Гуманизированный иммуноглобулин, специфичный для белка l- селектина человека

Гуманизированный иммуноглобулин, специфичный для белка l- селектина человека

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается гуманизированного иммуноглобулина, специфичного для белка L-селектина человека. Сущность изобретения состоит в том, что гуманизированный иммуноглобулин, специфичный для белка L-селектина человека, представляет собой химерный иммуноглобулин, имеющий области, определяющие комплементарность (CDR), соответствующие CDR-областям донорного мышиного иммуноглобулина, и каркасные области вариабельного района тяжелой и легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека, и специфически связывающийся с L-селектином человека с константой аффинности 10⁷ M^-1. Изобретение позволяет получить неиммуногенный для человека иммуноглобулин специфичный для белка L-селектина. 2 с. и 17 з.п. ф-лы, 6 ил. , 1 табл.

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки США рег. N 07/983946, поданной 12/1/92, которая во всех случаях и во всей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Изобретение относится к комбинированным технологиям рекомбинантных ДНК и моноклональных антител, используемых для разработки новых биологических материалов, а в частности, для продуцирования неиммуногенных (для человека) иммуноглобулинов, специфичных для белка L-селектина, а также к использованию указанных иммуноглобулинов in vitro и in vivo.

Способность клеток к взаимной адгезии играет важную роль в созревании, нормальной физиологии и в патологических процессах. Указанная способность опосредуется факторами адгезии, в основном, гликопротеинами, экспрессированными на клеточных мембранах. Во многих случаях, фактор адгезии на одном типе клетки связывается с другим фактором адгезии, экспрессированным на другом типе клеток, образуя пару "контррецептор-рецептор". Существует три основных класса факторов адгезии, а именно интегрины, селектины и члены суперсемейства иммуноглобулинов (Ig) (см. работы Springer, Nature 346:425 (1990); Osborn, Cell 62:3 (1880); Hynes, Cell 69:11 (1992), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Указанные молекулы имеют особенно важное значение для взаимодействия лейкоцитов и тромбоцитов друг с другом, с внеклеточным матриксом и васкулярным эндотелием.

Интегрины представляют собой гетеродимерные трансмембранные гликопротеины, состоящие из -цепи (120-180 кДа) и -цепи (90-110 кДа), имеющих, в основном, короткие цитоплазматические домены. Все - субъединицы имеют гомологичную последовательность и содержат общие элементы, также как и -субъединицы. Три известных интегрина, содержащих -субъединицу, обозначаемую ₂, играют важную роль в функции Т-клеток, нейтрофилов и моноцитов. LFA-I (_L2) широко распространен на лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах. Его контррецептор представляет собой молекулу ICAM-1 (и, вероятно, молекулу меньшего значения ICAM-2), принадлежащую к семейству Ig, которая экспрессируется на многих клетках, включая лейкоциты, и активируется на васкулярном эндотелии цитокинами, такими как TNF и IL-1. Блокирование LFA-1 на T-клетках антителами к - или -субъединице в значительной степени ингибирует адгезивно-зависимые функции, такие как CTL-опосредованный лизис клеток-мишеней. Mac-1 (_M2) располагается на нейтрофилах и моноцитах, а его контррецептором также является ICAM-1 (а возможно ICAM-2). Кроме того, Mac-1 представляет собой рецептор активированного комплемента 3 (CR3) и связывается с C3bi-фрагментом. Третий ₂-интегрин, P15095 (_x2), также находится на нейтрофилах и моноцитах, но, по всей вероятности, он играет менее значительную роль. -Субъединицы, LFA-1, Mac-1 и P150.95 имеют также соответствующие CD - обозначения CD11a, CD11b и CD11c, а ₂ обозначается также CD18, так что LFA-1 представляет собой CD11a/CD18, а Mac-1 представляет собой CD11b/CD18.

Существует три известных селектина, которые ранее обозначались LECCAM, а в настоящее время обозначаются как L-селектин (именуемый также LECCAM-1, Меl-14 или LAM-1), E-селектин (именуемый также ELAM-1) и P-селектин (именуемый также GMP140 или PAD GEM). Все указанные селектины были секвенированы на уровне кДНК и имеют гомологичные последовательности и идентичные фрагменты, включая лектин-подобный домен. L-селектин имеет двойную функцию: с одной стороны, он является "хоминг"-рецептором на T-клетках для наружных эндотелиальных венул периферических лимфатических узлов; а с другой стороны, он является фактором адгезии на нейтрофилах для эндотелия (Hallmann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:236 (1991); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). E-селектин и P-селектин индуцируются на эндотелии цитокинами, но с различной кинетикой. L-селектин на нейтрофилах является контррецептором E-селектина и P-селектина (Picker и др., Cell 66:921 (1991); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), хотя, возможно, что все три указанные рецепторы имеют также другие контррецепторы. В частности, E-селектин связывается с углеводной группой сиалил-Льюиса x (SLex)(Lowe et al., Cell 63:475, (1990); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), тогда как этот углевод, как известно, присутствует на L-селектине (Picker et al., Cell 66:921 (1991)) и может, очевидно, присутствовать на других белках. E-селектин экспрессируется, в основном, в воспалительных участках кожи, а также служит в качестве фактора адгезии для "хоминга" Т-клеток кожи, которые могут участвовать в воспалительных процессах (Picker et al. , Nature 349:796 (1991); эта работа вводится во всей своей полноте посредством ссылки).

Как показывают различные анализы, все антитела к CD11a, CD11b, CD18, L-селектину и E-селектину в большей или меньшей степени блокируют связывание нейтрофилов с активированными эндотелиальными клетками, но наиболее полное ингибирование достигается, в основном, комбинацией антитела к CD18 и антитела к L- или E-селектину (см., например, Luscinskas, J. Immunol., 142:2257 (1989); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Лишь совсем недавно получила широкое признание модель, которая объясняет вышеуказанные факты трехстадийным процессом адгезии (Butcher, Cell 67:1033(1991); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). В первой стадии нейтрофилы обратимо связываются с воспаленным васкулярным эндотелием посредством селектинов, которые очень хорошо связываются в условиях кровотока, заставляя нейтрофилы буквально "катиться" вдоль стенок сосудов. Затем нейтрофилы активируются рядом стимуляторов, находящихся вокруг или высвобождаемых эндотелием, включая IL-8, PAF и C5a. Активированные нейтрофилы выделяют L-селектин и активируют Mac-1. В конечной стадии связывание Mac-1 с ICAM-1 и вероятно с другими контррецепторами на клетках эндотелия способствует стабильной адгезии и транссудации через эндотелий.

В принципе, антитела или другие антагонисты таких факторов адгезии, как интегрин и селектин, могут остановить этот процесс, предотвращая связывание нейтрофилов с эндотелием и их транссудацию в ткани. Следовательно, указанные антитела могут быть использованы для лечения множества патологических состояний, в основе которых лежит воспалительный процесс.

Например, в живых моделях антител против CD 18, которые связываются с LFA-1 и Мac-1, были использованы для снижения повреждений при ишемической реперфузии (см. , например, Vedder et sl., J. Clin. Invest., 81:939 (1988); Vedder et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2643 (1990); патент США N 4797277). Эти антитела также способствуют снижению нейтрофил-опосредованных повреждений в легких, обусловленных различными инсультами (Doerschuk et al., J. Immunol 144:2327 (1990) и Mulligan et al., J.Immunol. 148:1847 (1992)), включая сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями (Walsh et al., Surgery 110:205 (1991)). В экспериментах с кроликами антитела против CD 18 также защищали от летального исхода, обусловленного менингитом (Tuomanen et al. , J. Exp. Med., 170:959 (1990)). Эти антитела могут быть также использованы для предупреждения или лечения отторжения трансплантата, поскольку они блокируют функцию T-клеток.

Например, инъекция антител против L-селектина или E-селектина грызунам способствует подавлению аккумуляции нейтрофилов внутри воспаленных очагов брюшины (Jutila et al., J. Immunol., 143:3318 (1989) и Milligan et al., J. Clin. Invest. 88:1396 (1991)). С помощью видеомикроскопа для витальных исследований было обнаружено, что антитело против L-селектина в высокой степени ингибирует "прокатывание" лейкоцитов вдоль эндотелия сосудистой стенки мезентериальных венул кролика, временно выведенных на поверхность тела (Von Andrian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:7538 (1991)). Антитело против E-селектина способствует значительному снижению васкулярных нарушений, индуцированных отложением иммунных комплексов в коже или легких крыс, а также значительному снижению аккумуляции нейтрофилов на этих участках (Mulligen et al. , J. Clin. Invest. 88:1396 (1991)). Кроме того, в модели приобретенной бронхиальной астмы у приматов антитело против E-селектина способствует значительному снижению притока нейтрофилов в легкие, и ассоциированную с ним позднюю обструкцию дыхательных путей после ингаляции антигена (Gundel et al. , J. Clin. Invest. 88:1407 (1991)).

Было получено несколько антител, включая мышиное DREG-55, мышиное DREG-56 и мышиное DREG-200, которые связываются с L-селектином человека (Kishimoto et al. , Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:2244 (1990); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). Эти антитела частично или полностью блокируют связывание лимфоцитов человека с наружными эндотелиальными венулами периферических лимфатических узлов, а также связывание нейтрофилов человека со стимулированными клетками пупочной вены человека (Kishimoto et al., Blood 78:805, (1991); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). Способность указанных антител блокировать связывание нейтрофилов с эндотелиальными клетками свидетельствует о том, что антиген, с которым они связываются, а именно L-селектин, может быть подходящей мишенью для потенциальных терапевтических агентов.

К сожалению, использование моноклональных антител, не являющихся человеческими, например, таких как мышиное антитело DREG-200, для лечения человека имеет некоторые недостатки, особенно в режимах повторной терапии, как поясняется ниже. Например, мышиные моноклональные антитела имеют относительно короткое время полужизни в кровотоке, а также не обладают другими важными иммуноглобулиновыми функциональными свойствами, необходимыми для использования в лечении человека.

И вероятно, что более важно, нечеловеческие моноклональные антитела содержат значительные фрагменты аминокислотных последовательностей, которые могут быть иммуногенными при их введении человеку. Многочисленные исследования показали, что после инъецирования пациенту чужеродного антитела иммунный ответ, индуцированный в организме пациента против этого антитела, может быть настолько сильным, что сведет на нет терапевтический эффект антитела уже в самом начале лечения. Более того, поскольку в настоящее время постоянно разрабатываются новые мышиные или другие антигенные (по отношению к человеку) моноклональные антитела для лечения самых различных заболеваний, то может оказаться, что после первого или нескольких введений человеку чужеродных антител последующее лечение даже с использованием совершенно другой терапии будет неэффективным или опасным из-за перекрестной реактивности. Определенный успех был получен при продуцировании так называемых "химерных антител" (в которых, например, мышиные вариабельные области соединены с человеческими константными областями), но несмотря на это, проблема, связанная со значительной иммуногенностью, все же не была решена.

Для решения проблемы иммуногенности чужеродных антител было предпринято несколько попыток получения "очеловеченных" (гуманизированных) антител. Переход от мышиного к "очеловеченному" антителу предусматривает определенный компромисс в отношении некоторых конкурирующих факторов, и выбор того или иного решения зависит от конкретно используемых антител. Для минимизации иммуногенности в иммуноглобулине должна сохраниться по возможности большая часть человеческой последовательности акцептора. Однако, для сохранения аутентичной способности к связыванию иммуноглобулиновый остов должен содержать достаточное количество замещений в последовательности акцептора человека в целях обеспечения трехмерной конформации CDR-областей, по возможности более близкой к конформации мышиного донорного иммуноглобулина. В результате этого многие "очеловеченные" антитела, продуцированные до настоящего времени, обнаруживают значительную потерю аффинности связывания по сравнению с соответствующими мышиными антителами. См., например, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Shearman et al., J. Immunol. 147:4366-4373 (1991); Kettleborough Protein Engineering 4: 773-783 (1991); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 (1991); Tempest et al., Boitechnology 9:266-271 (1991); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) и публикация EPO N 0239400 (каждая из указанных работ вводится во всей своей полноте посредством ссылки).

В соответствии с вышеуказанным очевидно, что необходимо разработать улучшенные формы очеловеченных иммуноглобулинов, специфичных к антигену L-селектину, которые являются не только, в основном, неиммуногенными для человека, но и могли бы быть легко и без больших экономических затрат продуцированы способом, приемлемым для изготовления лекарственных средств, и для использования в других целях. Эти и другие проблемы были решены с помощью настоящего изобретения.

Изобретение относится к новым композициям, которые могут быть использованы, например, для лечения воспалительных заболеваний у человека и которые содержат "очеловеченные" иммуноглобулины, способные к специфическому связыванию L-селектином. Указанные иммуноглобулины могут обладать двумя парами комплексов "легкая цепь/тяжелая цепь", где по крайней мере одна цепь содержит одну или несколько гипервариабельных областей, функционально соединенных с сегментами каркасных областей иммуноглобулина человека. Например, мышиные гипервариабельные области с дополнительными натуральными аминокислотными остатками мыши или без них могут быть введены в каркасные области иммуноглобулина человека в целях продуцирования "очеловеченных" иммуноглобулинов, способных к связыванию с L-селектином при уровнях аффинности, составляющих более чем 10⁷ М^-1. Указанные "очеловеченные" иммуноглобулины также обладают способностью блокировать связывание CD R-донорного мышиного моноклонального антитела с L-селектином.

Иммуноглобулины настоящего изобретения, включая связывающие фрагменты и другие их производные, могут быть легко продуцированы с использованием техники рекомбинантных ДНК, где конечную экспрессию в трансфецированных клетках осуществляют предпочтительно в иммортализованных эукариотических клетках, таких как клетки миеломы или гибридомы. Полинуклеотиды, содержащие первую последовательность, кодирующую каркасные области "очеловеченного" иммуноглобулина, и вторую серию последовательностей, кодирующих нужные гипервариабельные области иммуноглобулина, могут быть продуцированы синтетически либо путем объединения соответствующих кДНК и геномных ДНК-сегментов.

"Очеловеченные" иммуноглобулины могут быть использованы отдельно, т.е., в основном, в чистом виде либо в сочетании с химиотерапевтическим средством, таким как нестероидное противовоспалительное средство (например, аспирин); кортикостероид или иммунодепрессант. Все указанные соединения особенно эффективны при лечении воспалительных заболеваний. "Очеловеченные" иммуноглобулины или их комплексы могут быть получены в виде фармацевтически приемлемых лекарственных препаратов, форма которых может варьироваться в зависимости от способа введения.

На фиг.1 представлены последовательности кДНК и транслированные аминокислоты последовательности вариабельных областей легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) мышиного антитела DREG-200. Зрелая тяжелая цепь начинается с аминокислоты 20 E, а зрелая легкая цепь начинается с аминокислоты 21 D, которым предшествуют сигнальные последовательности.

На фиг. 2 - аминокислотные последовательности вариабельных областей зрелой легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) мышиного антитела DREG-200 (верхние строки) и "очеловеченного" антитела DREG-200 (нижние строки). Три CDR в каждой цепи подчеркнуты. Аминокислотные остатки в каркасных областях, которые были заменены мышиными аминокислотами, или типичные аминокислоты человека в "очеловеченном" антителе подчеркнуты двойной чертой.

На фиг. 3 - нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вариабельные области легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) "очеловеченного" антитела DREG-200 и начинающихся, и кончающихся XbaI-сайтами; и транслированные аминокислотные последовательности, включая сигнальные последовательности.

На фиг. 4 - конкурентное связывание мышиного и "очеловеченного IgG1 и IqG4 DREG-200. Клетками-мишенями являются клетки 2-1, линия мышиных пре-B-клеток, которые были трансфецированы геном человеческого L-селектина, а поэтому экспрессировали человеческий L-селектин (Berg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 1048 (1992)). 510⁵ клеток инкубировали с 3 нг ¹²⁵1-меченного мышиного антитела (2 мкКи/мкг) вместе с возрастающими количествами мышиного или "очеловеченного" антитела-конкурента в 0,2 мл буфера для связывания (PBS + 2%FBs +0,1% азида) в течение 1 часа при 4^oC. Клетки промывали и осаждали, после чего измеряли их связанную радиоактивность. Затем вычисляли концентрации связанного и свободного меченного антитела.

На фиг. 5 - связывание человеческих нейтрофилов с IL-I-стимулированными эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HU V EC). Нейтрофилы сначала обрабатывали иррелевантным контрольным антителом, мышиным антителом DREG-200 или очеловеченным антителом IgG1 DREG-200, или вообще не обрабатывали антителом (слева).

На фиг. 6 - защита ишемическо-реперфузированной ткани сердца с помощью "очеловеченного" антитела DREG-200. На рис. проиллюстрирован эксперимент, проведенный на кошках, обработанных "очеловеченным" антителом DREG-200 или контрольным антителом; слева направо: область под угрозой/полная вентрикулярная область; область некротической ткани/область под угрозой и область некротической ткани/полная область левого желудочка. Величины в скобках означают +/- среднеквадратичное отклонение для шести кошек; высота отрезков означает среднее значение.

Определения Термин "в основном идентичный" или "в основном гомологичный" означает, что две пептидные последовательности при оптимальном сравнении их первичной структуры, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием весов предполагаемых брешей имеют идентичность по крайней мере 65%, а предпочтительно, по крайней мере 80-90%, а более предпочтительно, по крайней мере 95% или более (например, 99%). При этом, предпочтительно, если положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются друг от друга консервативными аминокислотными замещениями.

Для классификации консервативных или неконсервативных аминокислотных замещений аминокислоты могут быть разделены на следующие группы: Группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, met, ala, val, leu, ile; Группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): сys, ser, thr; Группа III (кислотные боковые цепи): asp, glu; Группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; Группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro и Группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативными замещениями являются замещения между аминокислотами одного и того же класса. Неконсервативные замещения представляют собой замену аминокислоты одного класса на аминокислоту другого класса.

Аминокислоты из вариабельных областей зрелых тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов обозначаются Hx и Lx соответственно, где x представляет собой число, обозначающее положение аминокислот в соответствии со схемой Kobat в "Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 и 1991). В этой работе Kabat перечисляется много аминокислотных последовательностей антител для каждого подкласса, а также перечисляются наиболее часто встречающиеся аминокислоты для каждого положения остатка в данном подклассе. Kabat использовал метод, в котором каждой аминокислоте в перечисленных последовательностях приписывался номер, и этот метод нумерации аминокислотных остатков был принят специалистами за стандарт. Схема Kabat может быть использована и в отношении других антител, не включенных в список Kabat, путем сравнения первичной структуры исследуемого антитела с одной из консенсусных последовательностей в списке Kabat. Использование системы, нумерации Kabat, позволяет легко идентифицировать аминокислоты в эквивалентных положениях различных антител. Например, аминокислота в положении L 50 человеческого антитела занимает эквивалентное положение по отношению к положению аминокислоты L 50 мышиного антитела.

Начиная от N-конца и кончая C-концом, легкая и тяжелая цепи включают в себя домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Приписывание аминокислот к каждому домену проводится в соответствии с определениями Kabat (1987) и (1991), (см. выше) или Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Подробное описание изобретения В основном, классификация, используемая ниже, а также при описании лабораторных процедур; методы молекулярной генетики, химии нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные ниже, являются хорошо известными и широко используются специалистами в этой области. В методах рекомбинантных ДНК, синтеза полинуклеотидов, культивировании клеток и трансгенного введения генетического материала (например, электропорация, микроинъекции, липофекция) используется традиционная техника. В основном, ферментные реакции, синтез олигонуклеотидов и стадии очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителей. Способы и процедуры, в основном, осуществляют в соответствии со стандартной техникой, обычно применяемой в данной области, а также в соответствии с описаниями, имеющимися в литературе, ссылки на которую приводятся в настоящей заявке. Для удобства читателя в настоящей заявке также приводится описание хорошо известных процедур. Вся нужная информация вводится в настоящее описание посредством ссылки.

"Очеловеченные" антитела против L-селектина Настоящее изобретение относится к получению "очеловеченных" иммуноглобулинов, специфически связывающихся с эпитопами L-селектина. Указанные иммуноглобулины, в основном, имеют высокую аффинность связывания с L-селектином, составляющую по крайней мере около 10⁷ М^-1, а предпочтительно от 10⁸ М^-1 до 10⁹ М^-1 или более, и обладают способностью связываться, например, с нейтрофилами. "Очеловеченные" иммуноглобулины имеют каркас человеческого иммуноглобулина, и одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR-Complementarity determining regions), происходящих от иммуноглобулина, обычно мышиного иммуноглобулина, способного к специфической реакции с L-селектином. В предпочтительном варианте настоящего изобретения одна или несколько CDR-областей происходят от мышиного антитела DREG-200, а "очеловеченный" иммуноглобулин, в целом, имеет изотип IgG1 или IqG4. Таким образом, иммуноглобулины настоящего изобретения, которые могут быть получены в больших количествах экономически эффективным способом, предназначены для использования в лечении воспалительных заболеваний у человека с применением различной техники.

Известно, что основная структурная единица антитела состоит из тетрамера. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом пара имеет одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). NG₂-конец каждой цепи начинается с вариабельной области, состоящей приблизительно из 100-110 или более аминокислот, которые ответственны, главным образом, за узнавание антигена. COOH-часть каждой цепи определяет константная область, которая ответственна, главным образом, за эффекторную функцию.

Легкие цепи подразделяются на каппа- и лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируются как гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи, которые определяют изотип антитела, а именно IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области соединены "J"-областью, состоящей примерно из 12 аминокислот или более; причем в тяжелой цепи, кроме того, имеется область "D", состоящая примерно из 10 или более аминокислот (См. например, Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., Chapter 7 pp. 131-166, Raven Press, N.Y. (1984); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий центр. Консервативные каркасные области всех цепей имеют, в основном, одинаковое строение и соединяются посредством трех гипервариабельных областей, называемых также участками, определяющими комплементарность (CDR) (см., например, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. и др., U.S. Department of Health and Human Services (1987) и Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); эти работы целиком вводятся в настоящее описание посредством ссылки). CDR двух цепей каждой пары перемещался с каркасными участками, обладающими способностью связываться со специфическим эпитопом.

Используемый в настоящем описании термин "иммуноглобулин" относится к белку, состоящему из одного или нескольких полипептидов, в основном, кодируемых генами иммуноглобулина. Такими генами являются каппа-, лямбда-, альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон- и мю-гены константных областей, а также множество генов вариабельной области иммуноглобулина. Иммуноглобулины могут существовать, помимо антител, в виде других форм, например, таких как FV, Fab, и (Fab')₂, а также в виде гетеровалентных антител (например, Lanzavechia и др. , Eur. J. Immunol. 17:105 (1987)) и одиночных цепей (например, Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988) и Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); указанные работы во всей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). (В общих чертах, см. Hood et al., Immunology (Benjamin N.Y., 2nd ed., 1984), Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) и Hunkapiller & Hood, Nature, 323: 15-16 (1986); все указанные работы вводятся в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки).

Химерные антитела представляют собой такие антитела, у которых гены легкой и тяжелой цепей были сконструированы обычно методами генной инженерии из сегментов иммуноглобулиновых генов, принадлежащих к различным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов от моноклонального мышиного антитела могут быть соединены с константными (C) сегментами иммуноглобулина человека, таким как V₁ и V₄. Таким образом, типичное терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из V или антигенсвязывающего домена, происходящего от мышиного антитела, и C или эжекторного домена, происходящего от антитела человека, хотя могут быть использованы антитела и других видов млекопитающих.

Используемый в настоящем описании термин "каркасная область" относится к таким участкам вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, которые являются относительно консервативными (т.е. менее вариабельными, чем CDR) у иммуноглобулинов одного вида (как было определено Kabat и др., см. выше). Используемый в настоящем описании термин "каркасная область человека" означает каркасную область, которая, в основном, идентична (например, на 85% или более) каркасной области натурального антитела человека или консенсусной последовательности нескольких таких антител.

Используемый в настоящем описании термин "очеловеченный иммуноглобулин" относится к иммуноглобулину, который включает в себя каркас иммуноглобулина человека; и по крайней мере одну гипервариабельную область (CDR), происходящую от антитела, не являющегося человеческим и в котором любая присутствующая константная область, в основном, идентична константной области человеческого иммуноглобулина по крайней мере примерно на 85-90%, а предпочтительно, по крайней мере на 95 %. Следовательно, все части "очеловеченного" иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, являются, в основном, идентичными соответствующим частям одного или нескольких последовательностей нативного иммуноглобулина человека. Так, например, к "очеловеченному" иммуноглобулину не относится химерное антитело, имеющее мышиную вариабельную область и человеческую константную область.

По сравнению с антителами, а в некоторых случаях и с химерными антителами "очеловеченные" антитела имеют по крайней мере три потенциальных преимущества при их использовании для лечения человека, а именно: (1) поскольку эффекторная часть "очеловеченного" антитела происходит от человеческого иммуноглобулина, то это антитело лучше взаимодействует с другими частями иммунной системы человека (например, с большей эффективностью разрушает клетки мишени благодаря комплементзависимой цитотоксичности (CDC) или антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC)).

(2) Человеческая иммунная система не должна распознавать каркасную или C-область "очеловеченного" антитела как чужеродную, а поэтому антительный ответ организма против такого инъецированного антитела должен быть меньше, чем ответ против целиком чужеродного мышиного антитела, либо частично чужеродного химерного антитела.

(3) Сообщалось (Shaw D., et al., J. Immunol., 138:4534-4538 (1987)), что инъецированные мышиные антитела имеют более короткое время полужизни в кровотоке человека, чем нормальные антитела. Инъецированные "очеловеченные" антитела, по всей вероятности, имеют такое же время полужизни, что и натуральные антитела человека, если учесть, что эти антитела попадают в кровоток в меньших и не в столь частых дозах.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к сегментнам рекомбинантных ДНК, кодирующим CDR-области тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, способного связываться с нужным эпитопом L-селектина, например, такого как мышиные моноклональные антитела DREG-200, DREG-55 или DREG-56 (Kishimoto et al. (1990), см.выше; эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). ДНК-сегменты, кодирующие указанные области, сшивают с ДНК-сегментами, кодирующими соответствующие каркасные области, происходящие от иммуноглобулина человека. Характерные ДНК-последовательности, которые после экспрессии кодируют полипептидные цепи, содержащие CDR-области тяжелой и легкой цепей моноклонального мышиного антитела DREG-200, показаны на фиг. 1. Благодаря вырождению кодона и некритическим аминокислотным замещениям, эти последовательности могут быть легко заменены другими ДНК-последовательностями, как, например, описано ниже. Подробное описание конструирования и продуцирования "очеловеченных" иммуноглобулинов приводится в общих чертах в переуступленных заявках per. N 07/290975 и 07/310252, поданных 28 декабря 1988 и 13 февраля 1989 соответственно, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Кроме того, ДНК-сегменты могут содержать ДНК-последовательность, регулирующую экспрессию и соответствующим образом присоединенную к последовательностям, кодирующим "очеловеченный" иммуноглобулин, например, натуральные или гетерологичные промоторные области. Предпочтительными регуляторными последовательностями являются эукариотические промоторные системы, присутствующие в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клеток-хозяев, хотя могут быть также использованы и регуляторные последовательности для прокариотических клеток. После введения вектора в соответствующую клетку-хозяина эту клетку выдерживают в условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, а затем, если это необходимо, осуществляют сбор и очистку легких цепей, тяжелых цепей, димеров легких/тяжелых цепей или интактных антител, связывающихся фрагментов или других форм иммуноглобулинов.

Таким образом, нуклеиновокислотные последовательности настоящего изобретения, обладающие способностью к продуцированию нужных "очеловеченных" антител, могут быть сконструированы из различных полинуклеотидов (таких, как геномная или кДНК, РНК, синтетические олигонуклеотиды и т.п.) и компонентов (таких, как V-, J-, D- и C-области) с использованием различной техники. Наиболее распространенным методом такого конструирования является соединение соответствующих геномных и синтетических последовательностей, хотя могут быть также использованы и кДНК-последовательности (см.публикацию Европатента N 0239400 и Riechmann, L. et al., Nature 332: 323-327 (1988); обе эти работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

ДНК-последовательности константных областей человека могут быть выделены с использованием известных процедур из различных клеток человека, а предпочтительно изиммортализованных B-клеток (Kabat см.выше, и WP87/02671). CDR, используемые для получения иммуноглобулинов настоящего изобретения, могут быть получены от моноклональных антител, способных связываться с L-селектином, и продуцированы в любом подходящем источнике, взятом от млекопитающего, например, такого, как мышь, крыса, кролик или другое позвоночное животное, способное к продуцированию антител, с использованием методов, хорошо известных специалистам. Подходящие клетки-источники для ДНК-последовательностей, а также клетки-хозяева для экспрессии и секреции иммуноглобулинов могут быть получены из ряда источников, например, таких как Американская коллекция типовых культур (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5-th ed. (1985) Rockville, MD; эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). В предпочтительных вариантах настоящего изобретения CDR-последовательности соответствуют CDR-последовательностям антитела DREG-200, антитела мыши DREG-55 или антитела DREG-56 и могут содержать вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности CDR мышиного антитела DREG-200, DREG-55 или DREG-56.

Помимо "очеловеченных" иммуноглобулинов, подробно описанных в настоящей заявке, могут быть легко сконструированы и продуцированы другие "в основном, гомологичные" модифицированные иммуноглобулины с использованием хорошо известной техники рекомбинантных ДНК. В качестве источника каркасной последовательности могут быть использованы и другие антитела человека, отличающиеся от антител Eu, обсуждаемых в Примере 2. Эти каркасные последовательности должны быть в высокой степени идентичными вариабельным каркасным доменам мышиного антитела DREG-200, от которых происходят области CDR. Вариабельные каркасные области тяжелой и легкой цепей могут происходить от последовательностей одного и того же антитела либо от последовательностей разных антител человека. Так, например, каждая из каркасных областей тяжелой и легкой цепей может происходить от нескольких антител человека. Такими последовательностями могут быть последовательности природных антител человека, либо консенсусные последовательности нескольких антител человека (см. Carter и др. WO 92/22653 (1992)).

Непосредственное и неестественное соседство мышиных CDR-областей с вариабельной каркасной областью человека может приводить к конформационным затруднениям, которые, если их не скорректировать посредством замещения некоторых аминокислотных остатков, могут привести к потере аффинности связывания. Выбор аминокислотных остатков для замещения осуществляется частично с помощью компьютерного моделирования. Для этих целей широко используется компьютерная аппаратура и программное обеспечение для проецирования трехмерного изобретения молекул иммуноглобулина. В общих чертах, молекулярные модели продуцируют исходя из известных структур иммуноглобулиновых цепей или их доменов. Моделируемые цепи сравнивают с цепями или доменами известных трехмерных структур для анализа сходства их аминокислотных последовательностей и, если указанные цепи или домены обнаруживают высокую степень сходства, то их используют в качестве отправной точки для конструирования молекулярно