно модифицированы в целях снижения гетероантигенности в отношении людей. Например, можно использовать химерное антитело, которое состоит из вариабельной области моноклонального антитела другого млекопитающего, не являющегося человеком, такого как мышь, и константной области человеческого антитела, и такое химерное антитело можно получить известными способами получения химерных антител, в частности методом генной рекомбинации.

Реконструированные человеческие антитела также могут использоваться по настоящему изобретению. Их получают с использованием определяющей комплементарность области мышиного антитела или антитела другого млекопитающего, не являющегося человеком, для замещения определяющей комплементарность области человеческого антитела, и традиционные методы генной рекомбинации для этого хорошо известны. Один из таких известных методов можно использовать для получения реконструированного человеческого антитела, которое является полезным согласно изобретению. Предпочтительным примером такого реконструированного человеческого антитела является hPM-1 (см. не прошедшую экспертизу заявку на международный патент N WO 92-19759).

При необходимости аминокислоты основной (FR) области вариабельного участка антитела могут замещаться таким образом, что определяющая комплементарность область реконструированного человеческого антитела образует подходящий сайт связывания антитела (Sato et al. Cancer Res.53:851-856, 1993). Кроме того, поставленная выше цель также может быть достигнута путем конструирования гена, кодирующего фрагмент антитела, который связывается с антигеном для ингибирования активности IL-6, такого как Fab или Fv или одноцепочечного Fv(scFv), при этом FvH- и L-цепей связываются через соответствующий линкер, и использования его для экспрессии в соответствующих клетках-хозяевах (см. , например, Bird et al., TIBTECH, 9:132-137,1991; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988).

Модифицированный IL-6, применяемый по настоящему изобретению, может представлять собой IL-6, описанный в Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. 269: 86-93, 1994, или в Savino et al., EMBO J. 13:1357-1367, 1994.

Применяемый модифицированный IL-6 можно получить путем введения мутации, такой как замещение, делеция или вставка, в аминокислотную последовательность IL-6, чтобы сохранить связывающую активность IL-6R, элюминируя в то же время сигнально-трансферную функцию IL-6. Источник IL-6 может происходить от животного любого вида, если он обладает вышеупомянутыми свойствами, но с точки зрения антигенности предпочтительно использовать источник IL-6 человеческого происхождения.

В частности, вторичную структуру аминокислотной последовательности IL-6 можно предсказать с использованием хорошо известной программы молекулярного моделирования, такой как WHATIF (Vreind et al., J.Mol.Graphics, 8:52-56, 1990), с помощью которой также можно оценить влияние мутированных аминокислотных остатков на всю структуру. После определения соответствующих мутированных аминокислотных остатков вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ген человеческого IL-6, используют в качестве матрицы для введения мутации посредством традиционно используемого метода ПЦР (полимеразная цепная реакция), и получают ген, кодирующий модифицированный IL-6. Затем его вводят в подходящий экспрессионный вектор при необходимости и экспрессируют в клетках E.coli или в клетках млекопитающего и затем используют либо целиком в культуральном супернатанте, либо после выделения и очистки обычными способами, и оценивают активность связывания IL-6R и сигнально-трансферную активность нейтрализованного IL-6.

Неполный пептид IL-6 или неполный пептид IL-6R, используемые по настоящему изобретению, могут иметь любую последовательность, пока они связываются с IL-6R или IL-6 соответственно и не обладают активностью трансферной функции IL- 6. Неполные пептиды IL-6 и неполные пептиды IL-6R описаны в публикации патента США N 5210075. Антисмысловой олигонуклеотид IL-6 описан в заявке на патент Японии N 5-300338.

Фармацевтическая композиция для лечения ревматоидного артрита, эффективным компонентом которой является антагонист IL-6, по настоящему изобретению является эффективной для лечения ревматоидного артрита, если она блокирует сигнальную трансдукцию IL-6 и подавляет аномальный рост синовиальных клеток, индуцированный IL-6, который причастен к заболеванию. Пример 1 демонстрирует in vitro, подавляющее рост действие на синовиальные клетки, взятые у пациента с ревматизмом. В примере 2 вводят антитело IL-6-рецептора в мышиную модель артрита, иммунизированную коллагеном типа 11, и соответствующие данные показывают (1) подавление развития артрита - на основании артритного индекса (рис. 4), (2) подавление продуцирования антитела против коллагена типа 11 в крови иммунизированных коллагеном мышей (рис.5) и (3) подавление инвазии грануляционной ткани в хрящ и кость (пролиферативный синовит) в суставах задних лап мышей, использованных в качестве моделей артрита, которым вводили антитело рецептора IL-6 (рис.6).

С учетом вышеупомянутых данных (1) и (2) результаты подтверждают подавляющее действие антитела рецептора IL-6, особенно сначала на развитие артрита у моделей-мышей. Результаты (3) показывают, что инвазия грануляционной ткани в хрящевую и костную ткань подавляется, и это подтверждают результаты, полученные в примере 1 (ингибирование роста синовиальных клеток in vitro).

Экспериментальные результаты (1) и (2) показывают, что фармацевтическая композиция настоящего изобретения для лечения ревматоидного артрита обладает превосходным начальным действием на ревматоидный артрит.

Фармацевтическую композицию настоящего изобретения для лечения ревматоидного артрита вводят предпочтительно парентерально, например, посредством внутривенной, внутримышечной, интраперитонеальной или подкожной инъекции, либо системно, либо местно. Кроме того, композиция может находиться в форме набора лекарственных средств вместе, с по крайней мере, одним типом носителя или разбавителя для лекарственных средств.

Дозировка фармацевтической композиции настоящего изобретения для лечения ревматоидного артрита при введении людям различается в зависимости от паталогического состояния и возраста пациента, и способа введения, и подходящие и соответствующие дозы должны выбираться с учетом этих обстоятельств. В качестве примера можно выбрать максимум 4 раздельные дозы в интервале от 1 до 1000 мг на пациента. Однако фармацевтическая композиция настоящего изобретения для лечения ревматоидиого артрита этими дозировками не ограничена.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения для лечения ревматоидного артрита может быть приготовлена обычными способами. Например, состав для инъекции готовят путем растворения очищенного антагониста IL-6 в таком растворителе, как физиологический раствор или буферный раствор, добавляя затем ингибитор адсорбции, такой как твин 80, желатин, человеческий сывороточный альбумин (HSA) или подобное вещество, и смесь может быть предварительно лиофилизована и использоваться для восстановления раствора. Эксципиент, применяемый для лиофилизации, может представлять собой сахар, спирт, такой, как маннит или глюкоза, или сахарид.

ПРИМЕРЫ Настоящее изобретение теперь будет пояснено подробнее с помощью приведенных ниже примеров, справочных примеров и экспериментальных примеров, причем следует иметь в виду, что эти примеры никоим образом не ограничивают изобретение.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 1 Получение растворимого человеческого IL-6-рецептора Растворимый IL-6R получают (Yasukava et al., J.Biochem. 108:673-676, 1990) методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием плазмиды pBSF2R, 236, содержащей кДНК, кодирующую человеческий IL-6-рецептор (IL-6R), полученный по методу Yamasaki с сотр. (Science, 241:825-828, 1988).

Вышеупомянутую плазмиду pBSF2R.236 переваривают с ферментом рестрикции SphI и получают фрагмент кДНК IL-6R, который затем вставляют в mpl8 (Amersham Со. ). Синтетический олигопраймер ATATTCTCTAGAGAGATTCT, сконструированный для введения стоп-кодона в кДНК IL-6R, используют для введения мутации в кДНК IL-6R с помощью метода ПЦР с использованием системы мутагенеэа Invitro (Amersham Co. ). Эта процедура приводит в результате к введению стоп-кодона в положение аминокислоты 345 с получением кДНК, кодирующей растворимый IL-6R (slL-6R).

Чтобы экспрессировать кДНК sIL-6R в клетках CHO (яичник китайского хомячка), вышеупомянутую кДНК sIL-6R, разрезанную HindIII-Sall, вставляют в плазмиду pECEdhfr (Clauser et al., Cell, 45:721-635, 1986), которая содержит кДНК, кодирующую дигидрофалатредуктазу (dhfr), вставленную в сайт расщепления фермента рестрикции Pvul, и получают экспрессионную плазмиду клеток CHO pECEdhfr344.

Используют 10 мкг плазмиды pECEdhfr 344 для трансфекции клеточной линии dhfr CHO DXB-II (Urland et al.,Proc.Natl.Acad. Ssi.USA 77,4216-4220, 1980) методом преципитации фосфатом кальция (Chen et ai., Mol.Cell.Biol. 7:2745-2751, 1987).

Трансфектированные клетки CHO культивируют в течение 3 недель в безнуклеозидной селективной культуральной среде МЕМ, содержащей 1 мМ глутамина, 10% диализованной фетальной телячьей сыворотки (FCS), 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Отобранные клетки CHO скринируют с помощью метода серийных разбавлений и получают единственную моноклональную клеточную линию CHO. Клон клеток CHO амплифицируют в метотрекстате (МТХ) при концентрации 20 нМ - 200 нМ и получают клеточную линию CHO 5Е27, продуцирующую человеческий sIL-6R.

Клеточную ливню CHO 5Е27 культивируют в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (IMDM, продукт Gibco Co.), содержащей 5% FCS, извлекают культуральный супернатант и измеряют концентрацию sIL-6R в культуральном супернатанте методом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) в соответствии с обычной процедурой.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 2 Получение антитела к человеческому IL-6 Антитело к человеческому IL-6 получают по методу Matsuda с сотр. (Fur. J.Immunol. 18:951-956, 1988).

Мышей BALB/c иммунизируют 10 мкг рекомбинантного IL-6 (Hirano efc al., Immunol. Lett., 17:41,1988) вместе с полным адъювантом Фрейнда и это продолжают осуществлять раз в неделю до тех пор, пока не обнаружат в кровяной сыворотке антитела против IL-6.

Иммуноциты экстрагируют на региональных лимфоузлах и для слияния с линией миеломных клеток P3U1 используют полиэтиленгликоль 1500. Гибридомы отбирают по методу Oi с сотр. (Selective Methods in Cellular lmmunology, W.H. Freeman and Co. , San Francisco, 351, 1980) с использованием культуральной ГАТ-среды и определяют линию гибридом, продуцирующих антитела к человеческому IL-6. Гибридомы, продуцирующие антитела к человеческому IL-6, анализируют на связывание IL-6 описанным ниже способом.

А именно мягкий поливиниловый 96-луночный микропланшет (изделие Dynatech Laboratories, Inc. , Александрия, Виргиния) сенсибилизируют в течение ночи 100 мкл козьего антитела против мышиного Ig (иммуноглобулин) (10 мкл/мл, продукт Cooper Biochemical, Inc>, Malvern, Пенсильвания) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,6) при 4^oС. Затем планшет в течение 2 ч при комнатной температуре обрабатывают ЗФР, содержащим 100 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). После промывания ЗФР в каждую лунку добавляют по 100 мкл гибридомного культурального супернатанта и проводят инкубацию в течение ночи при 4^oC.

Затем планшеты промывают и в каждую лунку добавляют меченный ¹²⁵1 рекомбинантный IL-6 до 2000 имп/мин /0,5 нг/ лунку, и после промывания измеряют радиоактивность каждой лунки счетчиком гамма-квантов (Beckam Gamma 9000, Beckman Instruments, Фуллертон, СА). Из 216 гибридомных клонов 32 являются положительными при анализе связывания IL-6. Из числа этих клонов получают, наконец, стабильный клон МН166.BSF2. Антитело к IL-6 МН166, продуцированное этой гибридомой, имеет субтип IgGlk.

Затем используют мышиную IL-6-зависимую гибридомную клеточную линию МH60.BSF2 (Matsuda et al, Eur. J.lmmunol. 18:1951-956, 1988) для определения нейтрализующей активности антитела МН166 в отношении роста гибридом. Клетки MH60. BSF2 дозируют в количестве 110⁴/200 мкл/лунку, добавляют к ним образец, содержащий антитело МН166, осуществляют культивирование в течение 48 ч и добавляют 15,1 Ки/ммоль ³Н-тимидина (New England Nuclear, Бостон, Миннесота), после чего выращивание продолжают в течение 6 ч.

Клетки помещают на фильтровальную бумагу из стекловолокна и обрабатывают автоматическим харвестером (Labo Mash Science Со., Токио, Япония). В качестве контроля используют кроличье антитело против IL-6. В результате обнаруживается, что антитело МН166 ингибирует поглощение ³Н-тимидина клетками MH60. BSF2 в зависимости от дозы. Это показывает, что антитело МН166 нейтрализует активность IL-6.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 3 Получение антитела к человеческому IL-6-рецептору Антитело против IL-6 МТ18 создают по методу Hirata с сотр. (J.Immunol., 143:2900-2906, 1989), фиксируют на сефарозе 4В (продукт Pharmacia Fine Chemicals, Piscatway, Нью-Джерси), активированной CNBr, по прилагаемым инструкциям, и фиксированный комплекс используют для очистки IL-6R (Yamasaki et al. Science, 241:825-828, 1988).

Линию человеческих миеломных клеток U266 солюбилизируют 1 мМ гидрохлоридом п- парааминофенилметансульфонилхлорида (продукт Wako Chemicals), содержащим 1% дигитонина (продукт Wako Chemicals), 10 мМ триэтаноламина (pH 7,8) и 0,15 М NaCI (дигитониновый буферный раствор), и смешивают с антителом МТ18, фиксированном на гранулах сефарозы 4В. Затем гранулы промывают 6 раз дигитониновым буферным раствором, и получают частично очищенный IL-6 для иммунизации.

Мышей BALB/c иммунизируют 4 раза каждые 10 дней частично очищенным IL-6R, полученным из 310⁹ клеток U266, и затем получают гибридомы обычными способами. Культуральные супернатанты гибридом из рост-положительных лунок проверяют на активность связывания IL-6 следующим способом. После мечения 510⁷ клеток U266 ³⁵S-метионином (2,5 мКи) их солюбилизируют вышеупомянутым дигитониновым буферным раствором. Солюбилизированные клетки U266 смешивают с 0,04 мл антитела МТ18, фиксированного на гранулах сефарозы 4В, и после 6-кратного промывания дигитониновым буферным раствором меченный ³⁵S-метионином IL-6R вымывают 0,25 мл дигитонинового буферного раствора (pH 3,4) и нейтрализуют 0,025 мл 1 М трис (pH 7,4).

Cмешивают 0,05 мл гибридомного культурального супернатанта с 0,01 мл протеин-G- сефарозы (продукт Pharmacia). После промывания сефарозу инкубируют с 0,005 мл раствора меченного 35S IL-6R, полученного ранее. Вещество образовавшегося иммунопреципитата анализируют SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), и проверяют реакцию гибридомных культуральных супернатантов с IL-6R. В результате определяют клон гибридом с положительной реакцией PM-1. Антитело РМ-1 к IL-6R, продуцированное гибридомой РМ-1, имеет субтип IgGLK.

Ингибирующую активность антитела, продуцированного гибридомой РМ-1, против связывания IL-6 с человеческим IL-6 исследуют с использованием линии человеческих миеломных клеток U266. Человеческий рекомбинантный IL-6 получают с E.coli (Hirano et аl., Immunol. Lett., 17:41, 1988) и меченным ¹²⁵1 реактивом Болтона-Хантера (New England Nuclear, Бостон, Миннесота) (Taga et al., J.Exp.Med. 166:967, 1987).

При комнатной температуре в течение одного часа культивируют 410⁵ клеток U266 в присутствии 100-кратного избытка немеченного IL-6 вместе с 70% (о/о) культурального супернатанта гибридомы РМ-1 и 14000 чим (число импульсов в минуту) меченного ¹²⁵1 IL-6. В 300 мкл FCS, помещенные в 400 мкл микрофужную полиэтиленовую пробирку, загружают 70 мкл образца, и после центрифугирования измеряют радиоактивность клеток.

В результате показано, что антитела, продуцированные гибридомой РМ-1, ингибируют связывание IL-6 с IL-6R.

СПРАВОЧНЫЙ ПРИМЕР 4 Получение антитела к мышиному IL-6-рецептору Моноклональные антитела против мышиного IL-6-рецептора получают методом, описанным в заявке на патент Японии N 6-134617.

Следуя методу Saito с сотр. (J. lmmunol., 147, 168-173, 1993), клетки СНО, продуцирующие мышиный растворимый IL-6-рецептор, культивируют в среде FCS, содержащей 10% FCS, и мышиный растворимый IL-6-рецептор очищают от культурального супернатанта с использованием антитела RS12 мышиного растворимого IL-6-рецептора (см. Saito et аl., цит.выше) и иммобилизующей колонки с аффигелем 10 (Biorad).

Смешивают 50 мкг полученного мышиного растворимого IL-6-рецептора с полным адъювантом Фрейнда и инъецируют интраперитонеально крысам Wistar (Nihon Charles River Co.). Через две недели проводят повторные иммунизации с неполным адъювантом Фрейнда. На 45 день крыс убивают, и около 2 х 10⁸ их селезеночных клеток используют для слияния с 1 х 10⁷ мышиных миеломных клеток P3U1 обычным способом с применением 50% ПЭГ1500 (Berlinger Manheim), после чего гибридомы скринируют ГАТ-средой.

После добавления гибридомных культуральных супернатантов в иммунопланшет, сенсибилизированный кроличьим антителом против крысиного IgG(Cappel Co. ), вводят в реакцию мышиный растворимый IL-6-рецептор, и гибридомы, продуцирующие антитела против мышиного растворимого IL-6-рецептора, подвергают скринингу методом ELISA с использованием кроличьего антитела против мышиного IL-6-рецептора и овечьего антикроличьего IgG с меченной щелочной фосфатазой. Гибридомные клоны, в которых подтверждается продуцирование антител, дважды подвергают субскринингу и получают один гибридомный клон. Этот клон называют MR16-1.

Нейтрализующую активность продуцированного этой гибридомой антитела против сигнальной трансдукции мышиного IL-6 исследуют путем введения ³Н-тимидина с использованием клеток MH60.BSF2 (Matsuda et al., J. Immunol. 18, 951-956, 1988). Кле