Способ получения антибиотика актиноплацина, штамм streptоmyces (kitasatoa) species 834 вниисхм д-484- продуцент антибиотика актиноплацина

Способ получения антибиотика актиноплацина, штамм streptоmyces (kitasatoa) species 834 вниисхм д-484- продуцент антибиотика актиноплацина

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству антибиотиков. Для получения антибиотика актиноплацина осуществляют культивирование нового штамма-продуцента Streptomyces (Kitasatoa) species 834 ВНИИСХМ Д-484. Штамм выращивают на питательной среде, содержащей глюкозу, сухой дрожжевой экстракт, углекислый кальций при температуре 271°С. Экстракцию антибиотика из биомассы проводят 65-70%-ным водным ацетоном. После упаривания экстрактов для очистки на колонке используют молекулярный сорбент на основе сополимера стирола и дивинилбензола. Десорбцию проводят 70%-ным водным ацетоном. Выделение осуществляют осаждением ацетоном или упаркой с последующей промывкой безводным ацетоном и сушкой в вакууме. Новый штамм обладает повышенной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выделение осуществляется по упрощенной технологии. Выделенный антибиотик обладает более высокой биологической активностью. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению антибиотика широкого спектра действия. Актиноплацин высокоэффективен в отношении большинства полирезистентных микроорганизмов - возбудителей заболеваний человека и животных. Спектр антибактериального действия актиноплацина включает различные виды грамположительных и грамотрицательных бактерий: стафилококки, цепочечные кокки, эшерихии, протеи, псевдомонады, ряд возбудителей острозаразных инфекций, в том числе устойчивые к другим антибактериальным препаратам. В связи с этим актиноплацин может применяться при гнойной патологии человека и животных различной природы, инфекционных болезнях кишечника, септических процессах и др.

Задачей данного технического решения является получение штамма с более высокой производительностью для получения актиноплацина, а также совершенствование технологии выделения и химической очистки с целью получения более высокой степени чистоты.

Известен способ получения оригинального антибиотика актиноплацина (Патент SU N 1839678 Кузнецова О.С., Сухаревич М.Э., Аравийская С.В. и др.). В указанном способе получения антибиотика культивируют продуцент Kitasatoa species штамм ВНИИА N 2079 в глубинных аэробных условиях при температуре 271^oC в жидкой питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза 20-22; сухой дрожжевой экстракт 3,5-4,5; солодовые ростки 1,5-2,5; углекислый кальций 3,0-4,0; вода остальное.

Через 96 ч ферментации антибиотическая активность штамма составляла 200000 ЕД разв./мл в отношении Staphylococcus aureus 5 a, 3200 ЕД разв./мл - в отношении Escherichia coli 60 и Klebsiella pneumoniae 122 и 6400 ЕД разв. /мл в отношении Pseudomonas aeruginosa 805 и Proteus vulgaris 7470.

С учетом соотношении биомассы и экстрагента 1:3 антибиотическая активность в 1 г влажной биомассы будет составлять 600000 ЕД разв. в отношении Staphylococcus aureus 5 a, 9600 ЕД разв. - в отношении Escherichia coli 60 и Klebsiella pneumoniae 122 и 19200 ЕД разв. в отношении Pseudomonas aeruginosa 805 и Proteus vulgaris 7470.

Влажный мицелий экстрагируют этилацетатом в соотношении 1:3. Из полученного экстрагента антибиотик извлекают хлористым метиленом и очищают хроматографией на колонке с полиамидом, элюируют смесью хлороформа с метанолом в соотношении 80:20. Антибиотик актиноплацин обладает активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Активность антибиотика (МПК) - 0,0005 мкг/мл в отношении Staphylococcus aureus 5 a; 0,15 мкг/мл в отношении E. coli 60, Klebsiella pneumoniae 122, Pseudomonas aeruginosa 805 и Proteus vulgaris 7470.

Заявленный способ (Патент SU N 1839678) по совокупности свойств штамма и антибиотика аналогов не имеет.

Данный способ получения антибиотика актиноплацина выбран нами за прототип.

Недостатком данного способа является низкая антибиотическая активность продуцента, особенно в отношении стафилококка, ничем не оправданное введение в ферментационную среду солодовых ростков, а также многостадийность, трудоемкость стадии выделения и химической очистки, большое количество органических растворителей: этилацетат, хлористый метилен, эфир, метанол, хлороформ. Необходимость сложной многостадийной очистки препарата обусловлена использованием на первой технологической стадии этилацетата в качестве экстрагента.

По отношению к актиноплацину этилацетат не является избирательным экстрагентом, в то же время он прекрасно растворяет жиры, присутствующие в биомассе. Все последующие технологические стадии необходимы для отделения жиров от целевого продукта. Присутствие жиров увеличивает растворимость актиноплацина в водно-органических смесях, мешает его осаждению после отгонки растворителей, вызывая сильное эмульгирование, увеличивая потери в маточниках и промывках.

В предлагаемом способе получения актиноплацина культивируют продуцент Streptomyces (Kitasatoa) штамм 834. Streptomyces (Kitasatoa) штамм 834 получен методом селекции при воздействии на штамм Streptomyces (Kitasatoa) ВНИИА N 2079 митамицином C и нитрозометилбиуретом. Штамм хранится в Научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии под N Д-484 в группе эпифитных микроорганизмов.

Процесс биосинтеза осуществляют в глубинных условиях при 271^oC в течение 96-120 ч в жидкой питательной среде с pH до стерилизации 7,0 следующего состава г/л: глюкоза 2,0-3,5; сухой дрожжевой экстракт 3,0-4,2; углекислый кальций 1,0-1,4; вода - остальное.

Антибиотик из влажного мицелия экстрагируют 65-70% водным ацетоном. Экстракт упаривают. Из упаренного экстракта актиноплацин сорбируют молекулярным сорбентом на основе сополимера стирола и дивинилбензола, десорбцию проводят водным ацетоном, а из элюата антибиотик выделяют водным ацетоном или упаркой с последующей промывкой органическим растворителем и сушкой в вакууме.

Штамм Streptomyces (Kitasatoa) species 834 по своим культуральным, физиологическим и антагонистическим свойствам отличается от штамма Kitasatoa species ВНИИА N 2079.

Морфолого-культуральные, физиологические, биохимические и антагонистические признаки штамма Streptomyces (Kitasatoa) species 834 Морфологические признаки: Штамм 834 формирует хорошо развитый воздушный и субстратный мицелий. На поверхности колоний образуются шаровидной формы спорангии разного размера от мелких до крупных (50-60 мкм в диаметре), внутри которых по 2-4 подвижные споры. Подвижность спор наблюдается в первые 40 мин, 1 час выхода их из спорангия в дистиллированную воду. Кроме спорангиев культура образует спороносцы, типичные для Streptomyces. Спороносцы спиральные (1-3 завитка), в спирали 12-20 спор. Споры прямоугольные, гладкие, 2х1 мкм.

Культуральные признаки На среде с кукурузным экстрактом и крахмалом N 21/12 на 21 сутки роста при 281^oC формируют колонии круглые, с фестончатыми краями, плоские, диаметром 12-16 мм. Колонии складчатые, радиально исчерченные, в центре точечное углубление. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, серый (в-4 по шкале А.С.Бондарева), пепельно-серый (к-2). Субстратный мицелий бурый, темно-бурый (в-6). Выделяет в среду бурый пигмент на среде Чапека с крахмалом N 84 формирует колонии круглые, диаметром 9-12 мм, выпуклые, края колонии ровные. Колонии кожистые, радиально-исчерченные, центр колонии растрескивается, по краю колонии беловато-серый ободок. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, от бледно-сероватого (а-6) до мышино-серого цвета. Субстратный мицелий от песочного (л-7) до буроватого (б-4). Пигмента в среду не выделяет.

На среде минеральной Гаузе N 1 формирует колонии диаметром 10-12 мм, выпуклые, с мало выраженной складчатостью. Края колонии извилистые. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, мышино-серый (в-4), серый (в-4), по краю колонии белый ободок. Субстратный мицелий оливково-серый (н-1). Растворимый пигмент отсутствует.

На синтетической среде СР-1 по Красильникову формирует колонии диаметром 6-10 мм, выпуклые, круглые, складчатые, радиально-исчерченные. Выделяют в среду слабый буроватый пигмент. Воздушный мицелий от бледно-сероватого (а-6) до серого (в-4). Субстратный мицелий темно-бурый. Растворимый пигмент бурый.

При развитии на крахмально-аммиачном агаре формирует колонии диаметром 8-10 мм, слегка выпуклые, края колонии извилистые. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, серый (в-4), мышино-серый (а-4). Субстратный мицелий темно-бурый (а-6). Выделяет в среду темно-бурый пигмент.

На глицерин-аспарагиновом агаре формирует колонии диаметром 7-10 мм, кожистые, радиально исчерченные, растрескивающиеся. Воздушный мицелий хорошо развит, серый (в-4), мышино-серый (а-4). Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Выделяет в среду темно-бурый пигмент.

На картофельном агаре образует колонии диаметром 8-10 мм, круглые, плоские, складчатые, центр колонии слегка приподнят над агаром. Края колонии слегка волнистые. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, темно-серый (а-2). Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Растворимый пигмент бурый.

На мясопептонном агаре формирует колонии диаметром 5-7 мм, круглые с фестончатыми краями, выпуклые, радиально исчерченные, центр колонии в виде небольшого плато приподнят над агаром. Колонии без воздушного мицелия ("голые"), восковидные бледно-песочного цвета (к-3). Выделяют в среду буроватый пигмент.

На органической среде N 2 с переваром Хоттингера формирует колонии диаметром 6-8 мм, круглые с фестончатыми краями, выпуклые, радиально исчерченные, с кратером в центре. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, бледно-сероватый (а-6). Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Растворимый пигмент бурый.

На овсяном агаре образует колонии диаметром 10-15 мм, круглые, плоские. Воздушный мицелий обильный, бархатистый мышино-серого цвета (а-4). Субстратный мицелий оливково-серый (н-1). Растворимого пигмента нет.

Физиологические признаки.

На среде Придхема-Готтлиба очень хорошо растет, если в качестве единственного источника углерода используют D-глюкозу, L-рамнозу, D-маннозу, крахмал. Хорошо растет в присутствии сахарозы. Умеренно растет в присутствии галактозы, лактозы, фруктозы, i-инозита, L-арабинозы, D-мальтозы. Не растет в присутствии L-сорбозы, D-сорбита, дульцита, D-ксилозы.

Штамм разжижает желатин не полностью, но очень медленно (на 21 сутки), молоко не коагулирует и не пептонизирует, на клетчатке не растет, крахмал гидролизует, образует сероводород, нитраты не восстанавливает. Хорошо растет на картофеле, субстратный мицелий темно-бурый, пигмент растворимый бурый; воздушный мицелий обильный серый.

Антагонистические признаки.

При определении антагонистического спектра установлено, что штамм Streptomyces (Kitasatoa) species 834 подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, актиномицетов, грибов и дрожжей.

При глубинной ферментации культура Streptomyces (Kitasatoa) species 834 накапливает в клетках противобактериальный антибиотик широкого спектра действия.

Пример 1.

Для получения антибиотика штамм 834 культивировали в колбах Эрленмейра вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): глюкоза - 25,0; дрожжевой экстракт - 3,0; кальций углекислый - 1,0; pH до стерилизации - 7,0. Ферментацию проводят при 271^oC в течение 96-120 ч на качалке с 200-210 об./мин. Из 10 л культуральной жидкости получали 400 г биомассы (влажность 75%).

Антибиотическая активность штамма в 1 г биомассы составляет: для Staphylococcus aureus 5 a 1/15000000 ЕД разв., для Escherichia coli 60 - 1/48000 ЕД разв.; для Pseudomonas aeruginosa 805 - 1/24000 ЕД разв.

Антибиотическую активность определяли методом двухкратных серийных разведений в МПБ (Государственная Фармакопея СССР, Х изд. - М., Медицина, 1968).

Отличительные признаки предлагаемого штамма от известного (прототипа) Streptomyces (Kitasatoa) species 834 образует колонии меньшего диаметра, чем штамм 2079 (прототип) на средах: крахмально-аммиачной, картофельном агаре, минеральной среде Гаузе N 1 и др.

На среде минеральной Гаузе N 1 образует выпуклые колонии с маловыраженной складчатостью, края колонии извилистые. Субстратный мицелий оливково-серый (н-1).

На крахмально-аммиачном агаре края колоний извилистые.

На глицерин-аспарагиновом агаре формирует колонии 7-10 мм кожистые, радиально-исчерченные, растрескивающиеся.

Физиологические признаки В качестве единственного источника углерода предлагаемый штамм использует крахмал, разжижает желатин не полностью на 21 сутки роста.

Антибиотическая активность Streptomyces (Kitasatoa) штамм 834 значительно выше прототипа и составляет в 1 г биомассы для: Staphylococcus aureus 5 a 1/15000000 ЕД разв., для Escherichia coli - 1/48000 ЕД разв.; для Pseudomonas aeruginosa 805 - 1/24000 ЕД разв.

Заявляемый способ выделения и химической очистки разработан с учетом физико-химических свойств как актиноплацина, так и минорных примесей, образующихся в процессе биосинтеза вместе с целевым продуктом. Максимальная растворимость антибиотика достигается в 65-70%-ом водном ацетоне, поэтому при экстракции необходимо учитывать влажность биомассы и готовить водно-ацетоновую смесь таким образом, чтобы в конечном счете содержание ацетона в экстракте составляло 65-70%. Таким образом удается не только снизить расход ацетона, но и уменьшить количество извлекаемых из биомассы жирных кислот, растворимость которых падает с увеличением водности ацетона. Две экстракции водным ацетоном (2: 1, 1:1) обеспечивают полное извлечение антибиотика из биомассы.

Объединенные экстракты упаривают в вакууме при температуре не более 60^oC, упаренный концентрат представляет собой эмульсию вследствие содержащихся в нем жирных кислот. Отделение целевого продукта путем фильтрации или центрифугирования связано с большими потерями, поэтому без выделения промежуточного продукта-сырца упаренный концентрат подвергается очистке с помощью молекулярного сорбента, представляющего собой сильносшитый макропористый сополимер стирола и дивинилбензола. Перед сорбцией в упаренном концентрате устанавливают pH в пределах 6,5-7,0 с помощью водного аммиака. Скорость сорбции 25-30 мл/чсм².

Актиноплацин сорбируется на верху колонки, жирные кислоты имеют низкую сорбционную емкость по сравнению с актиноплацином, удерживаются сорбентом в незначительных количествах и в основном остаются в фильтрате. Десорбцию актиноплацина проводят 70%-ным водным ацетоном со скоростью 10-15 мл/чсм². При этом биологически неактивные пигменты остаются на сорбенте и элюируются 100% ацетоном или диметилсульфоксидом при регенерации.

Таким образом удается отделить жирные кислоты и пигменты от антибиотика и сконцентрировать раствор антибиотика в 10-12 раз. Из элюата антибиотик может быть выделен двумя способами: поскольку актиноплацин нерастворим как в воде, так и в сухом ацетоне, его можно осадить из раствора либо прибавлением десятикратного количества ацетона к элюату, либо отгонкой ацетона из элюата. Выпавший антибиотик отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и сушат в вакууме.

Пример 2. Культуральную жидкость в количестве 10 л фильтруют, биомассу промывают водой до получения бесцветных промывок. Получают 400 г биомассы с влажностью 75%.

Биологическая активность биомассы на 1 г составляет: в отношении Staphylococcus aureus 5 a 15000000 ЕД разв., Escherichia coli 60 - 48000 ЕД разв. , Pseudomonas aeruginosa 805 - 24000 ЕД разв.

Для первой экстракции берут 800 мл ацетона марки "ч", после экстракции получают 100 мл экстракта. Вторую экстракцию проводят 300 мл 70% водного ацетона, получают 300 мл экстракта и 200 г биологически неактивной биомассы.

Экстракты объединяют и упаривают в вакууме при температуре не более 60^oC с таким расчетом, чтобы содержание ацетона в кубовом остатке не превышало 5%. В упаренном концентрате устанавливают pH в пределах 6,5-7,0 с помощью разбавленного аммиака, так как при "кислых" значениях pH антибиотик крайне нестабилен. Концентрат подают на ионообменную колонку (2,5х50 см), заполненную 1500 мл сорбента (поролас Т), со скоростью 2-3 мл/мин. По окончании сорбции колонку промывают водой до вытеснения остатков концентрата. Десорбцию начинают 80% водным ацетоном в количестве 50 мл, затем продолжают 70% водным ацетоном до полной элюции препарата. К активной фракции в количестве 30 мл при перемешивании добавляют 300 мл ацетона "ч" и помещают в холодильник для кристаллизации при температуре +4^oC в течение 10-12 часов.

По окончании кристаллизации осадок отделяют центрифугированием, промывают 10 мл ацетона и сушат в вакууме.

Получают актиноплацин с активностью (МПК) - 0,0002 мкг/мл в отношении Staphylococcus aureus 5 a, 0,15 мкг/мл в отношении Escherichia coli 60, Pseudomonas aeruginosa 805, Proteus vulgaris 7470, Klebsiella pneumoniae 122.

В таблицах 1 и 2 приведены сравнительные технологические характеристики двух способов выделения актиноплацина: заявляемого и прототипа. Как явствует из таблицы 1, заявляемый способ имеет меньшее количество технологических стадий и растворителей, применение одного растворителя - ацетона, обеспечивает получение препарата с более высокой биологической активностью, например в отношении Staphylococcus aureus 5a.

Данные по свойствам актиноплацина, особенностям его растворимости (табл. 3) и сорбционным свойствам (табл. 4).

Для определения растворимости актиноплацина использовали лиофильно высушенную биомассу продуцента, к которой приливали в водно-органическую смесь в соотношении 1:5 (вес:объем). После 30 минут перемешивания экстракт отделяли фильтрацией, биологическую активность определяли методом серийных разведений.

Выбор сорбента осуществляли исходя из свойств актиноплацина и сопутствующих ему примесей. От использования ионообменных сорбентов мы вынуждены были отказаться, т.к. при этом неизбежен большой диапазон pH, но антибиотик крайне нестоек при кислых и щелочных значениях pH. Использование молекулярных сорбентов ограничено, т.к. антибиотик не растворим в воде, и сорбцию необходимо проводить из водно-органических растворов, найдя то необходимое и минимальное содержание растворителя, при котором антибиотик еще находится в растворе, но не происходит его элюция с сорбента. Для эксперимента использовали упаренный концентрат актиноплацина, содержащий около 5% ацетона. Сорбционную емкость определяли по разности концентраций актиноплацина в исходном растворе и фильтрате. Одновременно определяли способность его к десорбции с сорбента.

Результаты представлены в таблице 4.

Полнота элюции достигается с помощью 70% водного ацетона с учетом растворимости актиноплацина в водно-органической смеси.

Пример 3. Культуральную жидкость обрабатывают так, как описано в примере 2.

Экстракты упаривают в вакууме при температуре не более 60^oC до содержания ацетона в кубовом остатке около 5%. Концентрат с pH 6,5-7,0 подают на ионообменную колонку, заполненную 150 мл полисорба со скоростью 25-30 мл/чсм². По окончании сорбции колонку промывают 2-3 объемами дистиллированной воды. Десорбцию ведут сначала 80% ацетоном, т.к. он разбавляется водой по мере продвижения по колонке до 70%-ного, затем десорбцию продолжают 70%-ным ацетоном. Укрепление ацетона приводит к выпадению антибиотика в осадок прямо на колонке. К активной фракции в количестве 50 мл при перемешивании приливают 500 мл дистиллированной воды и кристаллизуют смесь при +4^oC в течение 10-12 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают десятикратным количеством безводного ацетона и сушат в вакууме.

Получают 1600 мг актиноплацина с активностью (МПК) - 0,0004 мкг/мл в отношении Staph. aureus 5a; и 0,20 мкг/мл в отношении E. coli 60; Ps. aeroginosa 805; Proteus vulgaris 7470.

Формула изобретения

1. Штамм Streptomyces (Kitasatoa) species 834 ВНИИ СХМ Д-484 - продуцент антибиотика актиноплацина.

2. Способ получения антибиотика актиноплацина, включающий культивирование штамма Streptomyces (Kitasatoa) species на питательной среде, содержащей глюкозу, сухой дрожжевой экстракт, углекислый кальций при температуре 27 1^oC, экстракцию антибиотика из биомассы, упаривание экстрактов, очистку антибиотика на колонке с сорбентом, десорбцию, выделение и сушку в вакууме, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces (Kitasatoa) species 834 ВНИИ СХМ Д-484, экстракцию антибиотика из биомассы осуществляют 65 - 70%-ным водным ацетоном, для очистки используют молекулярный сорбент на основе сополимера стирола и дивинилбензола, десорбцию проводят 70%-ным водным ацетоном, выделение - осаждением ацетоном или упаркой с последующей промывкой безводным ацетоном и сушкой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4