Способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала и рекомбинантная двухцепочечная днк-молекула

Способ получения генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала и рекомбинантная двухцепочечная днк-молекула

Реферат

 

Способ и генный продукт могут быть использованы для селекции растений. За счет введения рекомбинантной двухцепочечной ДНК-молекулы в геном растения в нем продуцируется повышенное количество крахмала. 2 с. и 18 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл.

Настоящая заявка является частичным продолжением находящейся на рассмотрении заявки на патент США N 07/539763, поданной 18 июня 1990 г. и озаглавленной "Повышенное содержание крахмала в растениях".

Последние успехи генной инженерии позволили создать необходимый инструмент трансформации растений с введением в них чужеродных генов. В настоящее время можно создавать растения, обладающие характеристиками, имеющими важное значение с точки зрения агрономии и обработки урожая. Несомненно, одной из таких важных характеристик является повышенное содержание крахмала и его качество в различных культурных растениях.

Крахмал является полисахаридом, в основном состоящим из звеньев глюкозы, соединенных альфа-1-4- и альфа-1-6-связями. В растительных клетках крахмал находится в виде не растворимых в воде зерен или гранул. В ходе фотосинтеза крахмал образуется и хранится в хлоропластах. Кроме того, крахмал синтезируется в корнях и органах хранения, таких как клубни и семена. В таких не образуемых фотосинтезом тканях крахмал находится в виде пластидов, называемых амилопластами. Как и в хлоропластах, крахмал в амилопластах хранится в виде гранул крахмала. Размер гранул меняется в зависимости от вида растения.

Реально крахмал состоит из амилозы и амилопектина - двух различных полимеров глюкозы. Амилоза в основном состоит из соединенных альфа-1-4-связями линейных цепей молекул глюкозы. В среднем амилоза обладает цепью протяженностью примерно в 1000 молекул глюкозы. Амилопектин характеризуется более короткими цепями, связанными друг с другом альфа-1-6-связями. В среднем амилопектин обладает цепью протяженностью в 20-25 молекул глюкозы.

До недавнего времени в литературе спорным моментом считался субстрат для синтеза крахмала (АДФ-глюкоза или УДФ-глюкоза). Но с выделением мутантов Arabidopsis, не имеющих АДФ-глюкоза-фосфорилазы, признано, что растениями для синтеза крахмала в качестве субстрата используется АДФ-глюкоза. Существуют три этапа синтеза крахмала, и все эти реакции происходят в пределах хлоропластов или амилопластов. На первом этапе из глюкоза-1-фосфата и АТФ под воздействием пирофосфорилазы (EC 2.7.7.27) образуется АДФ-глюкоза. На втором этапе АДФ-глюкоза используется крахмал-синтетазой (EC 2.4.1.21) для образования линейных цепей крахмала, имеющих - 1-4-связи. На третьем этапе изомеризующий фермент-(ы) (EC 2.4.1.18) вводит альфа-1-6-связи с образованием молекулы амилопектина.

Основной спор возникал вокруг регулирующего этапа синтеза крахмала в растениях. Хотя в качестве регулирующего этапа биосинтеза крахмала предложен синтез АДФ-глюкозы под действием АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы, доказано это не было. Так, в заявке на Европейский патент с N публикации 0368506 A2, относящейся к АДФ-глюкоза-пирофосфорилазе, рассматривается роль этого фермента в качестве фактора, лимитирующего скорость биосинтеза крахмала. Доводом против АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы в качестве регулирующего фермента могут служить результаты, полученные с мутантом Arabidopsis (Lin, 1988 a, b). Найдено, что данный мутант (TL 46) содержит всего лишь 5% активной АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы по сравнению с растениями дикого типа. Однако TL 46 растения продуцируют примерно 40% крахмала от уровня растений дикого типа. Если бы АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза была лимитирующим скорость ферментом, в этом случае следовало бы ожидать 95%-ного снижения ферментивной активности для создания понижения в накоплении крахмала в более чем 60%. Аналогично определения in vitro для поддающихся извлечению носителей активности предполагают, что указанный фермент может лимитировать скорость только в случае, если его активность in vivo существенно ингибируется аллостерическими регуляторами ферментивной активности.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящим изобретением даются структуральные ДНК конструкты, кодирующие фермент АДФ-глюкоза-пирофосфорилазу (АДФГПФ) и применимые для создания в растениях повышенного содержания крахмала. Кроме того показано, что ферментивная активность в растительных клетках и тканях является регулирующим фактором биосинтеза крахмала.

В дополнение вышеуказанному одним из аспектов настоящего изобретения дается способ создания генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала, включающий стадии: (a) введения в геном растительной клетки рекомбинантной двуспиральной молекулы ДНК, состоящей из (I) промотора, действие которого в растениях вызывает продуцирование в целевых растительных тканях РНК последовательности, (II) структуральной ДНК последовательности, вызывающей продуцирование РНК последовательности, кодирующей слитый полипептид, состоящий из аминоконцевого пластидного транзитного пептида и фермента АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы, (III) 3'-нетрансляционный ДНК последовательности, действие которой в растительных клетках вызывает прекращение транскрипции и присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу РНК последовательности; (b) получения трансформированных растительных клеток; (c) регенерации из трансформированных растительных клеток генетически трансформированных растений с повышенным содержанием крахмала.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения дается молекула рекомбинантной двуспиральной ДНК, включающей в своей последовательности: (a) промотор, действие которого в растениях вызывает продуцирование в целевых тканях растения РНК последовательности; (b) структурную ДНК последовательность, вызывающую продуцирование РНК последовательности, кодирующей слитый полипептид, состоящий из аминоконцевого пластидного транзитного пептида и фермента АДФ-глюкоза-профосфорилазы; (c) 3'-нетрансляционной области, действие которой в растительных клетках вызывает прекращение транскрипции и присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу РНК последовательности, причем промотор гетерологичен по отношению к структуральной ДНК.

Кроме того, согласно еще одному аспекту настоящего изобретения даются бактериальные и трансформированные растительные клетки, содержащие соответственно ДНК, состоящую из вышеупомянутых элементов (a), (b) и (c).

И еще одним аспектом настоящего изобретения даются дифференцированные растения с повышенным содержанием крахмала.

Краткие пояснения к диаграммам На фиг. 1 приведена нуклеотидная последовательность (Послед. N 1) и соответствующая аминокислотная последовательность (Послед. N 2) для гена АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы (gIgC) из E. coli.

На фиг. 2 приведена нуклеотидная последовательность (Послед. N 3) и соответствующая аминокислотная последовательность (Послед. N 4) для мутантного гена АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы (gIgC16) из E. coli.

На фиг. 3 приведена нуклеотидная последовательность (Послед. N 5) и соответствующая аминокислотная последовательность (Послед. N 6) для модифицированного хлоропласного транзитного пептида из ssRUBISCO 1A гена из Arabidopsis thaliana.

На фиг. 4 показана плазмидная карта для вектора pMON530 трансформации растений.

На фиг. 5 приведена нуклеотидная последовательность (Послед. N 7) и соответствующая аминокислотная последовательность (Послед. N 8) готовой небольшой субъединицы АДФ-глюкоза-фосфорилазы гена картофеля.

На фиг. 6 приведена почти полная протяженность нуклеотидной последовательности (Послед. N 9) и соответствующей аминокислотной последовательности (Послед. N 10) почти полной большой субъединицы АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы гена картофеля.

На фиг. 7 показана плазмидная карта вектора pMON20113 трансформации растений.

На фиг. 8 показана плазмидная карта вектора pMON16938 трансформации растений.

На фиг. 9 показана плазмидная карта вектора pMON977 трансформации растений.

На фиг. 10 показана плазмидная карта вектора pMON6950 трансформации растений.

На фиг. 11 показана плазмидная карта вектора pMON10098 трансформации растений.

Подробное описание изобретения Экспрессия растительного гена, существующего в виде двуспиральной ДНК, включает транскрипцию матричной РНК (мРНК) из одной из спиралей ДНК при участии фермента РНК-полимеразы и последующую обработку внутри ядра первичного продукта транскрипции мРНК. Такая обработка включает участие 3'-нетрансляционной области, присоединяющей полиаденилированные нуклеотиды к 3'-концу РНК.

Транскрипция ДНК в РНК регулируется областью ДНК, обычно называемой "промотором". Область промотора содержит последовательность оснований, сигнализирующих РНК-полимеразе о связывании с ДНК и об инициации транскрипции мРНК с использованием одной из спиралей ДНК в качестве матрицы для получения соответствующей комплементарной нити РНК.

В литературе описано множество промоторов, проявляющих активность в растительных клетках, в том числе: нопалин-синтетаза (NOS) и октопин-синтетаза (OCS) промотооры (находятся на индуцирующих опухоль плазмидах из Agrobacterium timefaciens, колимовирусные промоторы, такие как: 19S и 35S-промоторы мозаичного вируса цветной капусты (CaMV) и 35S-промоторы мозаичного вируса коричника, световозбуждаемый промотор из малой субъединицы рибулоза-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (ssRUBISCO, очень распространенный растительный полипептид), промотор гена a/b связывания белка в хлорофиле и т.д. Все указанные промоторы были использованы для создания ДНК конструктов различного типа, экспрессированных затем в растениях (см., напр., PCT публикацию WO 84/02913 (Rogers и др., Монсанто).

Промоторы, для которых известна или обнаружена способность вызывать транскрипцию РНК в клетках растений, могут быть использованы и в настоящем изобретении. Такие промоторы могут быть получены из различных источников, таких как растения и вирусы растений, в том числе, но без ограничения только ими, усиленный CaMV 35S-промотор и промоторы, в выделенные из генов растения, например генов ssRUBISCO. Как показано ниже, рекомендуется, чтобы конкретный выбранный промотор был способен вызывать достаточную экспрессию с продуцированием в результате эффективного количества фермента АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы, вызывающего необходимое повышение содержания крахмала. Кроме того, рекомендуется проводить экспрессию АДФГПФ гена в специфичных тканях растения, таких как листья, корни, клубни, семена, плоды и т.п., и выбранный промотор должен обладать необходимой тканевой и ростовой специфичностью. Для специалиста очевидно, что количество АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы, необходимое для индуцирования целевого повышения содержания крахмала, может меняться в зависимости от типа растения, более того, слишком высокая активность АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы может оказать нежелательное воздействие на растение. Таким образом, действие промотора следует оптимизировать путем подбора промотора с необходимой экспрессионной способностью в тканях и регулированием силы промотора, а также путем подбора трансформанта, создающего необходимую активность АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы в целевых тканях. Подобный подбор в смеси трансформантов, как правило, применяют при экспрессии гетерологичных структуральных генов в растениях, поскольку при этом между трансформантами с одинаковым гетерологичным геном существуют отличия, вызванные различными сайтами внедрения гена в геном растения (обычно называемые "эффектом положения").

Рекомендуется, чтобы промоторы, применяемые в двуспиральной молекуле ДНК настоящего изобретения, обладали сравнительно высокой экспрессирующей способностью в тканях, в которых желателен высокий уровень крахмала, например: клубнях картофеля и плодах томата. Для картофеля особенно рекомендуемым в этом смысле промотором является пататин-промотор, более подробно описанный в прилагаемых примерах. Экспрессия молекулы двуспиральной ДНК настоящего изобретения под действием выбранного промотора во всех или в большинстве тканях растения вряд ли желательна, а в некоторых случаях может оказать нежелательное воздействие на рост растения.

Пататин-промотор класса I, используемый в данном исследовании для экспрессирования E.coli АДФГПФ, как показано, обладает как высокой активностью, так и специфичностью к клубням (Bevan и др., 1986; Jefferson и др., 1990). Известны и другие гены, характеризующиеся специфичностью к клубням или повышенной экспрессирующей способностью, в том числе: гены АДФГПФ клубней картофеля (Muller и др., 1990), сахароза-синтетаза (Salanoubut и Belliard 1987, 1989), основные белки клубней, включая белковые комплексы в 22 к.о. и ингибиторы протеиназы (Hannapel, 1990), и другие палатины класса I и II (Rocha-Sosa и др., 1989; Mignery и др., 1988).

Помимо эндогенных растительных АДФ-глюкоза-пирофосфорилазных промоторов для экспрессирования гена АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы в специфичных тканях, таких как: листья, семена или плоды могут быть также использованы и другие промоторы. -Конглицинин (известные также, как 7 белков) являются одним из основных хранящихся в сое (Glycine max) (Tierney, 1987). Промотор для -конглицинина может быть использован для сверхэкспрессии E.coli или любого другого АДФ-глюкоза-пирофосфорилазного гена со специфичностью к семенам, что могло бы привести к повышению содержания крахмала в семенах. -Субъединица -конглицинина была экспрессирована с помощью его эндогенного промотора в семенах трансгенных петуний и табака, при этом показано, что промотор действует в других растениях специфичных к семенам образом (Bray, 1987).

Зеины образуют группы белков, откладываемых в эндосперме кукурузы. Выделены геномные клоны для генов зеина (Pedersen 1982) и промоторы из этих клонов могут быть также использованы для экспрессирования АДФ-глюкоза-пирофосфорилазного гена в семенах кукурузы и других растений.

Содержание крахмала в плодах томата может быть повышено экспрессированием гена АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы и без помощи специфичного к плодам промотора. Промотор из 2А11 геномного клона (Pear, 1989) или Е8-промотор (Deikman, 1988) могли бы экспрессировать АДФ-глюкоза-пирофосфорилазу в плодах томата. Кроме того, выделены новые специфичные к плодам промоторы, характеризующиеся высокой и специфичной экспрессией в ходе созревания плодов томата. Для идентификации приемлемых кДНК клонов, специфично экспрессируемых в зеленых плодах, применен дифференцированный отбор с помощью кДНК библиотеки плодов томата. Использовались кДНК зонды, приготовленные из мРНК, выделенной из плодов на раннем и позднем этапах созревания плодов, из объединенной ткани лист-стебель и из корневой ткани томата. Идентифицированы клоны, обильно экспрессируемые в зеленых плодах и не показавшие поддающейся обнаружению экспрессии в листьях. Геномный саузерн-анализ показал небольшое число (1-2) копий гена. Затем отбором банка геномных клонов томата выделены промоторы для таких кДНК клонов. Характер экспрессии этих промоторов подтвержден слиянием с геном -глюкоуронидазы (COS) и последующей экспрессией GUS фермента в трансгенных плодах в ходе их созревания. Промоторы, характеризующиеся экспрессией в большей части клеток плодов, затем подвергают слиянию с ХТП-gIgC16 и другими gIgC аллелями или АДФГПФ генами, происходящими либо из водорослей, либо из растений.

Содержание крахмала в корневой ткани может быть повышено экспрессированием гена АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы вслед за специфичным к корням промотором. Промотор из гена кислотной хитиназы (Samac и др., 1990) мог бы экспрессировать АДФ-глюкоза-пирофосфорилазу в корневых тканях. Экспрессия в корневых тканях может быть также осуществлена использованием идентифицированных специфичных к корням субдоменов CamV35S-промотора (Benfey и др., 1989). Содержание крахмала в тканях листьев может быть повышено экспрессированием гена АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы (напр., gIgC гена) с помощью активного в лиcтьях промотора, такого как ssRUBISCO - промотора или промотора гена а/о связывания белка в хлорофилле.

РНК, продуцируемая ДНК конструктом настоящего изобретения, содержит также 5'-нетрансляционную лидерную последовательность. Такая последовательность может быть получена из промотора, выбранного для экспрессии гена, и может быть специфично модифицирована так, чтобы повысить трансляцию мРНК. 5'-нетрансляционные области могут быть также получены из вирусных РНК, из приемлемых эукариотных генов или из синтетических генных последовательностей. Настоящее изобретение не ограничено конструктами, представленными последующими примерами, в которых нетрансляционная область происходит из 5'-нетрансляционной последовательности, сопутствующей последовательности промотора. Более того, нетрансляционная лидирующая последовательность, как показано выше, может происходить из чужого промотора или кодирующей последовательности.

ДНК конструкты настоящего изобретения, кроме того, содержат структуральную кодирующую последовательность в виде двуспиральной ДНК, кодирующую слитый полипептид, состоящий из аминоконцевого пластидного транзитного пептида и фермента АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы. Рекомендуется, чтобы применяемый в настоящем изобретении фермент АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза подвергался сниженному аллостерическому контролю в растениях. Такой нерегулируемый фермент АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза может быть выбран из известных ферментов, проявляющих нерегулируемую ферментивную активность, или может быть продуцирован в результате мутагенеза нативных ферментов АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз из бактерий, водорослей или растений, о чем более подробно речь идет ниже. В отдельных случаях существенные отличия в природе регуляторов, модулирующих активность фермента АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы (АДФГПФ) дикого типа, позволяет использовать и сам ген дикого типа; в этих случаях концентрация регуляторов в органеллах растения будет усиливать проявление значительной ферментивной активности АДФГПФ.

Бактериальные АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза E. coli хорошо охарактеризована, как четко регулируемый фермент. Активатор-фруктоза-1,6-бисфосфат, как показано, активирует фермент путем повышения его V_max и повышением сродства фермента к его субстратам (Preiss, 1966 и Gentner, 1967). Кроме того, фруктоза-1,6-бисфосфат (ФБФ) также модулирует чувствительность фермента к таким ингибиторам, как аденозин-5'-монофосфат (АМФ) и неорганический фосфат (Pi) (Gentner, 1968).

В 1981 г. удалось клонировать ген АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы вместе с геном для гликоген-синтетазы и геном изомеризующего фермента из E.coli K12 (gIgC), и полученная плазмида была названа pOP12 (Okita, 1981). Ген gIgC, последовательность которого установлена в 1983 г. , содержит 1293 п.о. (Послед. N 1) и кодирует 431 аминокислоту (Послед. N 2) с молекулярной массой 48762, приведенную на фиг. 1 (Baecker, 1983).

Ген gIgC создан в результате химического мутагенеза E.coli К12 штамма PA 601 N-метил-N'-нитрозогуанидином (Cattaneo, 1989 и Creuzet-Sigal, 1972). Синтезирующие гликоген мутанты выявлены при окрашивании йодом мутагенизированных колоний. Найдено, что gIgC16 мутант в ходе стационарной фазы накапливает до 48% гликогена по сравнению с 20% гликогена в родоначальном штамме. При сравнении кинетики gIgC16 АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы с исходной обнаружено, что gIgC16 АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза отличается более высоким сродством к АДФ-глюкозе в отсутствии активатора-фруктоза-1,6-бисфосфата (ФБФ), и концентрация ФБФ, необходимая для полумаксимальной активации фермента, в gIgC16 снижена. Ингибирование активности АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы в gIgC16 под действием 5'-аденозинмонофосфата (АМФ) также уменьшено.

Ген gIg C16 клонирован из E.coli K12 618 (Leung, 1986). Получено два клона с противоположной ориентацией. Эти клоны (pEBL 1 и pEBL 3) содержат оба gIgC16 и gIgB (изомеризующий фермент) гена. Обе плазмиды трансформированы в мутантных штаммах E.coli, не обладающих АДФ-глюкоза-пирофосфорилазной активностью. Штамм E. coli K12 G6MD3 не имеет gIg генов, а E.coli B штамм AC7OR1-504 обладает дефективным геном АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы и характеризуется подавленной в пять-семь раз активностью к биосинтезу гликогена. Обе плазмиды (pEBL 1 и pEBL 3) создают в обоих мутантных штаммах АДФ-глюкоза-пирофосфорилазную активность. Клонированная АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза была частично очищена из E.coli штамма AC7ORI, трансформированного плазмидой pEBL 3. Осуществлено кинетическое сравнение этого фермента с частично очищенной АДФ-глюкоза-пирофосфорилазой из исходного мутантного штамма (E.coli K-12 618) и с частично очищенной АДФ-глюкоза-пирофосфорилазной из E.coli K-12 штамма 356, являющегося родоначальным штаммом дикого типа штамма 618. Мутантные и дикого типа ферменты сравнивались с точки зрения уровня их активности и ингибирования. АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза родоначального штамма 356 активировалась фруктоза-1,6-бисфосфатом примерно в 45 раз. Сигмоидальная кривая активации характеризовалась наклоном Хилла в 1,7 и 50%-ная максимальная активация проявлялась при 62 мкМ ФБФ. АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза мутантного штамма 618 более активна в отсутствии ФБФ, и активировалась ФБФ только в 1,8-2 раза. Кривая активации для 618 АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы имеет гиперболический характер с наклоном Хилла в 1, и 50%-ная максимальная стимуляция проявляется при 153,1 мкМ. Фермент, экспрессированный из pEB13 плазмиды, характеризуется теми же ФБФ кинетическими константами, что и АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза из мутантного штамма 618.

В настоящее время ДНК последовательность gIgC16 гена установлена (Послед. N 3) (Kumar, 1989). При рассмотрении фиг. 2 и при сравнении выведенной аминокислотной последовательности gIgC16 (Послед. N4) с неизогенным E. coli K-12 3000 можно отметить два изменения в аминокислотах, а именно: замену Lys 296 на Glu и Gly 336 на Asp.

В E. coli обнаружен и ряд других мутантных АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз. Экспрессия любых таких или других бактериальных АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз дикого типа или мутантов может быть также использована для повышения продуцирования крахмала в растениях.

E. coli K-12 штамм 6041 (gIgC47) накапливает в ходе стационарной фазы примерно такое же количество гликогена, что и штамм 618 (gIgC16). Штамм 6047, как и штамм 618, отличается более высоким кажущимся сродством к ФБФ и большей активностью в отсутствии ФБФ. Однако фермент из штамма 6047, как сообщается, более чувствителен к АМФ по сравнению с ферментом из штамма 618 (Latil-Damotte, 1977).

E. coli B мутант SG5 при сравнении с его родоначальным штаммом характеризуется более высоким сродством к его аллостерическим активаторам и более низким сродством к его аллостирическим ингибиторам (Govons, 1969; Govons, 1973 и Preiss, 1973). Одни только эти изменения делают фермент более активным в физиологических условиях, и это заставляет бактерию накапливать в два-три раза больше гликогена по сравнению с родоначальным штаммом. Мутантная АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза из SG5, как и фермент дикого типа, существует в виде гомотетрамера. В отличие от фермента дикого типа, однако, ФБФ заставляет мутантный фермент образовывать олигомеры большей массы (Carlson, 1976).

АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза из E. coli B мутантного штамма GL 1136-504 также характеризуется более высоким кажущимся сродством к активаторам и более низким кажущимся сродством к ингибиторам (KappeL, 1981 и Preiss, 1973). Указанный мутант по сравнению с E.coli дикого типа накапливает в три-четыре раза больше гликогена. В условиях активации очищенный GL 1136-504 фермент и фермент дикого типа (AC70R1) обладают сравнимыми удельными активностями. Однако в отсутствии каких-либо активаторов GL 1136-504 фермент в отличие от фермента дикого типа высоко активен.

Клонированию и секвенс-анализу подвергнут также gIgC из Salmonella typhimurium LT2 (Leung и Preiss, 1987 a). Ген кодирует 431 аминокислоту с соответствующей молекулярной массой 45580. Ген gIgC из Salmonella typhimurium LT2 и тот же ген из E.coli K-12 обладают 90%-ной идентичностью на уровне аминокислот и 80%-ой идентичностью на уровне ДНК. Как и E.coli АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза, Salmonella typhimurium LT 2 АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза также активируется ФБФ и ингибируется АМФ (Leung и Press, 1987 b). Такая заметная консервативность в аминокислотных последовательностях предполагает, что осуществление мутаций, приводящих к усилению АДФГПФ активности в E.coli, в гене S.typhimurium АДФГПФ должно оказывать аналогичное действие на АДФГПФ фермент этого микроорганизма.

Ряд других бактериальных АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз охарактеризован по их реакции на активаторы и ингибиторы (см. обзор Preiss, 1973). Подобно АДФ-глюкоза-пирофосфорилазе из E.coli АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы из Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Citrobacter freundii и Escherichia aurescens активируются ФБФ и ингибируются АМФ. Однако АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза из Aeromonas formi cans активируется фруктоза-6-фосфатом или ФБФ и ингибируется АДФ. Однако АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза из Serratia marcescens не активируется каким-либо испытанным метаболитом. Фотосинтетическая Rhodospirillum rubrum имеет АДФ-глюкоза-пирофосфорилазу, активируемую пируватом, но не одно из испытанных соединений, в том числе: Pi, АМФ и АДФ не ингибируют фермент. Исследовано несколько АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз из водорослей, регуляция которых, как найдено, аналогична найденной для растительных АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз. Очевидно, АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы многих организмов могут быть использованы для повышения биосинтеза крахмала и его накопления в растениях.

Помимо E.coli и растительных АДФГПФ ферментов другие источники, в их числе (но без ограничения только ими): цианобактерии, водоросли и другие прокариотные и эукариотные клетки могут служить источниками АДФГПФ генов. Например, выделение АДФГПФ генов из Synechocystis и Anabaena может быть осуществлено с помощью олигонуклеотидов, соответствующих сайту активатора АДФГПФ в E.coli (аминокислотные остатки 25-42 на фиг. 1), который в высшей степени консервативен в широком спектре разнообразных видов. Олигонуклеотиды, соответствующие этой области, могли бы облегчить выделение гена при их использовании в качестве зондов геномных библиотек. Или же для амплификации сегментов АДФГПФ гена с помощью 5'-праймеров, соответствующих сайту активатора E.coli, и 3'-праймеров, соответствующих каталитическим сайтам E.coli, например сайту связывания АДФ-глюкозы E.coli, может быть использована PCR реакция (описана в примере 1). Продукты PCR реакции могут быть использованы в качестве зондов геномных библиотек для выделения соответствующего гена полной длины.

Растительные АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы Одно время полагали, что УДФ-глюкоза является первичным субстратом биосинтеза крахмала в растениях. Тем не менее обнаружено, что АДФ-глюкоза - лучший субстрат биосинтеза крахмала, нежели УДФ-глюкоза (Recondo), 1961). В том же сообщении утверждается об обнаруженной в растительном материале АДФ-глюкоза-пирофосфорилазной активности.

Из листьев шпината выделена в частично очищенном состоянии АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза, которая, как показано, активируется 3-фосфоглиуератом (3-ФГА) и ингибируется неорганическими фосфатами (Ghosh и др., 1966). В работе Ghosh и др. предполагается, что биосинтез крахмала в листьях определяется уровнем АДФ-глюкозы. Активатор (3-ФГА) является первичным продуктом фиксации CO₂ в ходе фотосинтеза. При фотосинтезе уровень 3-ФГА должен повышаться с активированием в результате АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы. В то же время уровень Pi будет понижаться вследствие фотофосфорилирования с уменьшением ингибирования АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы. Указанные изменения будут вызывать рост продуцирования АДФ-глюкозы и биосинтеза крахмала. В темноте уровень 3-ФГА будет понижаться, а уровень Pi - повышаться с уменьшением активности АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы и соответственно снижением биосинтеза АДФГ и крахмала (Ghosh, 1966).

Позднее АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза из листьев шпината была очищена до однородного состояния, и было показано содержание в ней двух субъединиц в 51 и 54 кДа (Morell, 1987). На основе антител, созданных к двум субъединицам, выяснено, что белок в 51 кДа характеризуется гомологичностью к АДФ-глюкоза-пирофосфорилазе как из эндоспермы кукурузы, так и из клубней картофеля, но не к белку в 54 кДа из листьев шпината.

Имеются сообщения о последовательности клона субъединицы кДНК АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы из эндоспермы риса (Anderson, 1989 а). Клон кодирует белок из 483 аминокислот. Сравнение белковых последовательностей АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы эндоспермы риса и АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы E.coli показало 30%-ную идентичность. В том же 1989 г. установлена последовательность клона кДНК почти полной длины для АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы эндоспермы пшеницы (Olive, 1989). Клон АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы эндоспермы пшеницы характеризуется примерно 24%-ной идентичностью и белковой последовательностью АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы E.coli, в то время как клоны пшеницы и риса характеризуются 40%-ной идентичностью на белковом уровне.

Дополнительные свидетельства о существовании нерегулярных растительных АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз дикого типа можно найти в работе Olive и др. (Olive, 1989), в которой утверждается, что АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы листьев и эндоспермы пшеницы характеризуются очень разной аллостерической регуляцией. АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы эндоспермы не активируется 3-ФГА и требует в десять раз больше ингибитора (ортофосфата) для достижения 50%-ного ингибирования, чем фермент из листьев.

АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза эндоспермы кукурузы выделена в чистом виде, и, как показано, ее каталитические и регуляторные свойства аналогичны свойствам других растительных АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз (Plaxton, 1987). Молекулярная масса нативного фермента из эндоспермы кукурузы равна 230000, и она состоит из четырех субъединиц одинакового размера.

Молекулярная масса нативной АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы из клубней картофеля согласно сообщениям равна 200000, а размер субъединицы - 50000 (Sowokinos, 1982). Активность АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы клубней почти целиком зависит от 3-ФГА и, как в случае с другими растительными АДФ-глюкоза-пирофосфорилазами, ингибируется Pi. Показано, что АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы клубней и листьев картофеля обладают одинаковыми каталитическими, физическими и аллостерическими свойствами (Anderson, 1989 b).

Продуцирование мутагенезом измененных генов АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы Для специалиста очевидно, что, хотя это и не абсолютно обязательно, повышенные результаты должны быть получены при использовании генов АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы, подвергнутых сниженной аллостерической регуляции ("разрегулированных"), но более предпочтительно, не подвергавшихся существенной аллостерической регуляции ("нерегулированных"), с сохранением адекватной каталитической активности. Структуральная кодирующая последовательность для бактериального или растительного фермента - АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы может быть подвергнута мутагенезу в E.coli или ином приемлемом хозяине и отобрана на повышенное продуцирование гликогена так, как это описано для gIgC16 гена E.coli. Необходимо указать, что применение гена, кодирующего фермент - АДФ-глюкоза-пирофосфорилазу, на который воздействуют только модуляторы (активаторы/ингибиторы), присутствующие в выбранном растении на уровне, существенно не ингибирующие каталитическую активность, не требует модификации фермента (гена). Указанные "нерегулированные" или "разрегулированные" гены затем могут быть введены в растения описанным здесь способом с получением трансгенных растений, характеризующихся повышенным содержанием крахмала.

К примеру, любой ген АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы может быть клонирован в E. coli штамм AC70R1-504 (Leung, 1986). Указанный штамм обладает дефектным геном АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы и дерепрессирован в пять-семь раз относительно других ферментов биосинтеза гликогена. Ген/кДНК АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы может быть встроен в плазмиду E.coli gIgC промотором или любым другим бактериальным промотором. Такой конструкт затем может быть подвергнут сайтнаправленному или ненаправленному мутагенезу. После мутагенеза клетки следует нанести на пластинки со средой, обогащенной 1% глюкозы. После того, как колонии розовьются, пластинки следует омыть раствором йода (0,2 мас.%/об I₂, 0,4 мас.%/об. KI в H₂O, Creuzet-Sigal, 1972). Сравнением с идентичными пластинками, содержащими не подвергавшийся мутации E.coli, колонии, продуцирующие больше гликогена, могут быть выявлены по их более темной окраске.

Поскольку процедура мутагенеза способна привести к мутациям промотора, любые предполагаемые мутантные АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы первого раунда отбора должны бы обладать геном АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы, реклонированным в немутировавший вектор, и полученную плазмиду можно отобрать тем же путем. Мутанты, прошедшие через оба раунда отбора, тем самым пройдут анализ из АДФ-глюкоза-пирофосфорилазную активность в присутствии и в отсутствии активаторов и ингибиторов. Сравнением реакций мутировавших АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз на активаторы и ингибиторы с реакциями немутировавших ферментов можно охарактеризовать новый мутант.

В работе Plaxton и Preiss (1987) показано, что АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза эндоспермы кукурузы обладает регуляторными свойствами двух растительных АДФ-глюкоза-пирофосфорилаз (Plaxton и Preiss, 1987). Авторами показано, что более ранние сообщения, утверждающие, что АДФ-глюкоза-пирофосфорилаза эндоспермы кукурузы обладает повышенной активностью в отсутствии активатора (3-ФГА) и пониженной чувствительностью к ингибитору (Pi), обусловлены протеолитическим расщеплением фермента в ходе выделения. Изменением гена АДФ-глюкоза-пирофосфорилазы с получением фермента, аналогичного протеолитически расщепленной АДФ-глюкоза-пирофосфорилазе эндоспермы кукурузы, достигается сниженная аллостерическая регуляция.

Для анализа жидкой культуры E. coli на АДФ-глюкоза-пирофосфорилазную активность клетки вращают в центрифуге и вновь суспендируют примерно в 2 мл эктракционного буфера (0,05 М глицилглицина с pH 7, 5 мМ ДТЭ, 1 мМ ЭДТК) на грамм клеточной пасты. Клетки подвергают лизису двукратным пропусканием через французский пресс. Клеточный экстракт центрифугируют в микроцентрифуге 5 минут и надосадочную жидкость обессоливают пропусканием через вращающуюся С-50 колонку.

Анализ фермента на синтез АДФ-глюкозы является модификацией опубликованной методики (Haugen, 1976). Каждые 100 мкл образца содержат: 10 мкмолей Гепес-буфера (pH 7,7), 50 мкг АБС, 0,05 мкмоля /¹⁴C/ глюкоза-1-фосфата, 0,15 мкмоля АТФ, 0,5 мкмоля MgCl₂, 0,1 мкг кристаллической дрожжевой неорганической пирофосфатазы, 1 мМ молибдата аммония, фермент, активаторы и ингибиторы по желанию и воду. Образец инкубируют 10 минут при 37^oC и останавливают кипячением 60 секунд. Образец центрифугируют в микроцентрифуге и 40 мкл надосадочной жидкости инъектируют в Синхром Синхропак АХ-100 анионообменную ВЭЖХ колонку. Образец элюируют 65 мМ KPi (pH 5,5). Непрореагировавший /¹⁴C/ глюкоза-1-фосфат элюируется в пределах 7-8 минут, а /¹⁴C/ АДФ-глюкоза элюируется примерно через 13 минут. Активность фермента определяют по величине радиоактивности, обнаруживаемой в пике АДФ-глюкозы.

Ферментивная активность растительной АДФГПФ четко регулируется как положительными (3-фосфоглицерат, 3-ФГА), так и отрицательными) эффекторами (неорганический фосфат, Pi) (Ghosh и Preiss, 1981; Morell и др., 1987; Plaxton и Preiss, 1987; Preiss, 1988; Sowokinos и Preiss, 1988; Copeland и Preiss, 1981) и отношение 3-ФГА: Pi играет заметную роль в регулировании биосинтеза крахмала путем модулирования активности АДФГПФ (Santarius и Heben, 1965; Helodt и др. , 1977; Kaiser и Bassham, 1979). Растительные АДФГПФ ферменты являются гетеротетрамерами двух больших /"сжатых" и двух меньших /"хрупких" субъединиц (Morell и др. , 1987; Lin и др., 1988 a, 1988 b; Krishnan и др., 1986; Okita и др., 1990), и есть сильные основания полагать, что гетеротетрамер является наиболее активной формой АДФГПФ. Подтверждением такому предположению служит выделение растительных "безкрахмальных" мутантов с недостатком какой-либо субъединицы (Tsai и Nelson, 1986; Dikinson и Preiss, 1969; Lin и др., 1988 a, 1988 b), а также характеристика состоящей из небольших субъединиц гомотетрамерной "АДФГПФ", для которой обнаружена всего лишь небольшая ферментивная активность (Lin и др., 1988 b). Кроме того, предложенные взаимодействующие остатки эффектора выявлены для обеих субъединиц (Morell и др.., 1988).

Нерегулированные ферментные варианты растительной АДФПГФ, идентифицированные и охарактеризованные путем, аналогичным тому, который привел к выделению E.coli gIg C16 и родствен