Ковалентное модифицирование полипептидов полиэтиленгликолями

Ковалентное модифицирование полипептидов полиэтиленгликолями

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Соединения, имеющие общую формулу R₁ - X - R₂, где Х - непептидный полимерный спейсер, а R₁ и R₂ - антагонист рецептора интерлейкина-1 или ингибитор ФНО, получают путем взаимодействия R₁ и R₂, содержащих или модифицированных так, что они содержат реакционноспособный цистеин, с непептидным спейсером, способным образовывать тиоэфирные связи. Мутеины получают рекомбинантным путем. Использование соединений позволяет снизить скорость выведения из организма терапевтического агента. 12 с. и 24 з.п. ф-лы, 24 ил., 4 табл.

Изобретение относится к полипептидам, которые ковалентно связаны с длинноцепными полимерами, такими как метоксиполиэтиленгликоль. Это изобретение также описывает способы и реагенты для взаимодействия активированных полимерных молекул с различными биологически важными полипептидами.

Обнаружено, что многие протеины, которые были идентифицированы и выделены из организма человека и животных, обладают многообещающими лекарственными и терапевтическими возможностями. Были сделаны большие успехи в методах идентификации и характеристики таких протеинов, в дополнение к способам получения таких протеинов в относительно чистом виде и в относительно больших количествах. По мере совершенствования методов использования таких потенциально ценных веществ, возникло много препятствий к получению этих соединений в форме, пригодной для использования в клинических моделях.

Например, было обнаружено, что многие такие протеины имеют исключительно короткий период полуведения из сыворотки крови. Большей частью протеины выводятся из сыворотки через почки. Систематическое введение относительно больших количеств протеинов, особенно чужеродных человеку, может вызвать иммуногенные реакции, которые, могут привести к таким проблемам, как быстрое выведение протеинов из организма через образование иммунных комплексов. В случае других протеинов проблемы растворимости и агрегации также мешают оптимальному дозированию протеина.

Одним из наиболее многообещающих способов решения этих проблем является ковалентное присоединение одной или более цепей инертного полимера к нужному полипептиду. Наиболее часто используемым полимером является полиэтиленгликоль (ПЭГ) или монометоксилполиэтиленгликоль (мПЭГ) /1/. ПЭГ является идеальным для этих целей благодаря своей доказанной нетоксичности. Другие исследователи используют для подобных целей полиоксиэтилированный глицерол (ПОГ). /2/.

Описаны многочисленные результаты того, как ковалентное модифицирование протеинов полиэтиленгликолями ("пегилирование") приводило к появлению у протеина желаемых характеристик. Например, было показано, что пэгилирование IL-2 уменьшает выведение IL-2, не влияя существенно на активность цитокина. Сниженное выведение приводит к повышенной эффективности по сравнению с не пегилированным веществом /3/.

Увеличение периода полувыведения перекиси дисмутазы (ПД) из сыворотки крови стало решающим препятствием к использованию ПД для лечения различных симптомов. Большое число исследований показало, что пегилирование ПД приведет к снижению скорости выведения /4/.

Агрегация иммуноглобулина G (IgG) считается фактором, который приводит к серьезным побочным эффектам у пациентов, которым вводили внутривенно IgG. Было показано, что пегилирование IgG снижает агрегацию протеинов, снимая эту проблему /5/.

Была также показана возможность через пегилирование влиять на иммуногенность протеина. Абуховский с сотрудниками изучал иммуногенность и период выведения из крови пегилированной каталазы бычьей печени /6/.

Присоединение ПЭГ-групп к этим разнообразным протеинам замедляет выведение благодаря увеличению размера молекулы пегилированного протеина. Вплоть до определенного размера скорость гломерулярной фильтрации протеинов обратно пропорциональна размеру протеина. Следовательно, способность пегилирования замедлять выведение вызвана, как правило, не тем, как много ПЭГ-групп присоединилось к протеину, а общей молекулярной массой измененного протеина. Это подтверждено исследованиями процесса выведения, в которых варьировали как размер боковых ПЭГ-цепей, так и число ПЭГ цепей, связанных с IL-2. /3/.

Многочисленные исследования процессов выведения, иммуногенности, агрегации и физических свойств пегилированных протеинов указывают на то, что ПЭГ образует гибкую гидрофильную оболочку вокруг протеина. Цепи ПЭГ становятся сильно гидратированными и придают пегилированным протеинам более высокую кажущуюся молекулярную массу, чем можно было ожидать, и экранируют заряды на протеине.

Благодаря многочисленным обнадеживающим результатам, которые были получены в этой области, создан каталог способов присоединения ПЭГ-единиц к полипептидам. Ключевой элемент этих способов заключается в "активации" концевой OH-группы полиэтиленгликоля. Такая активация необходима для того, чтобы образовать связь между ПЭГ-группой и полипептидом. В подавляющем большинстве таких методик активируют ПЭГ-составляющую для того, чтобы сделать возможной реакцию со свободными первичными аминогруппами полипептидов. Большинство этих свободных аминов обнаружено в аминокислотных остатках лизина.

Обычно, к протеинам присоединяют много ПЭГ-цепей. Например, было обнаружено, что для подавления иммуногенности, желательно использовать от 15 до 50 молей полимера на моль полипептида /7/.

Вследствие того, что к каждому полипептиду обычно присоединяют множество ПЭГ-цепей, и поскольку в каждом протеине обычно присутствует большое число остатков лизина, протеины легко пегилировать с получением гомогенных продуктов реакции /8/. Это отсутствие специфичности реакции приводит к многочисленным осложнениям. Среди них - то, что пегилирование часто приводит к значительной потере активности протеина. Предположительно, присоединение к имеющему значение остатку лизина могло бы изменить активный центр протеина, сделав его неактивным.

По крайней мере на одной системе было показано, что пегилирование может привести к возникновению стерических затруднений в активных центрах. Другими словами, относительно малые субстраты могут подойти к протеину, в то время как на активность протеинов, которые реагируют с большими субстратами, может резко повлиять беспорядочное пегилирование /7/. Селективное пегилирование активных центров таких протеинов могло бы привести к модифицированным веществам, приобретающим при пегилировании желаемые качества без потери своей активности. Вдобавок, если пегилированный протеин предназначен для терапевтического использования, то смесь разнообразных по составу протеинов, которая возникает при проведении неспецифического пегилирования, приводит к трудностям в получении продукта с воспроизводимыми и поддающимися определению свойствами. Это чрезвычайно затрудняет оценку лечения и получение информации о дозировке и эффективности.

Обнаружено, что в некоторых случаях введение многомерных комплексов, которые содержат больше чем один биологически активный полипептид или медикамент, может привести к синергическим положительным эффектам. Например, комплекс, содержащий два идентично связанных полипептида, может иметь существенно большее сродство к лиганду или активному центру, которые он связывает, по сравнению с одномерным полипептидом. По этой причине, желательно иметь многомерные комплексы протеинов, чтобы увеличить сродство протеина к этому лиганду в дополнение к увеличению молекулярной массы комплекса.

Протеины часто проявляют свой биологический эффект через взаимодействие с другими протеинами. В тех случаях, когда достаточно простого комплекса двух протеинов, чтобы достигнуть биологического эффекта, оказалось возможным сымитировать физиологическое действие эндогенных протеинов, вводя экзогенные протеины. Однако там, где биологическое воздействие требует составления комплекса, содержащего более чем два протеина, воспроизвести функцию эндогенных протеинов с помощью рекомбинантно полученных экзогенных эквивалентов оказывается более трудным из-за того, что комплексы более высокого порядка часто нестабильны. В таких случаях может быть выгодным использовать сшитые разновидности, содержащие два из компонентов комплекса, чтобы симулировать биологически активный комплекс.

Вслед за описываемым здесь изобретением, по меньшей мере три исследовательские группы сообщили о получении сшитых протеинов, в которых внеклеточные части одного из рецепторов ФНО присоединяют к тяжелой цепи иммуноглобулина IgG человека или мыши, которые затем сшивают дисульфидными связями /9/. В каждом случае, эти протеины экспрессировали в экспрессивных системах животной клетки и, обнаружили, что они являются значительно более эффективными при ингибировании ФНО, чем просто одномерный растворимый рецептор. Аналогичные способы использовали для получения похожих сшитых протеинов из CD4 протеина /10/, CR1 протеина /11/ и CR2 протеина /12/.

Показано, что эти сшитые протеины, построенные из двух полипептидных цепей и части антитела иммуноглобулина IgG, являются перспективными терапевтическими агентами. Сшитые протеины имеют увеличенную молекулярную массу, что способствует снижению скорости выведения комплекса из организма, в дополнение к явному усилению сродства протеинов к их лигандам. Однако протеины, сшитые таким способом, до сих пор были получены только экспрессией в экспрессивных системах животной клетки экспрессией слившихся генов. Это было необходимо для того, чтобы та часть протеина, которую представляет IgG, была правильно упакована после экспрессии. Кроме того, закрепленная тяжелой цепью часть антитела IgG, которая служит связующим звеном - спейсером или линкером - между полипептидными единицами, не позволяет изменить длину, размер и геометрию спейсера. При данном явном синергическом эффекте, достигнутом посредством двумерных протеинов, путем изменения пространственной ориентации полипептидов преимущества синергического эффекта можно, вероятно, оптимизировать. И, наконец, сшитые протеины могут быть антигенными и/или обладать пониженной растворимостью. Тяжелая цепь антител не является биологически инертной.

Описаны другие двумерные или "бивалентные" комплексы. Одна такая группа двумерных соединений названа "гирулоги". Эти соединения включают очень короткие полипептидные единицы, которые соединены коротким полиглициновым спейсером или линкером. Одна из полипептидных единиц представляет собой ингибитор тромбина - последовательность из 5 аминокислот, взятая из протеина гирудина, состоящего из 65 аминокислот - а другая является ингибитором узнавания анион-связывающего экзоцита (АСЭ) /13/.

C-реактивный протеин (CРП) представляет собой протеин острофазной сыворотки, построенный из пяти 23 к a суб-единиц. CРП может вызывать реакции осаждения и агглютинации, а также может взаимодействовать с Clg для активации классического пути комплемента.

С использованием бис(сульфосукцинимидил)субстрата или 3,3-дитио(сульфосукцинимидилпропионат) а в качестве сшивающих агентов, получены сшитые олигомеры CРП /14/.

Исследовано также образование двумерных бивалентных лигандов для конъюгирования опиодных рецепторов. Непептидные фармакофоры - нальтексамин или оксиморфамин были соединены короткими этиленоксидными или глициновыми спейсерами /15/. Тетрапептидные энкефалины, соединенные короткими метиленовыми мостиками, также были предназначены для конъюгирования опиоидных рецепторов и, как было показано, обладали большей селективностью и сродством к дельта рецептору, чем исходный дельта лиганд /16/.

Посредством сшивки через остатки сахаров также был получен в многомерных формах гликопротеин поверхности клетки CD4. В качестве сшивающего агента использовали бисмальимидогексан (БМГ) /17/.

Антиген-3, ассоциированный с лимфоцитной функцией (ЛФА-3) представляет собой широко распространенный гликопротеин поверхности клетки, который является лигандом для T лимфоцита CD2. ЛФА-3 со своими ассоциированными лигандами образует протеиновые мицеллы из восьми мономеров, которые увеличили их способность взаимодействовать с клетками, на поверхности которых находится CD2 /18/.

Используя относительно близкую методику, одна группа изучала ингибирующее влияние синтетического полипептида, который включал повторяющуюся пентапептидную единицу. Полимер синтезировали полимеризацией в присутствии дифенилфосфорилазида до достижения около 10 000 дальтонов. Этот полимеризованный пентапептид является одной из важнейших структур в нескольких биологических реакциях /19/.

Дальнейшее препятствие в разработке эффективных экзогенных протеинов, которые бы увеличивали или конкурировали с эндогенными веществами, заключается в том, что экзогенные протеины должны предпочтительно вводиться систематически, чем быть локализованы в соответствующем месте. Это может приводить к более низкой эффективности и к увеличению побочных эффектов. Несколько исследовательских групп сообщают о попадании биоактивных протеинов в соответствующие сайты посредством связывания их с другими протеинами, которые естественным образом направляются на эти сайты. Часто такое связывание осуществляют через слияние генов активного и попадающего протеинов.

После появления настоящего изобретения поступило сообщение о том, что для создания связанных суперантигенов антител, были использованы спейсеры или линкеры из полиэтиленгликоля. Моноклональный антиген, реактивный по отношению к клеткам карциномы прямой кишки, был присоединен к стафилококковому энтеротоксину бактериального суперантигена. Эти комплексы предназначены скорее не для использования преимуществ, связанных с другими бивалентными комплексами (например, более высокая молекулярная масса; синергические эффекты бивалентности), а для конъюгирования определенных зон суперантигенов. Описанный для образования этих связанных суперантигенов способ пегилирования дает комплекс, который содержит широкую смесь веществ. Сочетание данного антитела и этого суперантигена осуществляли при использовании - сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио) пропионата и гидрофильного спейсера на основе ПЭГ с цепочкой из 24 атомов. В соответствии с этим способом, к каждой единице антитела были присоединены от 7 до 18 связующих элементов, и на каждом из суперантигенов прореагировали один или два лизина /20/. Используя этот способ, было бы невозможно выделить один тип продукта реакции для того, чтобы оптимизировать продукт или способ.

Две группы протеиновых веществ, имеющих важные применения при лечении широкого разнообразия медицинских показаний, представляют собой ингибиторы фактора некрозоопухолей (ФНО) и антагонисты рецепторов интерлейкина-1 (IL-1ra). Показано, что эти вещества оказывают положительный эффект при лечении болезней, вызванных ФНО и IL-1 соответственно. Среди показаний, идентифицированных как принадлежащие к вызываемым либо ФНО, либо IL-1, оказываются синдром респираторного нарушения взрослых, легочный фиброз, ревматоидный артрит, воспаление кишечника и септический шок.

Находящаяся на рассмотрении заявка, ссылка на которую здесь приведена /21/, описывает класс естественно встречающихся протеиновых ингибиторов ФНО и способ получения их в существенных количествах с высокой степенью чистоты. В частности, в вышеупомянутой заявке детально описаны две субсерии ингибиторов ФНО, обозначенные как 30 кДа ингибитор ФНО и 40 кДа ингибитор ФНО. Кроме имеющего полную длину цепочки протеина 40 кДа ингибитора ФНО, получены также две урезанные, однако биологически активные формы 40 кДа ингибитора ФНО. Эти протеины, в которых из имеющего полную длину цепи протеина были убраны 51 и 53 аминокислоты с концевыми карбоксильными группами, обозначают соответственно как 40 кДа-ингибитор ФНО 51 и 40 кДа ингибитор ФНО 53.

Находящаяся на рассмотрении заявка /22/, ссылка на которую здесь приведена, описывает предпочтительный класс природных протеиновых ингибиторов IL-1 и способ получения их в существенных количествах с высокой степенью чистоты. В частности, в заявке подробно описаны три таких ингибитора интерлейкина-1, которыми являются антагонисты рецепторов интерлейкина-1 (IL-1ra's), а именно, IL-1ra , IL-1ra и IL-1rax.

Два дополнительных класса веществ, которые потенциально полезны для лечения при разнообразных медицинских показаниях, представляют собой ингибиторы интерлейкина-2 и ингибиторы комплемента. Потенциальные ингибиторы интерлейкина-2 включают рецепторы интерлейкина-2, внеклеточный домен рецепторов интерлейкина-2, антагонисты рецепторов интерлейкина-2, антитела, которые узнают интерлейкин-2, и фрагменты любых таких веществ, которые содержат связующую функцию IL-2. Потенциальные ингибиторы системы комплемента включают рецептор CR1, внеклеточный домен R1 и фрагмент CR1, который содержит функцию связывания комплемента.

В /23/ описаны рецептор интерлейкина-2 и способы его выделения. Описан также ген-кодирующий рецептор интерлейкина-2 и методы для его рекомбинантного получения /24/.

Можно допустить, что до определенной степени растворимый внеклеточный домен любого рецептора интерлейкина-2 будет действовать как ингибитор действия интерлейкина-2 цитокина. Интерлейкин-2 является одним из наиболее охарактеризованных цитокинов, о которых известно, что они играют центральную роль в антигенспецифическом клоновом росте T лимфоцитов. Было также показано, что интерлейкин-2 действует на разновидности других клеток в иммунной системе.

Существуют три дискретных формы рецептора интерлейкина-2, включающие две различные молекулы рецептора, обозначенные или как IL-2r , или как IL-2r . Рецептор IL-2 с самым сильным сродством состоит из двух отличающихся рецепторов IL-2. Оба эти рецептора были клонированы и охарактеризованы. Рецептор IL-2 с низким сродством (IL-2r ) был клонирован в 1984 г. и был подробно охарактеризован /25/. Внеклеточный домен этой молекулы имел молекулярную массу 24825 и имел два N - связанные сайта гликозилирования. Эта молекула содержит 11 цистеинов, 10 из которых участвуют во внутримолекулярных дисульфидных связях. Предполагаемые ломены связывания IL-2 с этой молекулой были нанесены на карту как с помощью матугенеза, так и эпитопным картированием. Рецептор IL-2 с промежуточным сродством (IL-2r \ ) был клонирован в 1989 г. и не был так полно охарактеризован, как IL-2r /26/. Внеклеточный домен IL-2r имеет молекулярную массу 24693. Молекула содержит 8 цистеинов и 4 N-связанных сайта гликозилирования. Образование дисульфидных связей в данной молекуле неизвестно. IL-2r имеет цитоплазменный домен из 286 аминокислот.

Для IL-2 рецепторов были определены константы диссоциации (K_д). Они составляют 10^-8 М для IL-2r , 10^-9 М для IL-2r и 10^-11 М для рецептора с высоким сродством, который состоит из комплекса IL-2r , IL-2r и IL-2. Существующие модели указывают, что формирование комплекса с высоким сродством протекает сначала через присоединение IL-2 к IL-2r , а затем к IL-2r /27/.

Ингибитор IL-2 может быть ценным в предупреждении отторжения трансплантата, так же как и при аутоиммунных заболеваниях. В настоящее время моноклональное антитело, которое препятствует связыванию IL-2, испытывают при почечной трансплантации у человека /28/. В одном исследовании на 15 пациентах было показано, что данное антитело, в сочетании с иммунодепрессантами, является столь же эффективным в предупреждении отторжения аллографта, как в контрольной группе, получавшей более высокие дозы иммунодепрессантов. При многих заболеваниях, некоторых инфекциях, так же как и при трансплантации и отторжении обнаружено высокое содержание в крови растворимого IL-2r . Это наводит на мысль об участии IL-2 в этих заболеваниях.

CRI представляет собой протеин, также обозначаемый как C3b/C4b рецептор. CRI присутствует на эритроцитах и ряде других типов клеток и специфически связывает C3b, C4b и iC3b. CRI может также ингибировать классический и альтернативный путь C3/C5 конвертаз и действовать как ко-фактор для расщепления C3b и C4b фактором 1 /29/. CRI - это гликопротеин, состоящий из одной полипептидной цепи, и он существенно в четырех аллотипичных формах. Известно, что CRI содержит повторяющиеся кодирующие последовательности, и этот факт используют, чтобы объяснить существование многочисленных аллотипов /30/.

Пониженную экспрессию CRI на эритроцитах связывали с красной волчанкой, и было также обнаружено, что число CRI обратно пропорционально содержанию сыворотки иммунных комплексов. Сам CRI протеин, CRI ген и способы получения CRI описаны в /31/. Как описано выше, были также описаны двумерные образования, содержащие CRI и домены антитела /32/.

Данное изобретение относится к способу модификации полипептидов и полученным в результате модифицированным полипептидам.

Данное изобретение включает по существу чистые соединения, охватываемые формулой R₁-X-R₂, в которой R₁ и R₂ представляют собой биологически активные группы, а X является непептидным полимерным спейсером. R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или различными группами, и по крайней мере один из них, R₁ или R₂ является пептидным. В предпочтительных практических реализациях R₁ и R₂ представляют собой или антагонист рецептора интерлейкина-1; или 30 кДа ингибитор ФНО; или рецептор интерлейкина-2 или CRI, а X представляет собой или полиэтиленгликоль, или полиоксиэтилированный глицерол, или декстран, или кислоты прямой кишки, или поли -- аминокислоты, или углеводные полимеры. Включены также фармацевтические составы, содержащие также по существу чистые соединения в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Далее включены способы лечения пациентов, нуждающихся в этом, такими терапевтическими составами. Соединения формулы R₁-X-R₂, изображенные на фиг. 19, в дальнейшем называют "гантелями".

Это изобретение также включает способ получения по существу чистых терапевтически ценных соединений, охватываемых формулой R₁-X-R₂, который включает взаимодействие непептидной полимерной группы, имеющей по крайней мере две реакционноспособные группы, способные образовывать ковалентные связи, с биологически активной группой R; и выделение указанного продукта.

В другой практической реализации, это изобретение включает способ получения по существу чистых терапевтически ценных соединений, охватываемых формулой R₁-X-R₂, где R₁ и R₂ различны, который заключается в: проведении взаимодействия непиптидной полимерной группы, способный образовывать ковалентные связи при реагировании с биологически активной группой R₁, с образованием комплекса R₁-X; проведении взаимодействия комплекса R₁-X с биологически активной группой R₂ с получением указанного соединения; и выделении и очистке указанного соединения.

В одной практической реализации, это изобретение относится к сайт-специфическому пегилированию ингибитора ФНО и ингибитора IL-1, Для того чтобы обеспечить сайт-специфичность пегилирования, выбирают такие пегилирующие реагенты, которые будут реагировать почти исключительно со свободными SH-группами остатков цистеина в полипептидах. Примером реагента пегилирования, который почти исключительно связывается SH-группами цистеина, является O-(2-мальимидоэтил)-O'-метилполиэтиленгликоль.

Сайт-специфическое пегилирование можно осуществить либо на природных "свободных" цистеиновых остатках данного полипептида, либо на свободных цистеинах, содержащихся на мутеинах природных полипептидов. Цистеин можно как добавлять или вводить в аминокислотную последовательность природного полипептида, так и замещать ими другие аминокислотные остатки в выбранном месте.

В одной практической реализации этого изобретения полипептиды, которые подлежат пигелированию, получают посредством рекомбинантной ДНК-технологии из бактериальной клетки-хозяина. В большинстве случаев бактериально экспрессированный полипептид до стадии пегилирования должен быть повторно уложен, чтобы получить биологическую активность. В некоторых примерах данного изобретения нативный полипептид не содержит никаких свободных цистеиновых остатков, но тогда получают измененный полипептид, содержащий по крайней мере один свободный цистеин в биологически активном полипептиде. Согласно этому способу, повторную укладку бактериально экспрессированного полипептида облегчают присоединением, поочередно, сульфгидрила, содержащего такое соединение как цистеин, и дисульфида, содержащего такое соединение как цистеин. После повторной укладки и очистки этот полипептид обрабатывают ограниченным количеством мягкого восстановителя, такого как дитиотрейтол ("ДТТ"), чтобы регенерировать сульфгидрильную группу этого нового цистеинового остатка измененного полипептида. После диализа в условиях, рассчитанных на то, чтобы не допустить окисления, полипептид можно привести во взаимодействие с агентом специфического пегилирования цистеина, чтобы сайт-специфически получить ковалентно модифицированный полипептид.

Предпочтительные пегилированные полипептиды настоящего изобретения представляют собой сайт-специфически пегилированные ингибиторы ФНО и ингибиторы IL-1. Более конкретно данное изобретение описывает пегилированный 30 кДа ингибитор ФНО и пегилированный антагонист рецептора IL-1. Наиболее предпочтительные пегилированные ингибиторы ФНО включают 30 кДа ингибитор ФНО, в котором остаток аспарагиновой аминокислоты в позиции 105, нативного протеина человека заменяют на цистеин, используя in vitro мутагенез, и пегилирование происходит на свободном цистеина в позиции 105. Другие пегилированные производные мутированных 30 кДа ангибиторов ФНО включают мутации, при которых цистеин был присоединен в позициях 1, 14, 111 и 161. Кроме однократно пегилированных мутеинов, любая и всех комбинации различных мутаций могут быть включены в один мутеин для получения измененного 30 к а ингибитора ФНО с более чем одним свободным цистеиновыим остатком, способным к пегилированию.

Наиболее предпочтительный пегилированный IL-1ra включает природный или нативный IL-1ra, который содержит четыре свободных цистеина. Монопегилирование нативного IL-1ra приводят к сайт-специфическому пегилированию при цистеине в позиции 116. Другие пегилированные производные мутированного IL-1r включают мутаины, имеющие цистеин, присоединенный к аминным концам полипептида, цистеин, присоединенный в позициях 6, 8, 9, 84 или 141, и замещение цистеина в позиции 116 серином. Кроме однократно пегилированных мутеинов, любая и все комбинации различных мутаций могут быть использованы для того, что получить измененный и IL-1ra с более чем одним свободным цистеином, способным к пегилированию Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны при рассмотрении последующего подробного описания изобретения, включающего иллюстративные примеры практического применения изобретения.

Фиг. 1 представляет последовательность аминокислот нативного IL-1ra.

Фиг. 2 представляет последовательность нативного 30 кДа ингибитора ФНО.

Фиг. 3 представляет результат электрофореза непегилированной и пегилированной форм IL-1ra и мутеинового c84s116 IL-1ra в системе ДСН-ПААГ )окрашивание Кумасси). Дорожки 2, 3, 5 и 6 содержат реакционные смеси пегилирования. Дорожки 1 и 4 представляют немодифицированные протеины: Дорожка 1 - IL-1ra Дорожка 2 - мПЭГ₅₀₀₀^* IL-1ra Дорожка 3 - мПЭГ₈₅₀₀^* IL-1ra Дорожка 4 - c84s116 IL-1ra Дорожка 5 - мПЭГ₅₀₀₀c84s116 IL-1ra Дорожка 6 - мПЭГ₈₅₀₀c84s116 IL-1ra Фиг. 4 представляет результаты ионообменной хроматографии на сорбенте моно S: хроматограмма A - реакционная смесь пегилирования при получении мПЭГ₅₀₀₀^*IL-1ra, пик 1 относится к модифицированному, а пик 2 - к немодифицированному IL-1ra; хроматограмма B представляет очищенный мПЭГ₅₀₀₀^*IL-1ra.

Фиг. 5 изображает хроматограмму, полученную способом ВЭЖХ, показывающую профиль элюции нескольких веществ - стандартов размеров, и мПЭГ₈₅₀₀^*IL-1ra (фракция 7) и IL-1ra (фракция 13).

Фиг. 6 представляет результаты фракционирования методом обращенно-фазной ВЭЖХ продуктов триптического расщепления алкилированного мПЭГ₅₀₀₀^*IL-1ra, обработанного меченной тритием иодуксусной кислотой для того, чтобы поместить свободные цистеины. Разделение проводили на колонке Браунли C8 (2,1 х 220 мм) при комнатной температуре и скорости потока 1000 мкл/мин с линейным градиентом. Растворитель A представлял собой 0,1%-ный раствор ТФУК (трифторуксусуной кислоты) в воде, а растворитель B - 0,085%-ный раствор ТФУК в смеси из 80% ацетонитрила и 20% воды.

Фиг. 7 представляет результаты фракционирования методом обращенно-фазной ВЭЖХ химотриптического расщепления пептида 18 на фиг. 6. Условия идентичны условиям для фиг 6. Пептиды 5 и 8 содержат тритиевые метки, и пептид 5 имеет аминокислотную последовательность LCTAMEADQPVSL. Цистеин был идентифицирован в виде карбоксиметилцистеинового производного. Этот цикл был единственным, обнаружившим радиоактивность выше уровня фона. Аминокислотная последовательность пептида 8 начиналась с серина 103 IL-1ra. Повторное расщепление этого пептида с химотрипсином позволило элиминировать все тритиевые метки из полипептида.

Фиг. 8 представляет профили изменения концентрации плазменного IL-1ra во времени для зрелого IL-1ra, пегилированного IL-1ra и нескольких пегилированных мутеинов IL-1ra.

Фиг. 9 представляет результат электрофореза в системе ДСН-ПААГ, показывающий с105 30 кДа ингибитор ФНО мПЭГ и разделение непрореагировавшего 30 кДа ингибитора ФНО от мПЭГ с105 30 кДа ингибитора ФНО методом ГПХ.

Фиг. 10 представляет кривые изменения внутривенной концентрации плазменной IL-1ra во времени для ряда образцов однократно пегилированного IL-1ra, двукратно пегилированного IL-1ra и гантелеобразных разновидностей IL-1ra ПЭГ.

Фиг. 11 представляет кривые изменения подкожной концентрации плазменного IL-1ra во времени для того же ряда соединений IL-1ra, как на фиг. 10.

Фиг. 12 показывает содержание плазменного IL-G во времени после введения мыши ФНО.

Фиг. 13 представляет сравнение содержания IL-6, индуцированное в мыши при пяти соотношениях с105s30 кДа ингибитора ФНО к ФНО (A) и пяти соотношениях соединения с105s30 кДа ингибитор ФНО ПЭГ₂₀₀₀ (гантель) к ФНО (B).

Фиг. 14 представляет содержание плазменной IL-6, индуцированное в мышах одним ФНО и смесями 1: 1 ФНО с гантелеобразными соединениями с105s30 кДа ингибитор ФНО ПЭГ₃₅₀₀ и ПЭГ₁₀₀₀₀.

Фиг. 15 представляет процент нейтрофилов, индуцированных при различных соотношениях ФНО к с105s30 кДа ингибитору ФНО (A); с105s30 30 кДа ингибитору ФНО ПЭГ₃₅₀₀ (гантель) (B); с105s30 кДа ингибитору ФНО ПЭГ₁₀₀₀₀ (гантель) (C); и с105s30 кДа ингибитору ФНО ПЭГ₂₀₀₀₀ (гантель) (D).

Фиг. 16 представляет зависимости изменения внутривенной концентрации плазменного 30 кДа ингибитора ФНО во времени для нативного 30 кДа ингибитора ФНО, с105s30 кДа ингибитора ФНО ПЭГ₈₅₀₀ и ПЭГ₁₀₀₀₀, и для гантелеобразных структур 30 кДа ингибитора ФНО ПЭГ₃₅₀₀, ПЭГ₁₀₀₀₀ и ПЭГ₂₀₀₀₀.

Фиг. 17 представляет зависимости изменения подкожной концентрации плазменного 30 кДа ингибитора ФНО от времени для того же ряда соединений 30 кДа ингибитора ФНО как на фиг. 16.

Фиг. 18 представляет растворимость для трех растворов нативного IL-1ra и с84 IL-1ra ПЭГ₈₅₀₀ по изменению оптической плотности при 450 нм во времени.

Фиг. 19 представляет основную структуру соединений в соответствии с настоящим изобретением, имеющих общую формулу R₁-X-R₂, которые называют соединения-гантели.

Это изобретение включает селективную модификацию фармацевтически полезных полипептидов, в частности, ингибиторов фактора некрозоопухолей ("ФНО") и ингибиторов интерлейкина-1 ("IL-1"). Конкретнее, это изобретение описывает селективную модификацию 30 кДа ингибитора ФНО и антагониста рецептора IL-1 ("IL-1ra") Селективные модификации служат как для усиления фармакокинетических свойств полипептидов, так и для получения гомогенных составов для терапевтического использования в применении к человеку.

Дополнительные полипептиды, которые могут быть селективно модифицированы согласно данному изобретению, включают рецепторы инетерлейкина-2 ("IL-2r") и CRI. Все ссылки на рецептор интерлейкина-2 следует понимать так, что они включают как -, так и - цепи IL-2r, если не оговариваются специально.

В предпочтительных практических реализациях данного изобретения модифицированные полипептиды и ДНК последовательности являются человеческими. Однако в той степени, в какой существует достаточная гомология между ДНК и пептидными последовательностями животных и такими же формами человека, их можно включать в сферу данного изобретения.

В одной конкретной реализации способ модификации согласно настоящему изобретению включает сайт-специфическое ковалентное связывание длинноцепных полимеров с представляющими интерес полипептидами. Выбранные полипептиды могут быть нативными или представляющими интерес природными полипептидами, или они могут представлять собой биологически активные мутеины полипептидов, которые были получены с целью усилить процесс модификации, описываемый здесь. Этот способ согласно настоящему изобретению включает селекцию, получение и отбор желаемых мутеинов, которые удовлетворяют целям настоящего изобретения. В других практических реализациях этого изобретения данный способ для модификации полипептидов требует только проведения модификации таким образом, чтобы полученный в результате продукт представлял собой по существу чистую форму, как этот термин определен в изобретении.

В некоторых практических реализациях изобретения, модифицированные полипептиды в соответствии с настоящим изобретением связывают с длинноцепными полимерами в специфических точках аминокислотной последовательности. Такие модифицированные полипептиды в соответствии с настоящим изобретением сохраняют значительную часть своей биологической активности. В предпочтительных практических реализациях модифицированные полипептиды сохраняют по крайней мере одну десятую биологической активности нативного полипептида при испытании связывания рецептора. В более предпочтительной конкретной реализации, модифицированный полипептид будет сохранять по крайней мере одну пятую биологической активности нативного полипептида, а в самой предпочитаемой конкретной реализации сохранит по крайней мере одну четвертую активности. Кроме того, модифицированный полипептид будет служить улучшению фармакокинетической характеристики нативного полипептида по крайней мере в одной из следующих областей: 1) увеличение кажущейся молекулярной массы нативного полипептида и, следовательно, уменьшение скорости выведения после подкожного или системного введения; 2) увеличение растворимости нативного полипептида в водных растворах; или 3) снижение антигенности нативного полипептида.

В многочисленных практических реализациях данного изобретения достигается каждая из этих целей. В предпочтительных практических реализациях данного изобретения длинноцепной полимер представляет собой полиэтиленгликоль или монометоксиполиэтиленгликоль. Структурная единица полиэтиленгликоля обозначена здесь как ПЭГ, а структурная единица монометоксиполиэтиленгликоля - как мПЭГ. Приблизительная молекулярная масса этих структурных единиц указана около их обозначений внизу.