Арилалкиламины, композиции, способы лечения и диагностики, способы идентификации соединения

Арилалкиламины, композиции, способы лечения и диагностики, способы идентификации соединения

Реферат

 

Соединение, способы и композиции для лечения пациентов, страдающих заболеваниями, которые характеризуются аномальным уровнем одного или более компонентов, активность которых регулируется или подвержена воздействию одного или более Са⁺² рецепторов. Созданы также новые соединения для этих способов и композиций. Способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества молекул, действующих на один или более Са⁺² рецепторов, и обладающих сродством к этим рецепторам или являющихся их антагонистами. Предпочтительно, молекула способна действовать или как вещество, обладающее сродством, или как антагонист на Са⁺² рецепторы одного или более, но не всех типов клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток паращитовидной железы, костных остеокластов, юкстагломерулярных почечных клеток, клеток проксимального поперечного канальца, кератиноцитов, парафолликулярных клеток щитовидной железы и трофобластов плаценты. В композициях настоящего изобретения присутствует также фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение обеспечивает специфичность действия заявленных соединений, композиций, способов на их основе. 7 с. и 58 з.п. ф-лы, 3 табл., 44 фиг.

Молекулы, активные в отношении кальциевого рецептора Родственная заявка Настоящая заявка является продолжающей заявкой, сделанной Nemeth и др., озаглавленной "Молекулы, активные в отношении кальциевого рецептора", зарегистрированной 11 февраля 1992 г., которая, в свою очередь, является продолжающей по отношению к заявке Nemeth и др., озаглавленной "Активаторы кальциевых рецепторов", U.S.Serial N 07/749,451, зарегистрированной 23 августа 1991; обе последние заявки, включая рисунки, целиком включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Область изобретения Настоящее изобретение относится к созданию, разработке, композиции и применению новых кальцимиметических молекул, способных действовать тем же образом, что и внеклеточные ионы кальция действуют на клетки, к кальцилитическим молекулам, которые блокируют активность внеклеточных ионов кальция по отношению к клеткам, и к способам их применения и идентификации.

Предпосылки к созданию изобретения Следующее описание суммируют информацию, относящуюся к настоящему изобретению. Оно не является признанием того, что какая-либо информация, приведенная здесь, является прототипом настоящего изобретения, а также того, что какие-либо публикации, конкретно или косвенным образом упоминаемые здесь, являются его прототипом.

Определенные клетки тела отвечают не только на химические сигналы, но также и на ионы, такие как внеклеточные ионы кальция (Ca²⁺). Изменения концентрации внеклеточного кальция (упоминаемого в настоящем документе как "[Ca²⁺]" изменяет функциональные реакции этих клеток. Одной из таких специализированных клеток является клетка паращитовидной железы, секретирует паратироидный гормон (ПТГ). ПТГ является главным эндокринным фактором, регулирующим гомеостаз Ca²⁺ в крови и внеклеточных жидкостях.

ПТГ, действуя на костные и почечные клетки, повышает уровень Ca²⁺ в крови. Это повышение уровня Ca²⁺ затем действует как сигнал отрицательной обратной связи, подавляя секрецию ПТГ. Эта взаимная связь между уровнем Ca²⁺ и секрецией ПТГ формирует главный механизм, поддерживающий гомеостаз Ca²⁺ в организме.

Внеклеточный Ca²⁺ действует непосредственно на клетки паращитовидной железы, регулируя секрецию ПТГ. Предполагают, что существует поверхностный белок клетки паращитовидной железы, который улавливает изменения концентрации Ca²⁺. Этот белок действует как рецептор для внеклеточного Ca²⁺ (кальциевый рецептор), и предполагают, что он улавливает изменения концентрации Ca²⁺ и инициирует функциональную реакцию клетки, секрецию ПТГ. Роль рецепторов кальция и внеклеточного Ca²⁺ в регуляции внутриклеточного Ca²⁺ и клеточной функции обсуждается в Netneth и др., II Cell Caicium 319,1990; роль рецепторов Ca²⁺ в парафолликулярных и паращитовидных клетках обсуждается в Nemeth, II Cell Calcium 323, 1990; и роль рецепторов Ca²⁺ для костных остеокластов обсуждается у Zaidi, 10 Biscience Reports 493, 1990.

Остальные клетки тела, а именно остеокласты кости, юкстагломерулярные почечные клетки и клетки проксимальных почечных канальцев, кератиноциты эпидермиса, парафолликулярные клетки щитовидной железы и трофобласты плаценты, обладают способностью воспринимать изменения в концентрации Ca²⁺. Предполагают, что рецепторы Ca²⁺ клеточной поверхности также могут присутствовать на этих клетках, сообщая им способность улавливать изменения Ca²⁺ и инициировать или облегчать реакцию на эти изменения.

В клетках паращитовидной железы, парафолликулярных клетках (C-клетках), кератиноцитах, юкстагломерулярных клетках и трофобластах увеличение Ca²⁺ вызывает увеличение внутриклеточной концентрации свободного Ca²⁺ . Такое увеличение может быть вызвано притоком в клетку внеклеточного Ca²⁺ или мобилизацией Ca²⁺ из внутриклеточных органелл. Изменения в концентрации Ca²⁺ без труда можно отследить и определить количественно, используя флюориметрические индикаторы, такие как fura-2 или indo-1 (Molecular Probes, Eugene, OP). Изменение уровня Ca²⁺ обеспечивает анализ для определения способности молекул действовать на рецепторы Ca²⁺ как агонисты или как антагонисты.

В клетках паращитовидной железы повышение концентрации Ca²⁺ снаружи вызывает быстрое и скоротечное повышение концентрации Ca²⁺, за которым следует более низкое и длительное повышение концентрации Ca²⁺. Скоротечное повышение концентрации Ca²⁺ происходит за счет мобилизации внутриклеточного кальция, в то время как более низкое и продолжительное повышение является результатом притока внеклеточного кальция. Мобилизация внутриклеточного кальция сопровождается увеличением образования инозит-1,4,5-трифосфата (ИФ₃) и диацилглицерола, двух биохимических индикаторов, которые связаны с рецепторзависимой мобилизацией внутриклеточного кальция в различных других клетках.

В добавление к Ca²⁺, различные другие двух- и трехвалентные катионы, такие как Mg²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, La³⁺ и Gd³⁺ также вызывают мобилизацию внутриклеточного Ca²⁺, в клетках паращитовидной железы. Mg²⁺ и La³⁺ также увеличивают образование ИФ₃; все эти неорганические катионы подавляют секрецию ПТГ. Следовательно, эти рецепторы, постулированные как кальциевые, являются смешанными, поскольку они улавливают целый ряд внеклеточных двух- и трехвалентных катионов.

Способность ряда соединений имитировать внеклеточный кальций in vitro обсуждается в Nemeth и др. , (спермин и спермидин). ''Белки, связывающие кальций, в норме и патологии", 1987, Academic Press, Inc., стр. 33-35; Brown и др. , (например, неомицин) 128 Endocrinology 3047, 1991; Chen и др., (дилтиазем и его аналог, ТА-3090) 5 J. Bone and Mineral Res., 581, 1990; и Zaidi и др., (верапамил) 167 Biochem, Biophys. Res. Comm. 807, 1990.

Brown и др. , 6 J.Bone and Mineral Res.II, 1991 обсуждают существующие теории, касающиеся действия ионов Ca²⁺ на клетки паращитовидной железы, и предполагают, что результаты могут быть объяснены как рецепторподобным механизмом, так и рецепторнезависимым механизмом: Поливалентные катионы (например, двух- и трехвалентные катионы) оказывают многостороннее влияние на функцию паращитовидной железы, такое как подавление секреции паратироидного гормона (ПТГ) и аккумуляции цАМФ, стимуляция накопления инозитфосфатов и подъем цитозольной концентрации кальция. Полагают, что эти действия опосредуются рецепторподобным механизмом. Подавление аккумуляции цАМФ, стимулированной агонистами, двух- и трехвалентными катионами, например, блокируется вслед за преинкубацией с коклюшным токсином. Так, предполагаемый рецептор поливалентного катиона может быть связан с ингибированием аденилциклазы ингибирующим гуаниловым нуклеотидом регуляторного (G) белка, G_i.

Недавно мы показали, что поликатионный антибиотик, неомицин, имитирует действие двух- и трехвалентных катионов на некоторые стороны функции паращитовидной железы. Для того, чтобы определить, было ли это действие специфичным для данного агента или представляло собой более общее действие поликатионов, мы испытывали действие высокоосновных пептидов, полиаргинина и полилизина, а также протамина, на те же параметры диспергированных клеток паращитовидной железы крупного рогатого скота. Результаты показали, что клетка паращитовидной железы реагирует на ряд поликатионов, а также поливалентных катионов, возможно, посредством сходных биохимических путей. Эти результаты обсуждены с точки зрения недавно постулированной "рецепторнезависимой" модуляции G белков поликатионами в других системах.

Считалось доказанным, что рецепторы Ca²⁺ аналогичны другим связанным с G белками рецепторам (например, гликопротеин), однако недавние исследования с клетками других видов подняли вопрос о возможности того, что поликатионы могут модулировать функцию клетки с помощью альтернативного или дополнительного механизма. В маст-клетках (mast), например, ряд амфипатических катионов, включая мастопаран, пептид из яда осы, 48/80, синтетический поликатион, полилизин усиливают секрецию посредством механизма, чувствительного к коклюшному токсину, наводя на мысль о причастности G белка. Не было установлено ни одного классического рецептора поверхности клетки, который мог бы опосредовать действие этих разнообразных агентов. Более того, было показано, что те же соединения непосредственно активировали очищенные G белки в растворе или в искусственных фосфолипидных пузырьках. На основе этих наблюдений предполагают, что амфипатические катионы активируют G белки и, в свою очередь, секрецию маст-клеток посредством "рецепторнезависимого" механизма.

Было также показано, что поликатионы мощно взаимодействуют с кислыми фосфолипидами. Полилизины различной длины цепи (20-1000 аминокислот) связывают искусственные фосфолипидные пузырьки с константой диссоциации в пределах 0,5 нМ-1,5 мкМ. Сродство к связыванию прямо относится к длине цепи полилизина; полимеры в 1000 аминокислот имеют K_d=0,5 нМ, более короткие полимеры имеют более высокие значения K_d, и лизин не взаимодействует в сколько-нибудь значительной степени. Эта связь между активностью и длиной цепи подобна той, которая наблюдается при действии полилизина₁₀₂₀₀ полилизина₃₈₀₀ и лизина на функцию паращитовидной железы.

Возможно, что присоединение поликатионов к биологическим мембранам производит некоторые из этих биологических эффектов. Проницаемость плазматической мембраны, индуцированная в некоторых видах клеток разными порообразующими агентами, включая поликатионы, как предполагают, опосредуется их взаимодействием с фосфатидилсеринподобными структурами. Вдобавок "рецепторнезависимая" активация очищенных G белков амфипатическими катионами усиливается, если эти белки инкорпорированы в фосфолипидные пузырьки.

Ионы кальция в миллимолярных концентрациях также вызывают выраженные изменения в строении мембраны. В некоторых случаях кальций может как противодействовать, так и усиливать действие поликатионов на липиды мембраны. Эти заключения поднимают вопрос о возможности того, что действие как поливалентных катионов, так и поликатионов на клетки паращитовидной железы может вовлекать рецепторнезависимый механизм, не требующий присутствия классического рецептора поверхности клеток, связывающегося с G белком. Дальнейшие исследования, однако, призваны пролить свет на молекулярную основу чувствительности к Ca²⁺ этих и других клеточных типов. Snoback и Chen (6 Приложение 1), J. Bone and Mineral. Res. 1991, 135) и Racke и др., (6 Приложение 1) J.Bone and Mineral Res. 1991, 118) описывают эксперименты, о которых говорят, как об устанавливающих, что в клетках паращитовидной железы присутствуют рецепторы Ca²⁺ или сенсоры Ca²⁺. Транспортную РНК, выделенную из этих клеток, можно экспрессировать в ооцитах, и оказалось, что она снабжает эти ооциты таким фенотипом, который можно объяснить присутствием Ca²⁺ рецепторного белка.

Резюме Заявитель продемонстрировал, что Ca²⁺ рецепторные белки дают возможность определенным специализированным клеткам, вовлеченным в метаболизм Ca²⁺ в организме, улавливать и реагировать на изменения концентрации внеклеточного Ca²⁺. Хотя эти рецепторы обладают определенными общими для них характеристиками, на них можно избирательно воздействовать различными фармакологическими агентами. Как уточнено ниже, определенные молекулы идентифицируются с избирательной активностью рецепторами Ca²⁺ на клетках паращитовидной железы, остеокластах и C-клетках.

Рецепторы Ca²⁺ представляют дискретные молекулярные мишени для нового класса молекул, которые имитируют ("кальцимиметики") или являются антагонистами ("кальцилитики") действие внеклеточного кальция. Такие рецепторы присутствуют на клеточных поверхностях и обладают малым сродством к внеклеточному Ca²⁺ (кажущийся K_d в основном выше чем приблизительно 0,5 мМ). Такие рецепторы могут включать свободный или связанный эффекторный механизм), как определяет Cooper, Bloom и Roth, "The Biochemical Basis of Neuropharmacology", Гл. 4. Следовательно, такие рецепторы отличаются от внутриклеточных рецепторов Ca²⁺, например, калмодулина и тропонинов. Кальцимиметики, например, действуют на рецепторы Ca²⁺ избирательно, прямо или косвенно подавляя функцию клеток паращитовидной железы или остеокластов, или стимулируя функцию C-клеток. Кальцимиметики и кальцилитики настоящего изобретения создают новые лекарственные средства для лечения гиперфункции паращитовидной железы, остеопороза и других связанных с метаболизмом кальция заболеваний. Настоящая заявка касается воздействия на рецепторы Ca²⁺ каждого из этих видов клеток и других видов клеток, которые улавливают и отвечают на изменения концентрации Ca²⁺.

Заявитель впервые продемонстрировал Ca²⁺ рецепторный белок в клетках паращитовидной железы, и дифференцировал фармокологически такие рецепторы Ca²⁺ в других клетках, таких как C-клетки и остеокласты. Заявитель также впервые описал способы, позволяющие идентифицировать молекулы, активные по отношению к этим рецепторам Ca²⁺, и использовать их в качестве основных молекул для открытия, разработки, оформления, модификации и/или конструирования кальцимиметиков или кальцилитиков, активных в отношении рецепторов Ca²⁺. Эти кальцимиметики или кальцилитики полезны для лечения различных болезненных состояний, которые характеризуются аномальными уровнями одного или более компонентов, например, полипептидов, таких как гормоны, энзимы, или факторы роста, экспрессия и/или секреция которых регулируется или подвержена воздействию со стороны активности одного или более рецепторов Ca²⁺. Далее, идентификация различных рецепторов Ca²⁺ в различных видах клеток и специфическая реакция этих рецепторов на различные основные молекулы позволяет синтезировать специфические молекулы, активные при лечении специфических заболеваний, на которые можно влиять путем воздействия на такие специфические рецепторы Ca²⁺. Например, на аномальные уровни секреции паратироидного гормона можно воздействовать такими специфическими молекулами без влияния на уровень секреции других регулируемых Ca²⁺ гормонов и подобных веществ.

Идентификация таких основных молекул затруднялась вследствие отсутствия скрининговой системы с большой пропускной способностью для обнаружения активных молекул, и отсутствия данных о структуре, базируясь на которых можно было обозначать эффективные лекарства-кандидаты. Эти препятствия в настоящее время устранены клонированием Ca²⁺ рецепторов клеток паращитовидной железы и функционально родственных рецепторов, и систематическим изучением строения определенных основных молекул, которые активируют такие клонированные рецепторы Ca²⁺ и функционально родственные рецепторы. Клонирование рецептора Ca²⁺ также облегчает разработку клеточных линий, подвергшихся трансфекции, подходящих для высокоэффективного скрининга натуральных продуктов или синтетических молекул. Это, вместе с изучением строения, обсуждаемым ниже, создает технологию, необходимую для разработки новых кальцимиметиков и кальцилитиков.

Заявитель в настоящей заявке дает возможность для таких методик. Например, кДНК рецептора Ca²⁺ клетки паращитовидной железы может быть клонирована скринингом на функциональную экспрессию в Xenopus ооцитах, а особенности строения органических молекул, необходимых для деятельности рецепторов Ca²⁺, можно определить посредством испытания натуральных продуктов или других молекул и последующего изучения их активности в зависимости от строения.

Так, в первом аспекте, настоящее изобретение обрисовывает фармацевтическую композицию, включающую молекулу, которая как имитирует действие внеклеточного Ca²⁺, вызывая повышение концентрации [Ca²⁺], внутри клетки, так и блокирует повышение концентрации [Ca²⁺], вызванное внеклеточным Ca²⁺. Эта молекула имеет EC₅₀ меньшее или равное 5 мкМ и не является протамином.

Под "имитированием" подразумевается, что молекула обладает одним или более специфических воздействий, свойственным внеклеточному Ca²⁺, на клетки, реагирующие на внеклеточный Ca²⁺. Термин этот не означает, что все биологические функции внеклеточного Ca²⁺ имитируются, а то, что имитируется по крайней мере одна из них. Вдобавок не требуется, чтобы молекула связывалась с тем же участком рецептора, что и внеклеточный Ca²⁺ (см., например, новое соединение NPS 467 и его действие в примере 20 ниже). Под термином "блокирование" подразумевается, что одно такое воздействие Ca²⁺ уменьшается или предотвращается этой молекулой. Величина EC₅₀ может быть определена в исследованиях, как описано ниже, в которых измерялась имитированная активность, а концентрация молекул, при которой имитировалась половина максимального имитирующего эффекта, равнялась EC₅₀. Наоборот, IC₅₀ кальцилитика - это то количество его, которое блокирует половину максимальной активности. Предпочтительно, такие исследования измеряют повышения [Ca²⁺], и являются специфическими для рецепторов Ca²⁺, что подтверждают способы, описанные ниже, или их эквивалент.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, биологически исследования, описанные в настоящем документе, продемонстрировали, что повышение [Ca²⁺] , в клетке является скоротечным, его продолжительность была менее минуты, а скорость проявления этого повышения была высокой, повышение [Ca²⁺] _i наблюдалось через 30 секунд и менее; и молекула также (а) вызывала более продолжительное повышение (больше тридцати секунд) [Ca²⁺]_i; (b) вызывала повышение уровней инозит-1,4,5-трифосфата и/или диацилглицерола, например, менее чем за 60 секунд, и (c) подавляла образование циклического АМФ, стимулированное допамином или изопротеренолом. В добавление, кратковременное повышение [Ca²⁺]_i устраняется предварительной обработкой клеток в течение 10 минут 10 мМ фторидом натрия и уменьшается в результате краткой предварительной обработки (не более 10 минут) клеток активатором протеинкиназы C, например, форбол миристатацетатом (ФМА), мезереином или (-)-индолактамом V.

В случае клеток паращитовидной железы те молекулы, которые оказывались активными по результатам всех анализов, описанных выше, особенно полезны в настоящем изобретении, поскольку они специфичны по своему действию на рецепторы Ca²⁺ этих клеток. Это в особенности относится к эффекту предварительной обработки ФМА, описанному выше.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, клетка является клеткой паращитовидной железы, и молекула подавляет секрецию клеткой паратироидного гормона; и молекула вызывает повышение проводимости Cl^- в ооцитах Xanopus, с внедренной мДНК клетки паращитовидной железы, костного остеокласта, юкстагломерулярной почечной клетки, клетки проксимального почечного канальца, кератиноцита, парафолликулярной клетки щитовидной железы или плацентарного трофобласта.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, молекула вызывает мобилизацию внутриклеточного Ca²⁺, что является причиной повышения [Ca²⁺] _i; клетка является C-клеткой или остеокластом, а молекула ингибирует резорбцию кости in vivo; клетка является остеокластом, а молекула ингибирует резорбцию кости in vitro; или клетка является C-клеткой, а молекула стимулирует секрецию кальцитонина in vitro или in vivo; наиболее предпочтительно, если молекула является как кальцимиметиком, так и кальцилитиком, и имеет величины EC₅₀ или IC₅₀ воздействия на рецепторы Ca²⁺ меньше чем или равные 5 мкМ и даже более предпочтительно менее чем или равные 1 мкМ, 100 нмоляр, 10 нмоляр или 1 нмоляр. Такие более низкие величины EC₅₀ и IC₅₀ более выгодны, поскольку позволяют использовать более низкие концентрации молекул при использовании in vivo или in vitro для лечения или диагностики. Открытие молекул с такими низкими значениями EC₅₀ и IC₅₀ облегчает замысел и синтез столь же патентных и эффективных молекул.

Под молекулой- "кальцимиметиком" подразумевается любая молекула, обладающая одним или более воздействием внеклеточного Ca²⁺ и, предпочтительно, имитирующая действие Ca²⁺ на рецепторы Ca²⁺. Например, при использовании применительно к клеткам паращитовидной железы, эта молекула, которая при испытании на клетках паращитовидной железы in vitro обладала одной или более, а предпочтительно, всеми следующими характеристиками, измеренными с помощью методик, хорошо известных специалистам.

1. Молекула вызывает быстрое (время до пика < 5 сек) и кратковременное повышение [Ca²⁺] _i, которое невосприимчиво к ингибированию 1 мк М La³⁺ или Gd³⁺. Повышение [Ca²⁺]_i сохраняется в отсутствии внеклеточного Ca²⁺, но устраняется предварительной обработкой иономицином (в отсутствии внеклеточного Ca²⁺.

2. Повышение [Ca²⁺]_i, вызванное внеклеточным Ca²⁺, не ингибируется дигидропиридинами.

3. Кратковременное повышение [Ca²⁺]_i, вызванное молекулой, устраняется предварительной обработкой в течение 10 минут 10 мМ фторидом натрия.

4. Кратковременное повышение [Ca²⁺]_i, вызванное молекулой, уменьшается в результате предварительной обработки активатором протеинкиназы C (ПКС), таким как форбол миристатацетат (ФМА), мезереин или (-)-индолактам. Общий эффект активатора протеинкиназы C состоит в том, чтобы сдвинуть кривую ответа на концентрацию молекулы вправо без влияния на максимальный ответ.

5. Молекула вызывает быстрое (< 30 с) повышение образования инозит-1,4,5-трифосфата и/или диацилглицерола; 6. Молекула ингибирует образование циклического АМФ, стимулированное допамином или протеренолом.

7. Молекула ингибирует секрецию ПТГ.

8. Предварительная обработка коклюшным токсином (100 нг/мл в течение 4 ч) блокирует ингибирующее действие молекулы на образование циклического АМФ, но не вызывает повышения [Ca²⁺]_i, инозит-1,4,5-трифосфата или диацилглицерола, и не уменьшает секрецию ПТГ.

9. Молекула вызывает повышение проводимости Cl^- в ооцитах Xenopus, в которые внедрена обогащенная поли(A)⁺ мРНК из клеток паращитовидной железы человека и крупного рогатого скота, но не действует на ооциты Xenopus, в которые вводились вода или мРНК из мозга или печени крысы.

10. Подобно предыдущему пункту, при использовании клонированного рецептора из клеток паращитовидной железы, молекула будет вызывать реакцию ооцитов Xehopus, в которые введены специфические кДНК и мРНК, кодирующие рецептор.

Под молекулой-"кальцилитиком" подразумевается любая молекула, которая блокирует одно или более воздействий внеклеточного Ca²⁺ на клетки, чувствительные к воздействию внеклеточного Ca²⁺, предпочтительно, действуя как антагонист рецептора Ca²⁺. Например, при использовании применительно к клеткам паращитовидной железы, это молекула, которая при испытании на клетках паращитовидной железы in vitro, обладала одной или более, а предпочтительно, всеми следующими характеристиками, измеренными с помощью методик, хорошо известных специалистам: 1. Молекула блокирует, как частично, так и полностью, способность возросших концентраций внеклеточного Ca²⁺: а) повышать [Ca²⁺]_i; б) мобилизовать внутриклеточный Ca²⁺; в) увеличивать образование инозит-1,4,5-трифосфата; г) уменьшать образование циклического АМФ, стимулированное допамином или изопротеренолом; и д) подавлять секрецию ПТГ; 2. При низких концентрациях Ca²⁺, например, 0,5 мМ, сама молекула не изменяет [Ca²⁺]_i; 3. Молекула блокирует проводимость Cl^- в ооцитах Xenopus, в которые введена обогащенная поли(A)⁺ мРНК из клеток паращитовидной железы человека или крупного рогатого скота, вызванную внеклеточным Ca²⁺ или кальцимиметическими соединениями; но не в ооцитах Xenopus, в которые введены вода или мРНК из мозга или печени крысы; 4. Подобно предыдущему пункту, при использовании клонированного рецептора из клеток паращитовидной железы, молекула будет блокировать реакцию ооцитов Xenopus, в которые введены специфические кДНК или мРНК, кодирующие рецептор Ca²⁺ , вызванную внеклеточным Ca²⁺ или кальцимиметическим соединением.

Параллельные определения подходящих кальцимиметиков и кальцилитиков по отношению к рецепторам Ca²⁺ клеток других видов очевидны из примеров, приведенных ниже.

Рецепторы Ca²⁺ способны улавливать и реагировать на определенные неорганические поликатионы или поликатионные органические молекулы. Например, клетка паращитовидной железы не способна различать повышения концентрации внеклеточного Ca²⁺ от добавления этих органических поликатионов, предположительно, потому что эти органические молекулы действуют на рецептор Ca²⁺ точно так же, как внеклеточный Ca²⁺. Кальцимиметические молекулы настоящего изобретения обладают особенно хорошим сродством к рецепторам Ca²⁺ и могут применяться в качестве лекарств, изменяющих отдельные клеточные функции, например, секрецию ПТГ клетками паращитовидной железы. В отличие от Ca²⁺, большинство из этих молекул действуют только на один или больше, но не на все рецепторы Ca²⁺, и, таким образом, обеспечивают способность специфически нацеливаться на один рецептор Ca²⁺.

Эти молекулы также обеспечивают основные структуры для разработки дополнительных новых лекарственных средств, эффективных при лечении различных заболеваний, в которых играют роль Ca²⁺ и [Ca²⁺], таких как гиперфункция паращитовидной железы, остеопороз, деформирующая остеодистрофия, гипертония, почечные болезни и рак.

Кальцимиметики и кальцилитики можно оформить в виде формацевтических композиций, полезных для регулирования уровня внеклеточного свободного Ca²⁺ у пациента и имитирования воздействия внеклеточного Ca²⁺ на клетки из описанной выше группы, путем введения пациенту такой фармацевтической композиции. До момента настоящего изобретения заявителю не были известны подобные молекулы, действующие на рецепторы Ca²⁺ и полезные при лечении заболеваний, вызванных нерегулярностью действия или регуляции рецепторов Ca²⁺ или заболеваний животных, имеющих нормальные рецепторы Ca²⁺, но которые можно лечить активацией или инактивацией таких рецепторов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, молекула имеет величину EC₅₀ меньше или равную 5 мкМ по отношению к одному или более, но не ко всем клеткам из следующей группы: клетки паращитовидной железы, остеокласты кости, юкстагломерулярные почечные клетки, клетки проксимальных почечных канальцев, кератиноциты, парафолликулярные клетки щитовидной железы (C-клетки) и плацентарные трофобласты.

Особенное преимущество настоящего изобретения заключается в специфичности действия таких молекул, поскольку это допускает специфическую in vivo и in vitro терапию и диагностику и открытие дополнительных кальцимиметических и кальцилитических молекул.

В специфических предпочтительных вариантах осуществления изобретения, молекула заряжена положительно при физиологическом уровне pH и избирается из следующей группы: разветвленные или циклические амины, позитивно заряженные полиаминокислоты, и арилалкиламины, например, полиамин с разветвленной цепью имеет формулу H₂N-(CH₂)_j -(NR_i-(CH₂)_j)_k-NH₂, где k - целое число от 1 до 10, каждое j - одно или то же или разное и является целым числом от 2 до 20, каждое R_i - одно и то же или разное и избирается из следующей группы; водород и -(CH₂)_j-NH₂, где j равно описанному выше, и по крайней мере один R_i не является водородом.

В альтернативном варианте осуществления изобретения, молекула имеет формулу где X каждый независимо избирается из следующей группы: H, CH₃, CH₃O, CH₃CH₂O, Br, Cl, F, CF₃, CHF₂, CH₂F, CF₃O, CH₃S, OH, CH₂OH, CONH₂, CN, NO₂ и CH₃CH₂; Ar - гидрофобная форма; каждое R независимо избирается из следующей группы: водород, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, инденил, инданил, дигидроиндолил, тиодигидроиндолил, 2-, 3-, или 4-пиперид(ин)ил; Y избирается из следующей группы; CH, азот и ненасыщенный углеводород; Z избирается из следующей группы: кислород, азот, сера, где каждое n независимо между 1 и 4 включением, а каждое m независимо между 0 и 5 включением. Наиболее предпочтительна молекула, которая является и кальцимиметиком и кальцилитиком.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, гидрофобная форма избирается из следующей группы: фенил, 2-, 3-, или 4-пиридил, 1- или 2-нафтил, 1- или 2-хинолинил, 2- или 3-индолил, бензил, и фенокси; молекула является производным от R-дифенилпропил- - этоксифениламина молекула имеет формулу: с каждым X, предпочтительно, независимо избираемым из следующей группы: Cl, F, CF₃, CH₃ и CH₃O.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, новые аналоги фенил- - этоксифениламина и их производные имеют следующую формулу: где alk является алкиленом с прямой или разветвленной цепью из от 1 до 6 атомов углерода; R₁ - низший алкил от 1 до 3 атомов углерода или низший галоалкил из от 1 до 3 атомов углерода, замещенных от 1 до 7 атомами галогенов; R₂ и R₃ - независимо избираемые карбоциклический арил- или циклоалкильные группы, как моноциклические, так и бициклические, C 5 или 6 кольцами, факультативно замещенными 1 - 5 заместителями, независимо избираемыми из следующей группы: низший алкил из от 1 до 3 атомов углерода, замещенных от 1 до 7 атомами галогенов; низший алкокси из от 1 до 3 атомов углерода; галоген; нитрогруппа; аминогруппа; алкиламиногруппа; амидогруппа; низший алкиламиногруппа из от 1 до 3 атомов углерода; цианогруппа; гидроксильная группа; ацил из от 2 до 4 атомов углерода; низший гидроксиалкил из от 1 до 3 атомов углерода или низший тиоалкил из от 1 до 3 атомов углерода. Подходящими карбоциклическими арильными группами являются группы с 1 или 2 кольцами, из которых по крайней мере одно имеет ароматический характер, и включают карбоциклические арильные группы, такие как фенил и бициклические карбоциклические арильные группы, такие как нафтил. Из приведенной выше формулы очевидно, что заключенные в ней соединения могут существовать в качестве рацемических смесей и в виде индивидуальных стереоизомеров. Особенно предпочтительными являются производные R-фенилпропил- - этоксифениламина, которые, как полагают, проявляют усиленную активность в понижении содержания ионизированного кальция в сыворотке крови.

Предпочтительными соединениями являются те, которые включают в качестве "alk" n-пропилен. Также предпочтительны соединения, в которых R₁ является метилом. Также предпочтительны такие соединения, в которых R₂ и R₃ являются факультативно замещенным фенилом.

Особенно предпочтительными являются соединения, в которых R₂ является однозамещенным фенилом, более предпочтительно - метазамещенным. Особенно предпочтительные R₃ группы включают незамещенный или однозамещенный фенил, особенно орто-замещенный. Предпочтительные заместители для R₂ включают галоген, галоалкил, предпочтительно, тригалометил, и алкокси, предпочтительно, метокси. Предпочтительные заместители для R₃ включают галоген.

В другом аспекте, настоящее изобретение представляет способ лечения пациентов с заболеванием или состоянием, которые характеризуются аномальной [Ca²⁺] или [Ca²⁺] _i в одном или более видах клеток или в крови, плазме или внеклеточных жидкостях. Способ включает этап введения пациенту терапевтически эффективного количества молекул, которые как имитируют активность внеклеточного Ca²⁺, вызывая повышение [Ca²⁺]_i в клетке, так и блокируют повышение [Ca²⁺]_i, вызванное внеклеточным Ca²⁺.

Под "аномальным" подразумевается пациент, имеющий, по сравнению с основной популяцией, отличающийся метаболизм Ca²⁺, на который оказывают воздействие один или более белков (например, гормоны) крови или внеклеточных жидкостей организма, или другие молекулы, которые влияют на уровень внеклеточного и/или внутриклеточного Ca²⁺. Так, эти заболевания включают гиперфункцию паращитовидной железы, остеопороз, другие костные и связанные с неорганическими веществами нарушения (как описано, например, в стандартных медицинских учебниках, таких как "Harrison's Principles of Internal Medicine"). Согласно настоящему изобретению, подобные заболевания лечат с помощью молекул, которые имитируют или блокируют одно или более воздействий Ca²⁺ и, таким образом, непосредственно или косвенно воздействуют на уровне белков или других молекул в организме пациента.

Под "терапевтически эффективным количеством" подразумевается количество, которое до некоторой степени облегчает один или более симптомов заболевания или состояния пациента. Дополнительно под "терапевтически эффективным количеством" подразумевается количество, которое возвращает к норме, как частично, так и полностью, физиологические или биохимические параметры, связанные или вызвавшие заболевание или состояние. В общем, количество составляет между приблизительно 1 нмоль и 1 мкмоль молекул, в зависимости от ее EC₅₀, самого заболевания, его тяжести и возраста пациента, В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, молекулы имеют EC₅₀ менее, чем или равное 5 мкМ и не являются протамином; и, наиболее предпочтительно, взаимодействуют с рецептором Ca²⁺ как кальцилитик или кальцимиметик. Наиболее предпочтительно, если молекула избирается из описанных выше.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, у пациента наблюдается заболевание, которое характеризуется аномальным уровнем одного или более компонентов, чей уровень регулируется или подвержен влиянию активности одного или более рецепторов Ca²⁺, и молекула является активной по отношению к рецептору Ca²⁺ клетки из следующей группы: клетки паращитовидной железы, остеокласты кости, юкстагломерулярные почечные клетки, клетки проксимального почечного канальца, кератиноциты, парафолликулярные клетки щитовидной железы и трофобласты плаценты.

В еще некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, молекула снижает уровень паратироидного гормона в сыворотке крови пациента, например, до уровня, существующего у здоровых людей, или до степени, достаточной, чтобы вызвать снижение Ca²⁺ в плазме; и молекула вводится в количествах, достаточных для оказания уместного терапевтического эффекта на пациента.

В третьем аспекте, настоящее изобретение представляет способ диагно