Способ получения полипептидов в бесклеточной системе (варианты) и устройство для его осуществления

Способ получения полипептидов в бесклеточной системе (варианты) и устройство для его осуществления

Реферат

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии. Сущность изобретения состоит в том, что в процессе синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансляции разделяют входные и выходные по отношению к реакционному объему потоки на низкомолекулярные и высокомолекулярные фракции. Осуществляют выбор направления и скорости потоков через реакционный объем, который сформирован внешними поверхностями первого и второго пористых барьеров, внутренние поверхности которых сопряжены с зонами ввода/вывода потоков. Объектом изобретения является реактор, содержащий реакционный объем, внешние поверхности которого сопряжены с внешней поверхностью первого и второго пористых барьеров, внутренняя часть второго пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков, внутренняя часть первого пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков и потоков, содержащих высокомолекулярные компоненты, включающие целевой полипептид. Данная технология позволяет увеличить выход синтезируемого полипептида. 4 с. и 26 з.п.ф-лы, 11 ил.

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам и устройствам для синтеза полипептидов в бесклеточных системах.

Уровень техники.

Известны способы синтеза полипептидов в бесклеточных системах. Для устранения ограничений, связанных с низким выходом целевого полипептида и малым сроком работы бесклеточных систем, был предложен метод (Spirin et al., 1988), в основе которого заложен принцип непрерывного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного восстановления исходной концентрации низкомолекулярных веществ, расходуемых в процессе синтеза. Этот метод лег в основу нескольких изобретений, связанных с его усовершенствованием для увеличения выхода синтезируемого продукта (Алахов и др., 1991; Баранов и др. , 1993: Alakhov et al., 1995).

По способу ввода питающей смеси и вывода продуктов синтеза известные технические решения можно подразделить на: а) способы, в которых используют процесс диализа для обмена с питающей средой и для вывода из реакционной смеси через диализную мембрану низкомолекулярных продуктов или для одновременного вывода низко- и высокомолекулярных продуктов; б) способы, в которых используют процесс непрерывной ультрафильтрации для одновременного вывода низко- и высокомолекулярных продуктов через мембрану при одновременном принудительном вводе питающей среды непосредственно в объем реакционной смеси или через мембрану; в) способы, в которых применяют периодический ввод питающей смеси внутрь реакционной смеси и последующий вывод низко- и высокомолекулярных продуктов через мембрану. Ввод и вывод потоков осуществляют путем изменения направления жидкостных потоков за счет последовательного создания импульсов положительного или отрицательного давления.

Известен способ (Mozayeny, 1995), в котором совершенствуют отвод продуктов с большой молекулярной массой путем увеличения площади ультрафильтрационной мембраны по отношению к объему реакционной смеси. Одним из главных недостатков данного изобретения является то, что через большую площадь мембраны размером пор от 70 до 100 кД вместе с конечным продуктом удаляются необходимые для работы компоненты бесклеточной системы с молекулярной массой до 100 кД. Это в конечном итоге ограничивает время работы бесклеточной системы. Чем больше площадь мембран, тем больше высокомолекулярных компонентов бесклеточной системы вымываются из объема реактора при большой скорости протока. К другому недостатку можно отнести то, что для создания тангенциального потока вдоль поверхности мембран реакционную смесь выводят за пределы реактора. Во время прохождения реакционной смеси по жидкостным коммуникациям на работу бесклеточной системы оказывают влияние три фактора: а) в нее не поступает питающая смесь; б) из нее не выводятся продукты ингибирования; в) жидкостные коммуникации и насос не термостатируются и реакционная смесь меняет свою температуру в зависимости от окружающей среды. Все это приводит к невоспроизводимости результатов и ограничивает время жизни бесклеточной системы.

Известен способ (Fischer et al., 1990), авторы которого предлагают осуществлять многократный импульсный ввод питающей смеси в реакционный объем и отвод низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов синтеза из реакционного объема в объем с питающей смесью путем изменения направления движения потока жидкости, проходящей через мембрану. Одним из главных недостатков данного изобретения является то, что низкомолекулярные продукты синтеза, ингибирующие работу системы, не выводят за пределы реактора в течение длительного периода времени. Этот период определяется как время, за которое осуществляют многократное перемещение питающей смеси через мембрану в суммарном объеме, равном полному объему реакционной смеси. С этой целью формируют N циклов по созданию положительного и отрицательного давления. За счет модуляции давления ингибирующие продукты вводят обратно в реакционный объем с очередной порцией питающей среды. Другой недостаток предложенного технического решения связан с тем, что во время формирования N циклов из реакционной смеси интенсивно вымывают высокомолекулярные компоненты бесклеточной системы, необходимые для длительного синтеза. Таким образом, многократное возвращение в реакционный объем низкомолекулярных компонентов, ингибирующих работу системы, и вывод из рабочего объема высокомолекулярных компонентов, определяющих эффективный синтез, приводит к ограничению работы системы.

Известен способ (Choi, 1997), по которому осуществляют синтез полипептидов с отводом целевого продукта в диализном режиме работы. С этой целью реактор разгораживают мембраной на две части. С одной стороны мембраны располагают реакционную смесь, с другой стороны мембраны размещают питающую смесь, которую быстро прокачивают вдоль поверхности мембраны в тангенциальном направлении. К недостаткам данного способа можно отнести то, что за счет больших размеров пор из реакционного объема вместе с целевыми продуктами синтеза выводят компоненты системы. Кроме того, хотя через большие поры мембраны диализ проходит более эффективно, его величина недостаточна для работы высокоэффективных бесклеточных систем.

Известен способ (Алахов и др., 1991), по которому в реакционный объем в процессе синтеза подают аминокислоты, GTP, АТР, и отбирают низкомолекулярные продукты: АМР, GDP, Pi, образующиеся в процессе синтеза и ингибирующие систему. Отбор синтезируемого полипептида производят через мембрану. Для более экономичной работы низкомолекулярные продукты проводят через систему регенерации и возвращают в реакционный объем через мембрану. Из текста описания и приведенного рисунка не достаточно ясно, каким образом осуществляют отвод низкомолекулярных продуктов синтеза из реакционного объема и каким образом буферный раствор после отбора полипептида поступает в систему регенерации. Если учитывать описание примеров, то в данном техническом решении используют общий вывод высокомолекулярных (целевого полипептида) и низкомолекулярных продуктов реакции через общую ультрафильтрационную мембрану. Использование ультрафильтрационной мембраны описано в ряде статей (Spirin et al., 1988; Spirin, 1992; Takanori et al., 1991; Erdmann et al., 1994). К недостаткам такого способа можно отнести то, что за счет больших размеров пор из реакционного объема вместе с целевыми продуктами синтеза выводят высокомолекулярные компоненты системы, необходимые для синтеза. Входной поток низкомолекулярной питающей смеси равен по объему выходному потоку низкомолекулярных и высокомолекулярных компонентов, что приводит к быстрому закрытию пор ультрафильтрационной мембраны.

Известны способы подачи питающей смеси в реакционную зону и вывода из нее продуктов реакции для разных типов мембранных реакторов, в которых реакционную зону размещают между двумя мембранами (Wrasidlo et al., 1990; Matson et al., 1988; Dziewulski et al., 1992).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ, описанный в патенте (Alakhov et al., 1995). Для синтеза полипептидов в режиме с отбором продукта используют две плоских мембраны, между которыми размещают реакционную смесь. Мембраны разграничивают потоки низкомолекулярных и высокомолекулярных компонентов и разделяют объем реактора на три зоны: зону ввода питающей смеси; реакционную зону; зону отвода продукта. Первый относительно слабый поток формируют в реакционной зоне. Он обеспечивает перемещение реакционной смеси вдоль внутренней части пористых барьеров, через которые выходят высокомолекулярные продукты (в том числе синтезируемые полипептиды). Второй быстрый поток формируют в зоне ввода питающей смеси. Он обеспечивает подачу через мембрану низкомолекулярных компонентов питания в реакционную систему. Быстрый поток низкомолекулярных компонентов и медленный поток высокомолекулярных компонентов осуществляют, например, за счет создания тангенциального потока вдоль внешней поверхности первого пористого барьера и проникновения низкомолекулярных компонентов питающей среды в зону синтеза. Если высокомолекулярные компоненты выводят из реакционного объема, то размер пор выбирают в пределах 50-100 кД (что подтверждается примером 7). К недостатку способа относится то, что скорость проникновения компонентов питающей смеси в реакционный объем, определяемая в большей степени процессом диализа, недостаточна для обеспечения длительной работы высокоэффективных бесклеточных систем.

Существует разница в требованиях к устройствам для научных исследований и для синтеза в препаративных количествах. Для синтеза небольшого количества полипептидов, в пределах 100-200 мкг, необходим простой и дешевый реактор, который может обеспечить синтез в течение 20-50 часов без применения дорогостоящего оборудования, с возможностью выбора скоростей потоков вручную или с помощью блоков управления.

Во время синтеза полипептидов в препаративных количествах устройство должно позволять контролировать процесс, управлять скоростями потоков внутри реактора, обеспечивать возможность длительной (более 50 часов) работы за счет активного перемешивания или проведения действий, препятствующих забиванию пор в мембранах или полых волокнах, обеспечивать эффективный подвод питающей смеси и эффективный отвод низкомолекулярных продуктов реакции, ингибирующих синтез, а также осуществлять дополнительный ввод расходуемых высокомолекулярных компонентов системы. Известно устройство (Mozayeny, 1995), которое управляет системой для непрерывного синтеза пептидов с помощью компьютера. В состав системы входит сложное и дорогое оборудование (автоматический пробоотборник и др.). Однако недостатки способа управления потоками высокомолекулярных и низкомолекулярных продуктов синтеза и компонентов системы не дают эффективно использовать возможности системы управления и контроля процесса.

Конструкции известных устройств предполагают наличие одного реакционного объема, величина которого колеблется в пределах от 1,0 (Spirin at al., 1988) до 100,0 мл (Spirin, 1992).

Используя принцип разбиения общего объема реактора на ряд реакторов меньшего объема, возможно применить одинаковые решения для устройств, предназначенных для синтеза полипептидов в лабораторных условиях и для препаративного синтеза. В этом случае отработанные технологии синтеза полипептидов в небольших объемах реакционной смеси от 50 мкл до 1-5 мл можно перенести на работу с объемами до 100-200 мл за счет масштабирования и увеличения количества параллельно работающих модулей.

Известны устройства для поддержания синтеза в клетках (Puchinger et al., 1980; Gebhard et al., 1997; Hu et al., 1997), использующие этот принцип. В этих устройствах входы для подачи питающей смеси и выходы для отвода продуктов соединены параллельно для всех N реакционных объемов. Известные устройства ориентированы на поддержание роста клеток и их нельзя применить для синтеза полипептидов, так как каждый из N реакционных модулей ориентирован на обеспечение скорости, давления и других параметров потоков питательных сред и газа, необходимых для нормального функционирования клеток.

Известные модули для биореакторов на основе полых волокон (Gebhard et al. , 1997; Hu et al., 1997) не учитывают специфику работы с бесклеточной системой. Используемые волокна имеют одинаковый размер пор и выполнены в форме склеенного пучка, установленного в цилиндрический объем. При этом значительная часть поверхности полых волокон соприкасается друг с другом и уменьшает рабочую поверхность.

Известно устройство (Yagihashi et al., 1996), при изготовлении которого используют двухслойную конструкцию из полых волокон. Каждый слой сформирован из предварительно склеенных параллельно размещенных полых волокон. Оба слоя полых волокон имеют одинаковый размер пор и значительная часть их поверхности соприкасается друг с другом.

Известно устройство (Pedersen et al., 1994), в котором отдельные модули выполняют в виде однослойных конструкций из полых волокон с одним размером пор. Однако это техническое решение разработано для условий фильтрации жидкостей и не может быть использовано в реакторах без значительного изменения конструкции, так как рассчитано на работу с большими объемами жидкостных потоков.

Известно большое число конструкций, выполненных на основе полых волокон (Hargitay, 1982, Hanai, 1993) и плоских мембран. Они также обладают рядом недостатков, так как ориентированы в основном на фильтрацию или диализ.

Известно устройство для синтеза полипептидов в бесклеточной системе, в состав которого входят две плоские мембраны (Mozayeny, 1995). Это устройство (OMEGA^TM) первоначально было предназначено для фильтрации и обладает большим мертвым объемом в зонах отбора продукта, кроме того, вход и выход в реакционный объем осуществляется из одной точки, что влияет на питание реакционной смеси в зонах, в которых доступность питающей смеси ограничена из-за формирования однонаправленного потока. Кроме того, это устройство не предназначено для сборки в общую конструкцию, состоящую из N модулей.

Наиболее близким к предлагаемому устройству для синтеза полипептидов является устройство, описанное в патенте (Alakhov et al., 1995). Для синтеза полипептидов в режиме с отбором продукта устройство содержит два пористых барьера. Эти барьеры могут быть выполнены в виде плоских мембран или полых волокон. Реакционная смесь может находиться как с внешней, так и с внутренней стороны полых волокон.

Недостатком данного устройства является то, что оно содержит пористые барьеры с одинаковым размером пор и позволяет осуществить вывод из реакционного объема одного потока, состоящего или из низкомолекулярной (при размере пор 7,5 кД), или из высокомолекулярной (при размере пор до 100 кД) фракций.

Сущность изобретения.

Настоящее изобретение описывает метод синтеза полипептидов в бесклеточной системе, в котором продукты синтеза разделяют на фракцию низкомолекулярных компонентов и фракцию высокомолекулярных компонентов, включающую целевой полипептид. Основную часть низкомолекулярной фракции выводят по крайней мере через одну часть второго пористого барьера. Выбирают отношение величины объема фракций питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов к объему фракции, содержащей целевой полипептид, и устанавливают режимы ввода фракций питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционный объем.

Дополнительным объектом данного изобретения является метод синтеза полипептидов в бесклеточной системе, в соответствии с которым фракцию низкомолекулярных компонентов, которая содержит низкомолекулярные компоненты реакционной смеси и низкомолекулярные компоненты синтеза, выводят из реакционного объема только через по крайней мере один второй пористый барьер, выбирают режим ввода питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов.

Другим объектом изобретения является метод для получения полипептидов, в соответствии с которым в течение синтеза формируют N циклов, каждый из которых состоит по крайней мере из двух шагов, на первом шаге низкомолекулярные компоненты питающей смеси вводят в реактор через первый пористый барьер, а фракцию низкомолекулярных продуктов синтеза и компонентов реакционной смеси выводят через второй пористый барьер, на втором шаге переключают каналы подачи питающей смеси и отвода компонентов и низкомолекулярные компоненты питающей смеси вводят в реактор через второй пористый барьер, низкомолекулярную фракцию или фракцию высокомолекулярных компонентов, содержащую продукты синтеза и компоненты реакционной смеси, выводят из реакционного объема через первый пористый барьер, устанавливают режимы ввода питающей смеси и расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционный объем.

Следующим объектом настоящего изобретения является реактор, который содержит по крайней мере один реакционный объем, в котором внешние поверхности сопряжены с внешней поверхностью первого и второго пористых барьеров, внутренняя часть второго пористого барьера соединена с зоной ввода или вывода низкомолекулярных потоков, внутренняя часть первого пористого барьера соединена с зоной ввода или вывода низкомолекулярных потоков и потоков, содержащих высокомолекулярные компоненты, включающие целевой полипептид.

Краткое описание чертежей.

В дальнейшем изобретение поясняется примерами выполнения со ссылками на прилагаемые чертежи.

На фиг.1 (а - д) приведены принципы распределения потоков для разных режимов работы.

На фиг. 2 (а - е) приведены структурные схемы реакторных модулей, основанных на заявляемом принципе.

На фиг.3 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме без отбора продукта.

На фиг. 4 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме с отбором продукта.

На фиг. 5 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме с отбором продукта с трехслойным модулем.

На фиг. 6 приведена структурная схема устройства для синтеза в режиме с периодическим отбором продукта.

На фиг.7 изображена гистограмма, отражающая количество GFP во фракциях, собранных в ходе синтеза, описанного в примере 1.

На фиг. 8 изображен график зависимости изменения концентрации синтезируемого GFP от продолжительности времени синтеза в контрольной аликвоте.

На фиг.9 приведена фотография гель-электрофореза по данным примера 1.

На фиг. 10 изображен график зависимости изменения концентрации синтезируемого GFP от продолжительности времени синтеза в контрольной аликвоте для примера 2.

На фиг. 11 приведена фотография гель-электрофореза по данным примера 2.

Перечень сокращений.

1. F1 - поток питающей смеси.

2. F10- F20 - потоки низкомолекулярных продуктов реакционной смеси.

3. P_s - синтезируемый целевой полипептид.

4. P_c - высокомолекулярные компоненты системы.

5. R_M - реакционная смесь.

6. Позиции 100 относятся к конструктивным элементам реактора.

7. Позиции 200 относятся к жидкостным коммуникациям устройства.

8. Позиции 300 относятся к отдельным элементам устройства: кранам, насосам, емкостям для сбора элюата и емкостям для хранения питающей смеси.

9. Позиция 400 относится к блоку управления.

Детальное описание изобретения В общем случае процесс может содержать все из перечисленных ниже шагов: 1. Создают реакционную смесь на основе бесклеточных лизатов и экстрактов эукариотов или прокариотов. Формируют питающую смесь.

2. Определяют режим работы реактора, который содержит по крайней мере один реакционный объем, в котором внешние поверхности объема формируются внешними поверхностями пористых барьеров, внутренняя часть второго пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков, внутренняя часть первого пористого барьера соединена с зоной ввода/вывода низкомолекулярных потоков и потоков, содержащих высокомолекулярные компоненты. Соотношение площадей первого и второго пористых барьеров лежит в пределах от 1 до 10.

3. Помещают реакционную смесь в каждый из реакционных объемов модулей. Реакционный объем выбирают в пределах от 50 мкл до 10 мл и толщину реакционного слоя в пределах от 0,1 мм до 5 мм. В зависимости от условий синтеза в реакционном объеме размещают или реакционную смесь, или реакционную смесь и магнитную мешалку, или реакционную смесь, в которую вводят пористый сепаратор, или размещают реакционную смесь с введенными в нее пористыми гранулами. Тип пористого сепаратора выбирают из группы пористых материалов с размером пор от 200 мкм до 10 нм, выполненных в форме одиночных или многослойных капиллярных структур в форме пучков или листов, или в виде композиции слоистых материалов и пористых частиц, нанесенных на поверхность слоев или волокон, из которых состоят слоистые материалы. В зависимости от условий синтеза тип пористых гранул выбирают или из аффинных сорбентов (которые используют отдельно или иммобилизируют на поверхности слоистых структур), или используют гранулы, внутри которых иммобилизированы компоненты бесклеточной системы.

4. В зависимости от режима работы определяют и устанавливают скорости протока и направление подачи питающей среды в реакционную смесь и в режиме вывода целевого полипептида выбирают соотношение объемов питающей смеси и фракции, включающей целевой полипептид, в пределах от 1 до 100. Определяют направление подачи питающей смеси, которую вводят или непосредственно через вход в реакционный объем, или через поры пористого барьера, или одну часть питающей смеси вводят через вход в реакционный объем, а другую часть вводят через поры пористого барьера.

5. При выборе режима работы с вводом расходуемых высокомолекулярных компонентов в реакционную смесь определяют состав фракции и способы ввода расходуемых высокомолекулярных компонентов. Состав фракции расходуемых высокомолекулярных компонентов выбирают из группы, состоящей из рибосомной фракции, или бесклеточного экстракта (S30, S100 или их модификаций), или полимераз, плазмид, tRNA. Эти компоненты вводят в реакционную смесь вместе с питающей смесью по отдельности или в комбинации друг с другом. В зависимости от способа ввода фракцию расходуемых высокомолекулярных компонентов вводят в реакционную смесь до синтеза, или один раз в течение синтеза, или периодически в течение синтеза, или добавляют непрерывно в течение синтеза.

6. Проводят синтез, осуществляя разделение потоков низкомолекулярных и высокомолекулярных продуктов, в процессе синтеза непрерывно или периодически отбирают через пористый барьер высокомолекулярные продукты или оставляют их в реакционном объеме.

7. В процессе синтеза анализируют уровень выхода синтезируемого продукта, корректируют параметры, определяющие скорости потоков питающей смеси и синтезируемого продукта.

На фиг.1 (а-д) показаны структурные схемы, объясняющие принцип разделения потоков между фракцией низкомолекулярных компонентов и фракцией, содержащей высокомолекулярные компоненты вместе с целевым полипептидом, для разных режимов работы.

На фиг.1a приведена структурная схема разделения потоков внутри модуля в режиме непрерывного отбора целевого полипептида. Реакционный модуль содержит корпус 100, внутри которого с помощью первого пористого барьера 110 и второго пористого барьера 120 формируют три зоны. Перед началом синтеза в реакционную зону 130 вводят реакционную смесь R_M. Поток питающей смеси F1 проходит через вход 151 в зону 130 и вытесняет высоко- и низкомолекулярные компоненты синтеза из реакционной смеси через первый и второй пористые барьеры. Основная часть низкомолекулярной фракции проходит через второй пористый барьер 120 с малым размером пор, формируя поток F20, который удаляют из реактора через выход 142. Одновременно с этим высокомолекулярные продукты синтеза P_s, часть высокомолекулярных компонентов бесклеточной системы P_c и часть низкомолекулярных компонентов F10 формируют суммарный поток P_c+P_s+F10, который вытесняется через пористый барьер 110 с большим размером пор и выводится из реактора через выход 162. Перед началом синтеза выбирают соотношение между общей величиной объема питающей смеси, которую вводят в реактор, и величиной объема суммарного потока P_c+P_s+F10 в пределах от 1 до 100. Предпочтительно, если это соотношение лежит в пределах от 10 до 50. Снижение скорости потока через первый барьер 110 приводит к ослаблению процесса формирования слоя высокомолекулярных компонентов над поверхностью пористого барьера 110, приводящего к закрытию пор высокомолекулярными и низкомолекулярными продуктами синтеза. Кроме того, снижение величины потока P_c+P_s+F10 приводит к уменьшению отбора из реакционной смеси высокомолекулярных компонентов P_c, необходимых для синтеза, и способствует повышению концентрации синтезируемого полипептида P_s в реакционной смеси. Это позволяет вести отбор более концентрированного продукта, что способствует его очистке. Размеры пор первого барьера 110 выбирают в зависимости от величины молекулярного веса синтезируемого полипептида и его пространственной организации.

На фиг. 1б приведена структурная схема формирования низкомолекулярных и высокомолекулярных потоков внутри модуля в режиме периодического отбора продукта. Реакционный модуль содержит корпус 100, внутри которого с помощью первого пористого барьера 110 и второго пористого барьера 120 формируют три зоны. Перед началом синтеза в реакционную зону 130 через вход 151 вводят реакционную смесь R_M. В процессе синтеза формируют N циклов ввода/вывода потоков через пористые барьеры 110, 120. Каждый цикл состоит из двух шагов. Во время первого шага через вход 161 и первый барьер 110 в реакционный объем 130 вводят поток питающей смеси F1. Низкомолекулярные компоненты питающей смеси проникают в реакционную смесь и вытесняют из объема реакционной смеси низкомолекулярные продукты синтеза, которые формируют поток F20, проходящий через пористый барьер 120 и выход 142. Во время второго шага переключают направление ввода/вывода потоков через пористые барьеры 110, 120. Через вход 141 и второй барьер 120 в зону 130 вводят поток питающей смеси F2. Низкомолекулярные компоненты питающей смеси проникают в реакционную смесь и вытесняют из объема реакционной смеси высокомолекулярные и низкомолекулярные продукты синтеза и часть компонентов системы, которые проходят через пористый барьер 110, выход 162 и формируют поток P_c+P_s+F10. По окончании второго шага цикл заканчивается и начинается следующий или синтез останавливают. Соотношение между общим объемом питающей смеси, которую вводят в реактор в течение N циклов, к величине объема суммарного потока P_c+P_s+F10 выбирают в пределах от 1 до 100. Предпочтительно, если это соотношение лежит в пределах от 10 до 50.

Снижение скорости потока через первый барьер 110 приводит к ослаблению процесса формирования слоя высокомолекулярных компонентов над поверхностью пористого барьера 110, что приводит к снижению процесса закрытия пор высокомолекулярными и низкомолекулярными продуктами синтеза. Концентрация синтезируемого полипептида P_S в реакционной смеси возрастает, что способствует следующему шагу очистки полипептида. Размеры пор первого барьера 110 выбирают в зависимости от величины молекулярного веса синтезируемого полипептида и его пространственной организации. Первый и второй пористые барьеры очищаются благодаря изменению направления потоков через пористые барьеры. Длительность цикла и временные соотношения между длительностью первого и второго шага сохраняют постоянными в ходе всего синтеза или меняют в зависимости от условий эксперимента синтеза. Если синтез идет активно и концентрация полипептидов в объеме реакционной смеси быстро возрастает, то для предотвращения закрытия пор снижают длительность каждого цикла, что автоматически приводит к более частой очистке пор.

На фиг.1в показана схема направления потоков в режиме работы без отбора продуктов. В процессе синтеза все высокомолекулярные компоненты остаются внутри реакционной смеси. Поток питающей смеси F1 вводят через первый пористый барьер 110, который имеет размеры пор до 1000 кД. При этом поток низкомолекулярных продуктов синтеза F10, ингибирующих систему, выводят через второй пористый барьер 120. Первый пористый барьер играет роль распределителя потока F1 и обеспечивает равномерный ввод питающей смеси во все точки реакционной смеси.

На фиг.1г показана схема направлений потоков в режиме работы без вывода отбора целевого продукта из реакторного модуля, который имеет по крайней мере один первый пористый барьер и два вторых пористых барьера. В течение синтеза поток питающей смеси F1 и/или часть расходуемых высокомолекулярных компонентов проникают через поры первого пористого барьера 110, который имеет размер пор до 1000 кД. Этот пористый барьер используется как распределитель потока F1 и обеспечивает ввод питающей смеси во все точки реакционной смеси. Поток F10 низкомолекулярных продуктов, которые ингибируют работу бесклеточной системы, выводят через две части второго пористого барьера 121-122, который имеет размер пор до 30 кД.

На фиг. 1д приведены направления потоков в режиме с выводом целевого продукта из реакционного модуля, который имеет по крайней мере один пористый барьер и две части второго пористого барьера. В процессе синтеза все высокомолекулярные компоненты, включая целевой полипептид, выводят из реакционной смеси через первый пористый барьер 110, который имеет размер пор до 100 кД. Поток питающей смеси F1 вводят через одну часть второго пористого барьера 121, который имеет размер пор до 30 кД. Этот пористый барьер используется как распределитель потока F1 и обеспечивает равномерный ввод питающей смеси во все точки реакционной смеси. Поток F10 низкомолекулярных продуктов, которые ингибируют работу бесклеточной системы, выводят через вторую часть второго пористого барьера 122, который имеет размер пор до 30 кД.

Для реализации рассмотренного способа предлагается несколько вариантов устройства реакторного модуля, который может обеспечивать работу реакторной системы в разных режимах. Устройство модуля должно позволять выполнение нескольких условий: 1. В каждой точке реакционного объема должно одновременно осуществляться два процесса: а) ввод питающей среды, б) отвод низкомолекулярных продуктов, ингибирующих процесс синтеза.

2. Ввод питающей среды и отвод низкомолекулярных продуктов должен осуществляться за время, в течение которого синтез не снижается ниже допустимого значения.

3. Устройство должно позволять эффективную очистку пор мембран или полых волокон и содержать минимум мертвых объемов в жидкостных коммуникациях для ввода/вывода высоко- и/или низкомолекулярных компонентов и/или продуктов синтеза.

Для выполнения первого и второго условий предпочтительной является конструкция модуля реактора, в которой осуществляют формирование тонких слоев реакционной смеси любой формы. Толщину слоя выбирают в пределах от 0,1 до 10 мм из условия того, что при заданных площадях первого и второго пористых барьеров и выбранных размеров пор барьеров средняя скорость ввода питающей среды в реакционный объем обеспечивает ввод компонентов питающей смеси в максимально удаленные точки реакционной смеси за время, в течение которого концентрация питающей среды в удаленных точках снижается до допустимого уровня, а концентрация низкомолекулярных компонентов, ингибирующих процесс синтеза, не превышает допустимый уровень.

Для устройств, работающих в режиме непрерывного отбора продукта, в которых питающая смесь и/или расходуемые высокомолекулярные компоненты подаются непосредственно в реакционный объем через по крайней мере один вход, предпочтительно использовать дополнительное перемешивание в зоне реакционного объема. Такое перемешивание может быть обеспечено с помощью вращения магнитной мешалки или перемещения реакционной смеси через внешнюю замкнутую петлю или другими методами.

Для устройств, в которых формируют тонкий слой реакционной смеси, предпочтительной является конструкция модуля, в которой используют прокладку между пористыми барьерами. Разный тип прокладок может быть использован и выбран из группы одиночных или многослойных слоев, капиллярных материалов, комбинации слоев из капиллярных материалов и пористых частиц, это могут быть одно- и многослойные листы из органических, синтетических или керамических материалов, металлов или их композиций с пористыми частицами, расположенными между слоями. Другие типы прокладок могут быть выбраны из полых волокон. Фильтры, широко используемые для фильтрации и выполненные из разных сортов целлюлозы, и фильтры, выполненные из синтетических полимерных материалов, керамики, пористых металлов или их композиций, могут быть также использованы как прокладки. Роль слоистых капиллярных материалов состоит не только в функции разделения двух пористых барьеров, но и в увеличении площади, на которой происходит соударение молекул, что ведет к возрастанию скорости реакций, связанных с синтезом (Alberts et al., 1983).

Более дредпочтительно использовать иммобилизированные пористые частицы, которые нанесены на поверхность слоистых, капиллярных структур. Диаметр волокон выбирают от 0,1 до 0,001 по отношению к диаметру полых волокон. На волокна наносят частицы из пористых материалов с размерами пор от 200 мкм до 10 нм. В случае, когда в качестве первого и/или второго пористых барьеров используют полые волокна, размещение направления волокон слоистых материалов осуществляют либо вдоль полых волокон, занимая пространство между ними, или под углом к центральным осям полых волокон в диапазоне до 90^o (т.е. поперек слоев полых волокон). В группу материалов, из которых могут быть изготовлены пористые частицы, входят (Choi et al., 1997): полимерные материалы (целлюлоза, желатин, коллаген), металлические компаунды и неорганические оксиды (алюминий, кремнезем, титан, цирконий, молибден, ванадий, кобальт) и различные цеолиты. Пористые частицы могут быть использованы в виде гранул (Ovodov et al. , 1995) на основе отрицательно заряженных полисахаридов и положительно заряженных полимеров, образующих с полисахаридами полиэлектролитные комплексы. Такие комплексы могут быть образованы, например, альгинатом Na и поли-L-лизином, альгинатом Na и хитозаном, пектином и полиимином, пектином и хитозаном. В качестве материалов могут быть использованы пористые частицы, используемые в хроматографии, в частности афинные сорбенты могут быть использованы для создания пористой среды в реакционном объеме и отбора из реакционной смеси целевого полипептида в течение синтеза. Ограничения в использовании пористых материалов связаны с их химической активностью и возможностью ингибирования синтеза.

В варианте, когда бесклеточную систему иммобилизируют в гранулы (Ovodov et al. , 1995; Alakhov et al., 1995), предпочтительной является конструкция реакторного модуля, которая позволяет нанесение на поверхность пористого барьера нескольких слоев микрокапсул с иммобилизированной бесклеточной системой для заполнения ими всего реакционного объема. В этом случае формируется достаточно тонкий слой микрокапсул, определяемый высотой реакционного объема, что позволяет вводить питающую смесь в зону синтеза и выводить низкомолекулярные продукты с оптимальной скоростью.

На фиг. 2а-2е показаны варианты формирования тонких слоев внутри объема модуля реактора с использованием в качестве пористых барьеров плоских полупроницаемых мембран и полых волокон.

На фиг.2а приведен вариант, когда тонкие слои реакционной смеси формируют: между плоской поверхностью мембраны 120 и цилиндрическими поверхностями полых волокон, которые выполняют роль первого барьера 110 и сформированы в виде как минимум одного слоя параллельных полых волокон. Количество полых волокон зависит от размеров пор первого и второго барьеров, а также диаметра полых волокон, определяющего их площадь. При соотношении размеров пор первого и второго барьеров в пределах от 3 до 10 площадь первого барьера выбирается в пределах от 0,2 до 1,0 от площади второго барьера.

На фиг.2б приведен вариант, ко