Полипептид и способ его получения, реагент для иммуноанализа, способ определения присутствия антител и способ индукции иммунного ответа

Полипептид и способ его получения, реагент для иммуноанализа, способ определения присутствия антител и способ индукции иммунного ответа

Реферат

 

Изобретение относится к полипептидам, применяемым в качестве иммунологических реагентов при определении, предупреждении и лечении инфекций, вызванных HCV. Описывается новый полипептид, включающий усеченную последовательность HCV (вируса гепатита С), содержащую эпитоп HCV с формулой аа_х-аа_у, способный индуцировать иммунный ответ у субъекта, где аа обозначает аминокислоту, х и у являются целыми числами, такими, что у-х 14, аа_х-аа_у обозначает часть аминокислотной последовательности с фиг. 1 и х выбирают из группы: 66, 413, 465, 540, 1218, 1940, 2244, 2281, причем указанный полипептид может иметь необязательную последовательность N-концевых аминокислот, соответствующую последовательности полипептида HCV, прилегающей к N-концу аминокислоты аа_х, к которой она прикреплена, или необязательную последовательность С-концевых аминокислот, соответствующую последовательности полипептида HCV, прилегающую к С-концу аминокислоты аа_у, которой она прикреплена, причем общее количество дополнительных аминокислот не превышает 15 для аа₄₁₃-аа-аа₄₂₇, 4 для аа₄₆₅-аа₄₈₀, 85 для аа₅₄₀-аа₅₅₄ 10 для аа₂₂₄₄-аа₂₂₅₈, и 30 для аа₂₂₈₁-аа₂₃₀₀. Описывается также способ определения присутствия антител, способ индукции иммунного ответа. 5 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 10 ил.

Изобретение относится к материалам и методологиям для устранения распространения инфекции, вызываемой вирусом гепатита C (HCV). Более конкретно оно относится к полипептидам, применяемым в качестве иммунологических реагентов при определении, предупреждении и лечении инфекций, вызванных HCV.

Предпосылки изобретения HCV был впервые идентифицирован и охарактеризован в качестве причины гепатита ни A, ни B (NANBH) Houghton et al. Это привело к открытию ряда основных и специфических полипептидов, применимых в качестве иммунологических реагентов. Смотрите, например, Houghton et al., N 318,216; Houghton et al., EPO Pub. N 388,232; Choo et al., Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al., Science (1989) 244: 362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381-388. Эти публикации представляют информацию с обширным кругом источников в основном по HCV, так же как по производству и использованию полипептидных иммунологических реагентов из HCV. Для краткости поэтому описание этих публикаций, в частности, включены здесь в виде ссылок.

Другие с готовностью применили и расширили разработки Houghton et al. Смотрите, например, Highfield et al., UK Pat.App.2.239245 (The Welcome Foundation Ltd); Wahg, EPO Pub. N 442394 (United Biomedical Inc.); Leung et al. , EPO Pub. N 445423 (Abbott Laboratories); Habits et al., EPO Pub. N 451.891 (Akzo N. V.); Reyes et al., PCT Pub. N WO 91/15516 (Genelabs Inc.); Maki et al. , EPO Pub. N 468.657 (Tonen Corp.); и Kamada et al., EPO Pub. N 469.348 (Shionogi Seiyaku K.K.).

Чувствительные специфичные методы для проверки на и определения носителей HCV и зараженной HCV крови и продуктов из крови являются важным достижением медицины. Гепатит после переливания крови (PTH) встречается примерно у 10% больных, которым переливали кровь, и HCV составляли до 90% этих случаев. Главной проблемой при этом заболевании является частое развитие болезни до хронического поражения печени (25-55%). Лечение больных, так же как и предупреждение передачи HCV с кровью и продуктами крови или при тесном личном контакте, требует надежных диагностических и прогностических средств, таких как полипептиды HCV, для определения антител, связанных с HCV. Такие полипептиды также применяются в качестве вакцин и иммунотерапевтических и терапевтических средств для предупреждения и/или лечения заболевания.

Так как HCV является относительно новым возбудителем, существует постоянная потребность в выявлении дополнительных иммунологических реагентов, которые дадут возможность дальнейшего изучения клинического течения болезни и эпидемиологии HCV среди населения.

Описание изобретения Изобретение относится к определению характеристик новых эпитопов HCV. Определение характеристик этих эпитопов дает возможность производства полипептидных продуктов, которые иммунологически реагируют с антителами к HCV и/или вызывают образование антител против HCV in vivo. Эти полипептидные продукты применимы в качестве стандартов или реагентов в диагностических тестах и/или в качестве компонентов вакцин. Антитела, включая, например, как поликлональные, так и моноклональные, направленные против HCV эпитопов, которые содержатся в этих полипептидных последовательностях, также применимы как реагенты, например, для диагностических тестов, в качестве терапевтических средств, при отборе противовирусных средств и для выделения/очистки полипептидов HCV или частиц.

В наиболее широком смысле настоящее изобретение направлено на получение полипептидов, содержащих вновь охарактеризованные эпитопы HCV, описанные здесь, разработку способов получения таких полипептидов (например, химического синтеза), разработку способов применения таких полипептидов (например, диагностика, вакцины и терапия). Иммунологическое исследование для определения антител против HCV, включающее инкубацию образца, подозреваемого на содержание антител против HCV, с полипептидом, описанным выше, в условиях, которые дают возможность образования комплекса антитело-антиген: и определение комплекса антитело-антиген, содержащего полипептид, также входит в объем притязаний изобретения. Еще одним аспектом изобретения является способ индукции иммунного ответа у субъекта против HCV, включающий введение индивидууму выделенного иммуногенного полипептида, содержащего эпитоп HCV, описанный здесь, в количестве, достаточном, чтобы вызвать иммунный ответ.

Вышеназванные объекты настоящего изобретения могут быть осуществлены с применением эпитопов HCV с формулой aa_x -aa_y, где aa обозначает аминокислоту; x и y являются целыми числами, такими, что y-x 14; aa_x-aa_y показывает часть аминокислотной последовательности фигуры 1; и x выбирают из группы: 66, 413, 540, 1218, 1940, 2244, 2281, причем указанный полипептид может иметь необязательную последовательность N-концевых аминокислот, соответствующую последовательности полипептида HCV, прилегающей к N-концу аминокислоты aa_x, к которой она прикреплена, или необязательную последовательность C-концевых аминокислот, соответствующую последовательности полипептида HCV, прилегающую к C-концу аминокислоты aa_y, к которой она прикреплена, причем общее количество дополнительных аминокислот не превышает 15 для aa₄₁₃-aa₄₂₇, 4 для aa₄₆₅-aa₄₈₀, 85 для aa₅₄₀-aa₅₅₄, 10 для aa₂₂₄₄-aa₂₂₅₈, и 30 для aa₂₂₈₁-aa₂₃₀₀.

Краткое описание чертежей Фиг.1 показывает полипротеин прототипного изолята HCV-HCV1.

Фиг.2 показывает составную последовательность кДНК HCV1 Фиг. 3 показывает нуклеотидную консенсусную последовательность человеческого изолята 23, варианты последовательности показаны ниже линии последовательности. Показаны также аминокислоты, кодируемые консенсусной последовательностью.

Фиг. 4 показывает нуклеотидную консенсусную последовательность человеческого изолята 27, вариантные последовательности показаны ниже линии последовательности.

Фиг.5 показывает вытянутые в ряд нуклеотидные последовательности человеческих изолятов 23 и 27 и HCV1. Гомологичные последовательности указаны символом (*). Негомологичные последовательности представлены маленькими буквами.

Фиг. 6 показывает вытянутые в ряд аминокислотные последовательности человеческих изолятов 23 и 27 и HCV1. Гомологичные последовательности указаны символом (*). Негомологичные последовательности представлены маленькими буквами.

Фиг. 7 показывает сравнение выстроенных в ряд составных нуклеотидных последовательностей изолятов Thorn, EC1, HCT 18 и HCV1.

Фиг. 8 показывает сравнение нуклеотидных последовательностей ЕС10 и композит последовательности HCV1; последовательность ЕС10 находится на линии над точками, и последовательность HCV1 находится на линии ниже точек.

Фиг. 9 показывает сравнение аминокислотных последовательностей 117-308 (относительно HCV1), кодируемых в "EnvL" областях консенсусных последовательностей человеческих изолятов НСТ#18, JH, 2J, JH27, Thorne, EC1 и HCV1.

Фиг. 10 показывает сравнение аминокислотных последовательностей 330-360 (относительно HCV1), кодируемых в областях "EnvL" консенсусных последовательностей человеческих изолятов НСТ 18, JA23, JH27, Thorne, ECT, HCV1.

Способы осуществления изобретения Полное перечисление публикаций, на которые ссылаются здесь, можно найти в разделах "Предпосылки создания изобретения" или "Библиография".

1. Определения "Вирус гепатита C" или "HCV" относится к научнопризнанному вирусному виду, патогенные штаммы которого вызывают NANBH и из них получены аттенуированные штаммы или дефектные интерферирующие частицы. Смотрите в основном публикации, процитированные в разделе, озаглавленном "Предпосылки создания изобретения". Геном HCV содержит PHK. Известно, что содержание PHK вирусы имеют относительно высокие степени спонтанных мутаций, т.е. по сообщениям, порядка от 10^-3 до 10^-4 на включенный нуклеотид (Fields and Knipl (1986)). Поэтому из-за гетерогенности и текучести генотипа, присущей РНК вирусам, существует множество штаммов/изолятов, которые могут быть вирулентными или эвирулентными, внутри вида HCV. Распространение, идентификация, обнаружение и выделение различных штаммов HCV или изолятов хорошо представлены в литературе. Кроме того, раскрытое здесь позволяет получить диагностические препараты и вакцины для различных штаммов/изолятов, так же как и композиции, а также разработать способы, которые применимы при процедуре отбора на противовирусные средства для фармакологических целей, таких как средства, которые подавляют репликацию HCV.

Здесь раскрывается информация по нескольким разным штаммам/изолятам HCV, в частности по штамму или изоляту СДС/HCV/ (также называемого). Информация, полученная по одному штамму или изоляту, такая как по части геномной или аминокислотной последовательности, достаточна, чтобы дать возможность опытным специалистам, используя стандартные методики, выделить новые штаммы/ изоляты и определить, являются ли такие новые штаммы/изоляты HCV. Для примера несколько различных штаммов/изолятов описаны ниже. Эти штаммы, которые были получены из ряда человеческих сывороток (и из разных географических областей), были выделены с использованием информации по геномной последовательности HCV1.

Представленная здесь информация показывает, что HCV может быть отдаленно родственен флавивирусам. Семейство Flavivirus содержит большое число вирусов, которые являются мелкими, оболоченными возбудителями человека. Морфология и структура флавивирусных частиц известны и рассмотрены у Brinton (1986). В основном, что касается морфологии, флавивирусы содержат центральный нуклеокапсид, окруженный двойными липидными слоями. Вирионы являются сферическими и имеют диаметр около 40-50 нм. Их нуклеоиды имеют примерно 25-30 нм в диаметре. По наружной поверхности оболочки вириона расположены выросты, которые имеют длину около 5-10 нм с концевыми вздутиями диаметром примерно 2 нм. Типичными примерами представителей этого семейства являются вирус желтой лихорадки, вирус западного Нила, вирус лихорадки Денге. Они обладают положительно-цепочечными РНК-геномами (~ 11000 нуклеотидов), которые немного больше, чем таковые HCV, и кодируют полипротеиновый предшественник примерно в 3500 аминокислот. Отдельные вирусные белки отделяются от этого предшественника-полипептида.

Была выведена структура генома и нуклеотидная последовательность геномной РНК HCV. Геном, по-видимому, является одноцепочечной РНК, содержащей ~ 10000 нуклеотидов. Геном является положительно-цепочечным и обладает постоянной трансляционной открытой считывающей рамкой (ORF), которая кодирует полипротеин размером примерно 3000 аминокислот. В ORF структурные протеин(ы), по-видимому, кодируются примерно в первой четверти N-концевой области, причем большая часть полипротеина ответственна за неструктурные белки. При сравнении со всеми известными вирусными последовательностями наблюдаются небольшие, но важные ко-линейные гемологии с неструктурными белками семейства флавивирусов и с пестивирусами (которые, как теперь считается, являются частью семейства Flavivirus).

На основе предполагаемых аминокислот, кодируемых в нуклеотидной последовательности HCV1 и других данных возможные протеиновые домены кодируемого полипротеина HCV, так же как и приблизительные границы, являются следующими: Предполагаемый домен - Приблизительные границы (номера аминокислот) C (нуклеокапсидный белок) - 1-131 E₁ (белок оболочки вируса) - 192-383 E₂ /NS1/ (оболочка?) - 384-800 (неизвестная функция) - 800-1050 (протеаза?) - 1050-1650 (неизвестная функция) - 1651-2100 (полимераза) - 2100-3011 (конец) Эти домены являются, однако, предварительными. Например, граница EI-NS2 находится в области 750-810, и NS3-NS4 граница находится около 1640-1650. Существует также доказательство того, что вариант C - 191 не является предшественником, который далее обрабатывается (например, до длины примерно 170 аа), и что белки NS2, NS4 и NS5 каждый, далее перерабатываются в два зрелых белка.

Как предполагается, различные штаммы, изоляты или подтипы HCV содержат варианты аминокислот и нуклеиновых кислот по сравнению с HCV1. Предполагают, что многие изоляты покажут большую степень (т.е. более, что примерно 40%) гомологии в общей аминокислотной последовательности в сравнении с HCV1. Однако, возможно, также обнаружится, что существуют другие менее гомологичные изоляты HCV. Эти изоляты могут быть определены как HCV по разным критериям, таким как, например, ORF в пределах от примерно 9000 нуклеотидов до примерно 12000 нуклеотидов, кодирующая полипротеин, сходный по размеру с таковым HCV1, кодируемый полипротеин с гидрофобными и/или антигенными характеристиками, сходными с таковыми HCV1, и наличие колинейных пептидных последовательностей, которые сохраняются из HCV1. Кроме того, был бы положительно-цепочечной РНК.

HCV кодируется по крайней мере один эпитоп, который иммунологически сравним с эпитопом в полипротеине HCV1. Эпитоп является уникальным для HCV по сравнению с ранее известными флавивирусами. Уникальность эпитопа может быть определена по его иммунологической реактивности с антителами к известным видам флавивирусов. Методы для определения иммунологической реактивности известны в данной области науки, например, здесь представлены радиоиммуноисследование, определение по ELISA путем гемагглютинации и еще несколько примеров подходящих методик для исследования.

В дополнение к вышеописанному могут применяться для идентификации штамма/изолята как HCV следующие параметры гомологии нуклеиновых и аминокислот отдельно или в комбинации. Так как штаммы HCV и изоляты являются эволюционно родственными, ожидается, что общая гомология геномов на нуклеотидном уровне может быть на уровне 10% или больше, возможно, будет около 40% или больше, возможно, примерно 60% или больше и даже более вероятно около 80% или больше; и кроме того, будут существовать соответствующие прилегающие последовательности из по крайней мере около 13 нуклеотидов. Необходимо отметить, что вариабельные и гипервариабельные области присутствуют в геноме HCV; поэтому ожидается, что гомология в этих областях будет значительно меньше, чем гомология в целом по геному. Соответствие между предполагаемой геномной последовательностью штамма HCV и, например, последовательностью кДНК СДС/HCV1 можно определить по методикам, известным в данной области науки. Например, оно может быть определено путем прямого сравнения данных по последовательности полинуклеотида из предполагаемого HCV, и последовательностями кДНК, описанными здесь. Например, оно может быть также определено путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, при которых образуются стабильные дуплексы между гомологичными областями (например, теми, которые использовались бы до расщепления S₁), за которым следует расщепление с помощью специфичных нуклеза одноцепочечных нуклеиновых кислот с последующим определением размера фрагментов расщепления.

Благодаря эволюционному родству штаммов или изолятов HCV, предполагаемые штаммы или изоляты HCV идентифицируются по их гомологии на полипептидном уровне. В основном ожидается, что штаммы и изоляты HCV будут гомологичны по крайней мере на 10%, более чем примерно на 40%, возможно более чем примерно на 70%, и даже более вероятно более чем примерно на 80%, и некоторые могут быть гомологичны более чем примерно на 90% на полипептидном уровне. Методики для определения гомологии аминокислотных последовательностей известны специалистам. Например, можно прямо определить аминокислотную последовательность и сравнить с представленными здесь последовательностями. Или же иначе может быть определена нуклеотидная последовательность материала генома предполагаемого HCV (обычно через промежуточную кДНК), может быть определена кодируемая в ней аминокислотная последовательность и проведено сравнение соответствующих областей.

Как использовано здесь, полинуклеотид, "полученный из" указанной последовательности, относится к полинуклеотидной последовательности, которая содержит последовательность, примерно, по крайней мере, около 6 нуклеотидов, предпочтительно, по крайней мере, около 8 нуклеотидов, более предпочтительно, по крайней мере, около 10-12 нуклеотидов, и даже более предпочтительно, по крайней мере, около 15-20 нуклеотидов, соответствующих области указанной нуклеотидной последовательности. "Соответствующих" означает гомологичных или комплементарных указанной последовательности. Предпочтительно последовательность области, из которой получен полинуклеотид, гомологична или комплементарна последовательности, которая уникальна для генома HCV. Уникальна или нет последовательность для HCV генома можно определить методами, известными специалистам. Например, последовательность можно сравнить с последовательностями в банках данных (по данным на дату приоритета), например, в Genebank, чтобы определить, присутствует ли она у неинфицированных хозяев или других микроорганизмов. Последовательность можно также сравнить с известными (по данным на дату приоритета) последовательностями других вирусных агентов, включая те, которые, как известно, вызывают гепатит, например НАУ, НВУ и HDV, и представителями семейства Flaviviridae. Соответствие или несоответствие полученной последовательности другим последовательностям можно также определить путем гибридизации в соответствующих строгих условиях. Методы гибридизации для определения комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот известны в данной отрасли. Смотрите, например, Maniatis et al. (1982). Кроме того, неподходящие пары дуплексных полинуклеотидов, образованные при гибридизации, могут быть определены известными методами, включая, например, расщепление нуклеазой, такой как SI, которая специфически расщепляет одноцепочечные области в дуплексных полинуклеотидах. Области, из которых могут быть "получены" типичные последовательности ДНК, включают (но не ограничиваются), например, области, кодирующие специфические эпитопы, так же как и несчитываемые и/или нетранслируемые области.

Полученный полинуклеотид необязательно физически получен из показанной нуклеотидной последовательности, но может производиться другим путем, включая, например, химический синтез или репликацию, или обратную транскрипцию или транскрипцию ДНК. Кроме того, комбинации областей, соответствующих этой указанной последовательности, могут быть модифицированы известными специалистам способами, чтобы соответствовать намеченному применению.

Подобным же образом полипептид или аминокислотная последовательность, "полученная из" указанной аминокислотной или последовательности нуклеиновой кислоты, соответствует полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, идентичную последовательности полипептида, кодируемого в этой последовательности, или его части, причем эта часть состоит из, по крайней мере, 3-5 аминокислот и более предпочтительно, по крайней мере, мере на 8-10 аминокислот, и даже более предпочтительно, по крайней мере, 10-15 аминокислот, или которая способна иммунологически идентифицироваться с помощью полипептида, кодируемого в этой последовательности. Эта терминология также включает полипептид, экспрессируемый указанной последовательностью нуклеиновой кислоты.

Рекомбинантный или производный полипептид необязательно транслируется с указанной последовательности нуклеиновой кислоты; он может производиться другим путем, включая, например, химический синтез или экспрессию рекомбинантной системы экспрессии или выделение из HCV, включая мутированные HCV. Рекомбинантный или производимый полипептид может включать один или более аналогов аминокислот или неприродных аминокислот в своей последовательности. Методы встройки аналогов аминокислот в последовательность известны в этой области науки. Он может также включать одну или более меток, которые известны опытным специалистам.

Термин "рекомбинантный полинуклеотид", так как использован здесь, подразумевает полинуклеотид геномной нДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который благодаря своему происхождению или обработке: (1) не связывается со всем или с частью полинуклеотида, с которым он связывается в природе, (2) соединяется с полинуклеотидом, отличным от того, с которым он связывается в природе, кили (3) не встречается в природе.

Термин "полинуклеотид", который использован здесь, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, или рибонуклеотидов, или дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом этот термин охватывает удвоенные и одноцепочечные ДНК и РНК. Он также заключает в себе известные типы модификаций, например метки, которые известны специалистам, метилирование, "шапочки", замещение одного или более естественно присутствующих нуклеотидов аналогом, межнуклеотидными модификациями, такими как, например, нуклеотиды с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбанаты и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиосаты, фосфородитисаты и т.д.), нуклеотиды, содержащие подвешенные заместители, такие как, например, белки (включая, например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), нуклеотиды с включениями (например, акридином, псораленом и т.д.), нуклеотиды, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), нуклеотиды, содержащие алкилаторы, нуклеотиды с модифицированными связями (например, альфааномерными нуклеиновыми кислотами и т.д.), так же как и немодифицированные формы полинуклеотидов.

"Очищенный" полипептид относится к полипептиду, находящемуся в состоянии, в котором по существу свободен от других полипептидов, т.е. в составе, который содержит минимум около 50% по весу (желаемый полипептид/общее количество полипептидов в композиции), предпочтительно, минимум, примерно 70%, и даже более предпочтительно, минимум, примерно 90% желаемого полипептида, не учитывая непротеиновые материалы в композиции. Методики очистки вирусных полипептидов известны в данной области науки. Очищенным антителам дается подобное же определение.

"Рекомбинантные клетки-хозяева", "клетки-хозяева", "клетка", "клеточные линии", "культуры клеток" и другие такие термины, обозначающие микроорганизмы или линии высших аукариотических клеток, культивируемых как одноклеточные существа, относятся к клеткам, которые могут быть использованы или использовались в качестве реципиентов для рекомбинантного вектора или другого перекоса ДНК, и включают потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Понятно, что потомство единственной родительской клетки может быть необязательно полностью идентично по морфологии или по геномной или общей ДНК хромосомного набора исходной родительской, из-за естественных, случайных или преднамеренных мутаций.

"Репликон" является любым генетическим элементом, например плазмидой, хромосомой, вирусом, космидой и т. д., который ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации внутри клетки; т.е. способна к репликации под своим собственным контролем.

"Вектор" является репликоном, к которому присоединен другой полинуклеотидный сегмент, так чтобы вызвать репликацию и/или экспрессию присоединенного сегмента.

"Управляющая последовательность" относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для воздействия на экспрессию кодирующих последовательностей, с которыми они связаны. Природа таких управляющих последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах также управляющие последовательности в основном включают промотор, сайт связывания с рибосомой и терминаторы; в эукериотах в основном также управляющие последовательности включают промоторы, терминаторы и в некоторых случаях анхансеры. Термин "управляющие последовательности" предназначен для того, чтобы включить в себя, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессий, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых целесообразно, например лидерные последовательности.

"Оперативно связанные" относятся к близкому расположению, при котором компоненты, так названные, находятся в связи, позволяющей им функционировать предназначенным им способом, управляющая последовательность связана таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с управляющими последовательностями.

"Открытая считывающая рамка" (ORF) является областью полинуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид; эта область может представлять часть кодирующей последовательности или общей кодирующей последовательности.

"Кодирующая последовательность" является полинуклеотидной последовательностью, которая считывается на мРНК и/или транслируется в полипептид, когда помещается под управление соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются путем трансляции стартового кодона на 5' - конце и трансляции стоп-кодона на 3'-конце. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничивается мРНК, кДНК и рекомбинантными полинуклеотидными последовательностями.

"Иммунологически идентифицируемый с помощью/как" относится к наличию эпитопа(ов) и полипептида(ов), которые также присутствуют в указанном(ых) полипептиде(ах), обычно белках HCV. Иммунологическая идентичность может быть определена путем связывания с антителами и/или конкуренции при связывании; эти методики известны опытным специалистам.

Употребленный здесь термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте полипептида. Эпитоп мог включать 3 или более аминокислот, которые определяют сайт связывания антитела. В основном эпитоп состоит из по крайней мере 5 аминокислот и иногда состоит из по крайней мере 8 аминокислот. Методы картирования эпитопа известны в этой области науки.

Полипептид является "иммунологически реактивным" с антителом, когда он связывается с антителом благодаря распознаванию антителом специфического эпитопа, содержащегося в полипептиде. Иммунологическая реактивность может быть определена путем связывания антител, более конкретно, при помощи кинетики связывания антител и/или путем конкуренции в связывании с использованием конкурентного(ых) компонента(ов) известного полипептида(ов), содержащих эпитоп, против которого направлено антитело. Методики определения, является ли полипептид иммунологически реактивным с антителом, известны в этой области науки.

Использованный здесь термин "антитело" относится к полипептиду или группе полипептидов, которые содержат по крайней мере один соединяющий антитела сайт. "Соединяющий сайт антитела" или "связывающий домен" формируется в результате складывания различных доменов молекул(ы) антител(а) для образования трехмерных пространственных формирований с внутренней формой поверхности и распределением зарядов, комплементарным этим характерным чертам эпитопа антитела, который дает возможность иммунологической реакции с антигеном. Сайт связывания антитела может формироваться доменом тяжелой и/или легкой цепи (V_н и V₁ соответственно), которые формируют гипервариабельные петли, обеспечивающие связывание антигена. Термин "антитело" включает, например, позвонковые антитела, гибридные антитела, химерные антитела, измененные антитела, неполные антитела, белки Fab и антитела с единственным доменом.

Использованный здесь термин "однодоменовое антитело" (d:b) это антитело, которое включает V_н домен, иммунологически реагирующий с указанным антигеном, dAb не содержит домена V₁, но может содержать другие связывающие антиген домены, которые, как известно, существуют в антителах, например, каппа и лямбда домены. Методы получения dAb известны в этой области. Смотрите, например Ward et. al. (1989).

Антитела могут также содержат V_н и V₁ домены, а также другие известные связывающие антиген домены. Пример этих типов антител и методы их получения известны в этой области науки (смотрите, например, патент США N 4816467, который приведен здесь в виде ссылки) и включают следующее. Например, "позвонковые антитела" относятся к антителам, которые являются тетрамерами или их комплексами, включающими легкие и тяжелые цепи, которые обычно собраны в "у" конфигурацию и которые могут иметь или не иметь ковалентные связи между цепями. В позвонковых антителах аминокислотные последовательности всех цепей конкретного антитела являются гомологичными цепями, обнаруженными в одном антителе, произведенным лимфоцитом, который продуцирует что антитела in situ или in vitro (например, в гибридомах). Позвонковые антитела обычно включают естественные антитела, например очищенные поликлональные антитела и моноклональные антитела. Примеры методов получения этих антител описаны ниже.

"Гибридные антитела" являются антителами, в которых одна пара тяжелых и легких цепей является гомологичной таковым в первом антителе, тогда как другая пара тяжелых и легких цепей гомологична таковым другого второго антитела. Обычно каждая из этих двух пар будет связываться различными эпитопами, в частности, на различных антигенах. Это дает в результате свойство "дивалентности", т.е. способности связывать два антигена одновременно. Такие гибриды могут также образовываться при использовании химерных цепей, как изложено ниже.

"Химерные антитела" - это антитела, в которых тяжелые и/или легкие цепи являются слитыми белками. Обычно константный домен цепей происходит из одного конкретного вида и/или класса, и вареабельные домены происходят из другого вида и/или класса. Сюда также включаются любые антитела, в которых одна из или обе из тяжелых или легких цепей составлены из комбинаций последовательностей, имитирующих последовательности антител из различных источников, являются ли эти источники представителями разных классов, или видов разного происхождения, и так или иначе точка слияния находится на границе вариабельной/константной областей. Таким образом возможно получить антитела, в которых ни константная, ни вариабельная область не имитируют известные последовательности антител. Затем становится возможным, например, построить антитела, вариабельная область которых имеет высокое специфическое сродство к конкретному антигену, или константная область которых может вызывать повышенную фиксацию комплемента, или получать другие улучшения свойств, которыми обладает константная область.

Другим примером являются "измененные антитела", которые относятся к антителам, в которых естественно встречающаяся аминокислотная последовательность в позвонковых антителах изменена. Используя методики рекомбинантной ДНК, антитела могут быть перестроены для получения желаемых характеристик. Возможных изменений много и они варьируют от изменения одной или более аминокислот до полной перестройки области, например константной области. Изменения в константной области в основном предназначены для того, чтобы достичь желаемых характеристик клеточной обработки, т.е. изменений в фиксации комплемента, взаимодействии с мембранами и других эффекторных функций. Могут быть произведены изменения в вариабельной области, чтобы изменить характеристики связывания антигена. Антитела могут быть также сконструированы так, чтобы помочь специфической доставке молекулы или вещества к специфическому клеточному или тканевому сайту. Желаемые изменения могут быть произведены известными в молекулярной биологии методами, например рекомбинантные методики, сайтнаправленный мутагенез и т.д.

Еще один пример, что "неполные антитела", которые являются агрегатами, включающими димер тяжелой цепи/легкой цепи, граничащий с Fc (т.е. константной) областью второй тяжелой цепи. Этот тип антитела исключает антигенную модуляцию. Смотрите, например Glennie et.al. (1982).

В определение антител включаются также "Fab" фрагменты антител. Область "Fab" относится к тем частям тяжелых и легких цепей, которые приблизительно эквивалентны или аналогичны последовательностям, которые содержатся в ответвленной части тяжелых и легких цепей, и которые, как было показано, демонстрируют иммунологическое связывание со специфическим антигеном, но у которых отсутствует эффекторная часть Fc. "Fab" включает агрегаты одной тяжелой и одной легкой цепи (обычно известные как "Fab"), так же как и тетрамеры, содержащие 2H и 2L цепи (называемые F (ab)₂), которые способны селективно реагировать с указанным антигеном или антигенным семейством. "Fab" антитело можно разделить на подсерии, биологические таковым, описанным выше, т. е. "позвонковые Fab", гибридные Fab", "химерные Fab" и "измененные Fab". Методы получения "Fab" фрагментов антител известны в этой области науки и включают, например, протеолиз и синтез с помощью рекомбинантных методик.

В термин "антитела" также включаются одноцепочечные связывающие антиген (SCA) белки, такого типа, который описан в статье в соавторстве с Schlom J. в выпуске Cancer Research от 15 июня 1992 г. (так же как и в статьях, процитированных здесь).

Так, как он использован здесь, термин "иммуногенный полипептид" обозначает полипептид, который вызывает клеточный и/или гуморальный иммунный ответ, один или связанный с носителем в присутствии или отсутствии адъюванта.

Термин "полипептид" относится к полимеру из аминокислот безотносительно к конкретной длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Этот термин также не относится к или не допускается модификации полипептида после экспрессии, например, гликоэклирования, ацетилирования, фосфорилирования и тому подобное. В это определение включаются, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты, и т.д.), полипептиды с замещенными связями, так же как и другие модификации, известные в этой области, как встречающиеся в природе, так и в природе несуществующие.

"Трансформация" так, как использована здесь, относится к встройке экзогенного полинуклеотида в клетку-хозяина, независимо от метода, использованного для встройки, например, прямого поглощения, транслукции, f-спаривания или электропорации. Экзогенный полинуклеотид может быть сохранен в качестве неинтегрированного вектора, например плазмиды, или, напротив, может интегрироваться в геном хозяина.

"Лечение" так, как употребляется здесь, относится к профилактике и/или терапии.

"Индивидуум" так, как используется здесь, относится к позвоночным, конкретно к представителям видов млекопитающих, и включает, но не ограничивается животными (например, собака, кошка, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, кролики, мыши, крысы, морские свинки и т.д.) и приматами, включая обезьян, шимпанзе, бабуинов и людей.

Использованный здесь термин "смысловая цепь" нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая имеет токологию с последовательностью мРНК. "Антиосмысловая цепь" содержит последовательность, которая комплементарна последовательности "смысловой цепи".

Так, как использован здесь "геном с положительной цепью" вируса - это такой геном, в котором или РНК или ДНК является одноцепоч