Слаборастворимая соль аналога рг-лг, слаборастворимая соль аналога бомбезина, фармацевтическая композиция, медицинский препарат

Слаборастворимая соль аналога рг-лг, слаборастворимая соль аналога бомбезина, фармацевтическая композиция, медицинский препарат

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к созданию аналогов гормональных препаратов белковой природы. Сущность изобретения: в качестве аналогов рилизинг-гормона/лютеинизирующего гормона используют слаборастворимую соль цетрореликса, антрареликса, ганиреликса, антида или А-75998, а также соль эмбоновой кислоты. Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция на основе каждой из названных солей. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для корректировки гормональной регуляции. 4 с. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к инъекционным суспензиям пролонгированного действия, содержащим терапевтически активные пептиды в виде плохо растворимых, физиологически приемлемых рентгеноаморфных или кристаллических солей, а также к способу их получения.

Предшествующий уровень техники В терапии пептиды часто можно использовать надежно и биодоступно только при парентеральном введении, т.к. при оральном приеме они разлагаются ферментами; при назальном введении абсорбируется только небольшой процент дозы, а при накожном введении вовсе не происходит абсорбции.

Поскольку пептиды характеризуются только очень коротким периодом полураспада в организме, парентеральное введение пептидных препаратов, например, аналогов рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (РГ-ЛГ), так называемых суперагонистов и антагонистов РГ-ЛГ, должно применяться ежедневно для достижения желаемого эффекта, состоящего для обеих групп веществ в подавлении как лютеинизирующего гормона (ЛГ), так и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ).

В результате у мужчин уменьшается образование тестостерона, а у женщин наблюдается снижение количества образуемого эстрадиола. Это называют химической кастрацией.

Аналоги РГ-ЛГ рассматриваются и как суперагонисты, например, гозерелин (Международное непатентованное название - МНН) или трипторелин (МНН), и как антагонисты, например, цетрореликс (МНН), антид (МНН) или ганиреликс (МНН). Гозерелин и его синтез описаны в Drugs of the Future, 5(4), (1980), стр. 191. Бузерелин и его синтез - там же, 4(3), (1979), стр. 173 и Drugs of Today, 21, (305), (1985). Декапептил и его синтез - Drugs of the Future, 3, (9), (1978), стр. 645. Лейпролид и его синтез - там же, 7(12), (1982), стр. 883.

Азалин B описан на стр. 13-26 "GHRH-Analogues - The State of the Art" (1993), Parthenon Publishing Groups Ed., B.Lunenfeld, V.lnsler.

До сих пор не было удачных попыток получить пролонгированные фармацевтические препараты аналогов РГ-ЛГ, обладающие замедленным рилизинг-эффектом. Например, в патенте Великобритании 2052258 описан препарат с замедленным рилизинг-эффектом, который содержит аналоги РГ-ЛГ в инъекционной форме из цинковой соли пептида, кунжутное масло и стеарат алюминия.

Различие между суперагонистами и антагонистами заключается в том, что в случае применения суперагонистов механизм обратной связи приводит к нежелательному выделению большого количества гормонов в первые недели лечения, так называемому внезапному обострению болезни, которое необходимо преодолевать дополнительным лечением. В отличие от этого, в случае применения антагонистов, например цетрореликса (МНН), фармакологический эффект проявляется немедленно и без обострения. Продолжение снижения уровня половых гормонов в крови является стандартной терапией при паллиативном лечении карцином простаты и молочной железы для снижения роста опухолей, зависимых от половых гормонов, а также для лечения эндометриоза. С химической точки зрения суперагонисты РГ-ЛГ и антагонисты являются нона- и декапептидами. Эффективным антагонистом РГ-ЛГ является цетрореликс, который представляет собой декапептид со следующей аминокислотной последовательностью: Ac-DNal-DpCl-Phe-DPal-Ser-Tyr-DCit-Leu-Arg- Pro-D-Ala-NH₂. Его синтез и фармакологические свойства описаны в Европейском патенте EP 299402. Цетрореликс ацетат является физиологически приемлемой солью. В предклинических и клинических исследованиях было установлено, что для снижения гормонального уровня тестостерона или эстрадиола до нужной степени, вплоть до следующей инъекции, водный раствор цетрореликса ацетата должен вводиться ежедневно. Длительность действия не может быть увеличена из-за достижения пороговой дозы, хотя недельный интервал введения вместо ежедневного уже был бы заметным положительным шагом для хронических больных и негоспитализируемых пациентов.

Эффективным антагонистом РГ-ЛГ является также антареликс, который имеет следующую аминокислотную последовательность: Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Lys-(iPr)-Pro-D-Ala-NH₂. Его свойства описаны в журнале Biomedical Pharmacotherapy, 1993 г. , N47(2-3), стр 107-117, в статье Deghendhi R. et al. "Антареликс (ЕР 24332), новый водорастворимый антагонист РГ-ЛГ". В вышеуказанной статье приводятся данные антареликса о его in vitro и in vivo активности в нескольких животных моделях. Подчеркивается его эффективность, умеренная гистамин-высвобождающая активность и высокая водорастворимость.

Кроме того, эффективным антагонистом РГ-ЛГ является A-75998 со следующей аминокислотной последовательностью: Ac-D-Nal-D-(pCl)Phe-D- Pal-Ser-N-MeTyr-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH₂. Его свойства описаны в журнале Medical Chemistry, 4 марта 1994 г., N 37(5), стр. 701-705, в статье Haviv F. et al. "In vitro и in vivo активность уменьшенных антагонистов рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона". А-75998 был создан на основе структуры фрагмента (2-9) агониста РГ-ЛГ и является октапептидным антагонистом РГ-ЛГ. Систематическое изучение SAR позволило сначала улучшить активность in vitro, а затем и in vivo подавление лютеинизирующего гормона. Он подавляет лютеинизирующий гормон у кастрированной крысы за более чем на 80% в течение 4 ч после быстрого подкожного введения препарата в количестве 30 мкг/кг.

Почти два десятилетия исследований антагонистов РГ-ЛГ привели к созданию ряда декапептидов, которые сейчас проходят клиническое изучение. Структуры этих антагонистов, в отличие от агонистов, существенно отличаются от структуры РГ-ЛГ. Пять из десяти аминокислот имеют искусственное происхождение и D-форму. Структурная комбинация гидрофобного N-конца (остатки 1, 2 и 3) и основного/гидрофильного C-конца (остатки 6 и 8) считалась причиной некоторых HR-реакций, с которыми приходилось сталкиваться при использовании второго поколения РГ-ЛГ антагонистов. Этот побочный эффект был существенно уменьшен путем замещения аминокислот на позициях 5, 6 и 8 подходящими аминокислотами. Следующим препятствием на пути развития антагонистов РГ-ЛГ как лекарственных средств была растворимость и агрегация. В случае A-75998 водорастворимость была улучшена за счет 12 - 25-кратного складывания посредством помещения N-MeTyr на позицию 5. Однако, DLS-исследования показывали, что водные растворы по-прежнему содержат некоторые укрупненные частицы, невидимые невооруженным глазом. Это образование укрупненных частиц было устранено сразу после формулирования A-75998 в энкапсин. Единичная доза A-75998 в 2 мг, вводимая подкожно, понижала у мужчин Т до уровней кастрата на более чем 30 ч. Другие антагонисты РГ-ЛГ, в том числе ганиреликс и цетрореликс, также находятся в фазе I/II клинического изучения. Сообщались сведения о клинических исследованиях цетрореликса при раке простаты; in vitro оплодотворении и доброкачественной гипертрофии простаты.

Физико-химические свойства A-75998, синтетического антагониста рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, были исследованы для лечения гормоно-чувствительных злокачественных опухолей и эндометриоза. При ускоренном исследовании стабильности в растворе было показано, что соединение относительно стабильно, и выявлена U-образная кривая изменения pH, с максимальной стабильностью в диапазоне pH между 5,5 и 6,5. Характер кислотной диссоциации A-75998 исследовался с помощью спектрофотометрии в ультрафиолетовых и видимых лучах при 25^oC в ряде буферных растворов с pH от 1 до 13. На основе данных исследования была создана модель, согласно которой диссоциации всех четырех способных распадаться на ионы групп вносит вклад в изменения оптической плотности. Были получены макроскопические константы кислотной диссоциации: p бета 1 = 3,230 0,022, p бета 2 = 4,885 0,030, p бета 3 = 9,871 0,0322 и p бета 4 = 11,026 0,157. Соответствующие микроскопические константы кислотной диссоциации были следующие: рк1 = 3,24 (никотинил), рк2= 4,88 (пиридил), рк5 = 9,91 (тирозил) и рк6 = 10,99 (изопропиллизил). Экспериментальные данные коэффициентов разделения n-октанола и воды измерялись при pH от 2 до 13, кривая этих данных согласовывалась с предполагаемым характером кислотной диссоциации. При том, что при pH<5 была обнаружена довольно хорошая водорастворимость, динамическое рассеяние света A-75998 в буферном растворе с pH 4,5 показало образование укрупненных частиц (агрегацию) с неравномерным распределением размера частиц. A-75998 проявил обратное или термическое застудневание, хлорид натрия усиливает это застудневание и самоассоциирование. Поверхностная активность была pH-зависимой, но свидетельств образования мицеллы обнаружено не было. Исходя из данных результатов, создание парентеральной композиции с A-75998 представляется осуществимым, при условии, что агрегация будет сведена к минимуму.

До настоящего времени аналоги РГ-ЛГ применяются путем ежедневного однократного введения раствора водорастворимых солей в виде инъекционного раствора или многократного назального введения бузерелина ацетата в виде носовых капель (Suprefact nasal) или нафарелина ацетата в виде носовых капель, которые производятся только в США. Как описано выше, для таких форм медицинских препаратов предопределена необходимость частого применения. Инъекции могут проводиться только врачом, носовые капли должны вводиться несколько раз в день. Обе лекарственные формы плохо подходят для лечения хронических заболеваний.

Патент DE-OS 4223282.1 описывает получение микроинкапсулированием лекарственной формы цетрореликса эмбоната пролонгированного действия. Имплантаты являются лекарственными формами, позволяющими увеличить интервалы применения. Например, будучи введенной под кожу, цилиндрическая капсула биологически разлагаемого сополимера поли(молочной-гликолевой кислоты), содержащая гозелерин ацетат, может эффективно снижать уровень тестостерона (Zoladex depot). Ежемесячные инъекции суспензии биологически разлагаемых полимерных частиц, содержащих в качестве активного ингредиента лейпрорелин ацетат, также эффективно снижают уровень полового гормона в течение этого периода (Enatone Monatsdepot).

Обе лекарственные формы пролонгированного действия описаны в следующих патентах и патентных заявках. Их преимущество в интервалах между введениями сопровождается очевидными недостатками, которые будут указаны ниже.

EP 0058481 описывает состав и способ получения имплантатов, распространяемых под товарным знаком Zoladex . Недостаток этой лекарственной формы заключается в дорогостоящем процессе получения цилиндров, требующем экструзионного оборудования и устройств для упаковки, которые вставляют цилиндры в специально сконструированные шприцы с очень толстой канюлей. Диаметр цилиндра составляет 1 мм, а длина - несколько мм, что вызывает у пациентов при введении болезненные ощущения и гематомы. Желательно получение менее болезненных лекарственных форм.

EP 0052510 описывает композицию и способ получения микрочастиц, содержащих, например, нафарелин ацетат. В присутствии хлорированных углеводородов активный ингредиент внедряется в сополимеры поли(молочной-гликолевой кислоты). Применение в этой композиции хлорированных углеводородов неизбежно, т. к. только в них растворимы биоразрушаемые полимеры, необходимые in vivo. Высокое остаточное содержание растворителей в лекарственной форме, полученной указанным способом, составляет примерно 1000 ppm и является недостатком. В соответствии с ранними представлениями хлорированные углеводороды являются канцерогенами. Остаточное содержание растворителей в перевязочных материалах и медицинских препаратах сегодня ограничено значением <50 ppm в соответствии с Европейской фармакопеей (Pharm Europe, Vol.4, N1, March 1992). Указанный способ обладает также тем недостатком, что выход активного вещества, заключенного в микрокапсулы, невелик из-за потерь пептида, в водной фазе, которая обязательно присутствует в процессе.

Уменьшение остаточного содержания растворителей ниже порогового значения для безопасности лекарств если и возможно, то только при применении трудоемких методов последующей обработки. Например, заявлен способ снижения остаточного содержания растворителей с помощью субкритических концентраций CO₂.

B DE 4023134 A1 использован аналогичный описанному способ внедрения пептида в биоразлагающиеся полимеры типа сополимеров поли(молочной-гликолевой кислоты). Согласно заявке, в этом способе для уменьшения потери активного ингредиента вместо ацетата пептида, внедренного в полиэфир, применяют пептидную соль, нерастворимую в воде. Пептидными солями, нерастворимыми в воде, являются памоаты, таннаты, стеараты и пальмитаты. Как уже упоминалось, недостатком способа является необходимость применения канцерогенных углеводородов, что создает проблему физиологически неприемлемого остаточного содержания растворителей хлорметана или хлороформа.

В EP 145240 предложен другой способ внедрения водорастворимых солей пептидов. В усложненном способе активный ингредиент внедряется со значительными потерями при переводе водного раствора активного ингредиента в биоразлагающиеся сополимеры поли (молочной-гликолевой кислот) посредством множественной эмульсии, при этом недостатком способа остается применение хлорированных углеводородов.

В EP 505966 предложено внедрение бузерелина ацетата в сополимеры поли(молочной-гликолевой кислоты) посредством распылительной сушки раствора: активный ингредиент-полимер, содержащего хлоруглеводороды. Недостатком указанного способа является применение канцерогенных хлоруглеводородов в качестве растворителей.

Недостатком применения хлоруглеводородов является не только высокое содержание остаточных растворителей в готовой лекарственной форме, но и с экологической точки зрения применение указанных растворителей создает проблемы, связанные с отходами производства и техникой безопасности.

В Международной заявке WO 9214449 предложено внедрение быстрорастворимых пептидов, таких как гормоны роста, например, в лауриновую кислоту при смешивании активного ингредиента с указанной кислотой, дальнейшем сплавлении и размалывании смеси после охлаждения в частицы размером 100 мкм. В US 5137669 предлагается получение таким же способом пролонгированных лекарственных форм антагонистов РГ-ЛГ для последующего получения инъекционных суспензий с постепенным выделением активного ингредиента. Общими факторами для обеих лекарственных форм является необходимость применения носителей для пролонгированного действия, и только в результате трудоемкого процесса получают инъекционные препараты. До настоящего времени было невозможно доказать толерантность жировых носителей, их надежность и воспроизводимость выделения активного вещества. В случае внедрения в жировую оболочку возможны побочные эффекты в виде инкапсуляций, что недопустимо при длительном лечении в течение нескольких лет.

В DE 3430852 для бромкриптин мезилата, активного ингредиента, для которого очень трудно получить пролонгированную лекарственную форму, синтезирован новый полиэфир в виде полиолоэфира, например, глюкозы с молочной и гликолевой кислотой для получения желаемого режима выделения активного вещества. В этом случае было необходимо провести исчерпывающее и дорогое исследование и токсикологические пробы для получения лекарственной формы с достаточно длительным временем действия, поскольку было ясно, что никакая более простая и дешевая лекарственная форма не сможет дать такой же эффект.

Сущность изобретения Эмбоновая кислота (4,4'-метилен-бис-(3-окси-2-нафталиновая кислота) часто применяется в фармацевтических препаратах для получения слаборастворимых солей медицинских препаратов. Указанные соли дольше расходуются в организме и таким образом проявляют пролонгированный эффект (Rompps Chemie-Lexicon, Stuttgart 1976, стр. 1007).

Обнаружилось, что препарат по п. 1 формулы изобретения проявляет неожиданное пролонгированное действие и улучшенный эффект без применения биоразлагаемых полимеров или жиров. Наблюдалось не только пролонгированное действие, измеренное по длительности подавления гормонов, но также подавлялся рост опухоли в непропорциональной степени.

Предложенный препарат может быть также использован в качестве агониста РГ-ЛГ, например в лейпролиде, бузерелине, гозерелине и трипторелине. Он также может быть использован и в качестве антагонистов бомбезина и соматостатина и аналогов Г-ФРГ.

Экспериментальные исследования проводились в соответствии со следующей методикой: Ингибиторный эффект на карциноме молочной железы, вызванной ДМБА (7,12-диметилбенз[a]-антраценом) у крыс Spraque-Dawley.

Способ: Крысам-самкам Spraque-Dawley в возрасте 50 дней (диета животных: Альтромин R, вода ad lib) вводили перорально 20 мг ДМБА, растворенного в 1 мл оливкового масла, через желудочную трубку. Наблюдение за ростом опухоли проводилось еженедельно пальпацией животных. Примерно у 90% животных наблюдались опухоли, подходящие для экспериментального опыта, на 35-й - 70-й день после введения.

Вес опухоли определялся по методике Druckrey,H., Steinhoff.D., Nakayama. M., Preussmann.R., Anger,K.(1983). Experimentelle Beitrage zum Dosis-Problem in der Krebs-Chemotherapie und zur Wirkungsweise von Endoxan [Экспериментальный вклад в изучение проблемы доз в хемотерапии рака и механизма действия эндоксана], Dtsch. Med. Wschr. 88:651.

Способ был подтвержден сравнением данных о весе опухоли, определенных пальпацией, с данными, полученными непосредственным взвешиванием (после удаления опухоли). Коэффициент корреляции составил 0,98. После того, как общий вес опухолей достиг примерно 1 г, животные были случайным образом распределены в группы контроля по 7 животных каждая. Лечение начиналось немедленно после подкожного введения испытуемых веществ. Гормональное состояние животных определялось посредством мазка вагинальных клеток, окрашенных метиленовым синим, и изучалось в соответствии с методикой Jones,Т.С., Mohr, U, Hunt, R.D (1972): The genital system, in: Monographs on pathology of laboratory animals sponsored by the International Life Science Institute (Springer, N.Y., London).

Экспериментальные данные представлены на фиг. 1. Кривая веса опухоли для нелеченных контрольных животных показывает отсутствие замедления роста. Кривые 1(^*) и 2(^o) соответствуют лечению цетрореликс ацетатом в двух различных носителях. Протяженная кривая 3 показывает резкое снижение веса опухоли после лечения эмбонатом.

Поскольку в этом случае лечение проводилось только разовой дозой, опухоль продолжала расти, т.к. при разовой дозе не происходит уничтожение всех опухолевых клеток.

Предложенный препарат представляет собой рентгеноаморфный осадок декапептида цетрореликса в виде соли эмбоновой кислоты. Водная суспензия этого осадка, которая может содержать изотонизирующие добавки, проявляет, по сравнению с водным раствором пептида, существенное пролонгирование действия на подопытных животных. Неожиданно оказалось, что продление действия было примерно таким же, как при инъекции суспензии, которая содержала осадок эмбоната пептида в биоразлагаемом полимере, например, сополимерах поли(молочной, гликолевой кислоты). В частности, этот результат оказался неожиданным потому, что, как указывалось выше, только очень трудоемкие лекарственные формы, которые, как правило, содержат активный ингредиент в биоразлагающихся полимерах, до настоящего времени проявляли значительное пролонгированное действие.

Этот результат был неожиданным еще и потому, что в соответствии с J.Pharm Pharmavol. 47, 878-883 (1985), пуриметамин, производное 2,4-диаминопиримидина, не проявило различий по сравнению с его солью эмбоновой кислоты с точки зрения фармакокинетики, изменений плазменного уровня и AUC (кривой зависимости концентрации от времени) после подкожного введения мышам.

Аналогично, имипрамин HCl не проявил различий по сравнению с имипрамин эмбонатом после орального введения (Indian Jornal of Phisiology and Pharmacology 25 (4), 331-338 (1989). Кристаллические инъекционные суспензии непептидных медицинских препаратов, таких как преднизолон или триамцинолон, являются известными препаратами с пролонгированным действием, также как кристаллические цинковые суспензии инсулина, применяемые для лечения диабетов. Инсулин содержит 51 аминокислоту. Все последние перечисленные препараты являются кристаллическими, в то время как предложенный препарат по данным рентгеновского дифрактометрического анализа является аморфным. Размер частиц предложенного препарата составляет 5 - 200 мкм. Слаборастворимые соли аналогов РГ-ЛГ и бомбезина с размерами частиц меньше 5 мкм проявляют пролонгирующий эффект меньший, чем у предложенного препарата. Аналогично, Слаборастворимые соли аналогов РГ-ЛГ и бомбезина с размерами частиц больше 200 мкм проявляют более слабый пролонгирующий эффект, чем у предложенного препарата.

Другим преимуществом предложенного препарата является более высокая степень соответствия: качество лекарства, полученного из данного препарата, более стабильно.

Согласно изобретению предложена слаборастворимая соль аналога бомбезина, у которой, как сказано выше, размер частиц составляет 5 - 200 мкм, формулы: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-Met-NH₂.

В журнале Biochemistry, 2 мая 1978 г., N 17(9), стр 1766-1771, в статье Rivier JE and Brown MR "Бомбезин, аналоги бомбезина и ассоциируемые с ним пептиды: воздействие на терморегуляцию" описан синтез 39 пептидов, ассоциируемых с бомбезином (структурные аналоги или другие пептиды, встречающиеся в природе), а также биологическая оценка терморегуляции. Указанная система биологической оценки измеряет способность пептидов, введенных внутриполостной инжекцией, понижать температуру у крыс, помещенных на холод (4^oC). Наиболее сильными аналогами бомбезина оказались те, у которых были изменены позиции от 1 до 5 (не включительно), что свидетельствует о том, что C-оконечный декапептид достаточен для полной эффективности. Gln на 7-й позиции и Gly на 11-й позиции можно замещать, соответственно, D-Gln и D-Ala (но не D-Pro или D-Phe), без какого-либо изменения эффективности. Метионин на 14-й позиции можно замещать его D-изомером, сохраняя 10% биологической активности. Любое другое изменение C-конечной точки (удаления свободной кислоты, за исключением N-метиламида) резко уменьшает биологическую активность этих пептидов. Было установлено, что среди пептидов, встречающихся в природе, эффективностью, соответствующей на 100% эффективности бомбезина, обладает алитезин, тогда как эффективность литорина, нейротензина, ксенопсина, вещества P, физалемина и эледойсина оказалась ниже на четыре порядка. Установлено, что самым коротким пептидом, обладающим полной биологической эффективностью, является октапептид des-Glp-Gln-Arg- Leu-Gly-Asn[D-Glp7, D-Ala11]-бомбезин.

В качестве примеров бомбезина и его аналогов можно привести следующие: 1. Бомбезин Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met- NH₂ Представляет собой тетрадекапептид, выделенный из кожи земноводных, биологически активный как в центральной нервной системе, так и в желудочно-кишечном тракте. Также было установлено, что бомбезин ослабляет питание у крыс. Биохимическая характеристика дана бомбезин-подобным пептидам на основе исследований на мозгу крыс (A.Anastasi et al., Experentia 27, (1971), G.Berlaccini et al., Br.J.Pharmacy, 52, 219 and 227 (1974).

2. (Leu¹³-()-Leu¹⁴)-Бомбезин () - редуцированная пептидная связь.

Этот пептид показал себя специфичным и конкурентоспособным антагонистом бомбезина, особенно в отношении роста клеток 3Т3 швейцарской мыши in vitro.

(A. Cowan, TIPS-9, 1 (1988), S.Mahinoual et al., Cancer Res.51, 1798, (1991)).

3. (Lys³)-Бомбезин Pyr-Gln-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ 4. (D-Phe¹²)-Бомбезин Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-D-Phe-Leu-Met- NH₂ Этот пептид относится к новому классу антагонистов рецепторов бомбезина, которые взаимодействуют только с рецептором бомбезина. В силу этой специфичности, этот пептид может быть полезен при определении роли бомбезина в различных физиологических и патологических процессах (H.Heinz-Erian et al., Am.J.Physicl. 252, G439 (1987)).

5. (D-Phe¹², Leu¹⁴)-Бомбезин Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-D-Phe-Leu-Leu- NH₂ Этот аналог бомбезина является специфичным антагонистом рецептора бомбезина (H.Heinz-Erian et al., Am.J.Physicl. 252, G439 (1987)).

6. (Tyr⁴)-Бомбезин Pyr-Gln-Arg-Tyr-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met- NH₂ (J.E.Rivier and М.Т.Brawn, Biochemistry, 17, 1766 (1978)).

7. (Tyr⁴,D-Phe¹²)-Бомбезин Pyr-Gln-Arg-Tyr-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-D-Phe-Leu-Met- NH₂ Этот аналог бомбезина является специфичным антагонистом рецептора бомбезина (P.Heinz-Erian et al., Am.J.Phisicl. 252, G439 (1987)).

8. (D-Cys⁶, Asn⁷, D-Ala¹¹, Cys¹⁴)-Бомбезин (6-14) H-D-Cys-Asn-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Cys-NH₂ Действуя в качестве агониста бомбезина, это (D-Ala¹¹)-производное демонстрирует значительную эффективность при значениях EC₅₀ около 610^-8 М.

(D.H.Coy et al., Peptides, Chemistry and Biology, Proceeding of the 12th American Peptide Symposium, Cambridge, MA, p.40, J.A.Smith and J.E.Rivier, eds, Escom, Leiden (1992)).

() - редуцированная пептидная связь.

Этот высокоэффективный антагонист бомбезина в субмикромолярных концентрациях ингибировал развитие опухоли 41 клетки при мелкоклеточном раке легких in vitro. (F.Thomas et al., Cancer Res. 52, 4872 (1992).

10. (D-Phe⁶, Leu-NHEt¹³, des-Met¹⁴)-Бомбезин (6-14) H-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NHEt Антагонист рецептора бомбезина, у которого значения EC₅₀ для клеточной секреции и роста находятся вблизи пикомолярной области.

(J.E.Rivier and G.R.Marshall, eds., Escom, Leiden (1990)).

11. Бомбезин (8-14) H-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ 12. Цикло-(D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu) Cyclo(-D-Phe-His-trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu) Агонист бомбезина, со значением EC₅₀, равным 310^-7 М (D.H.Coy et al., Peptides, Chemistry and Biology, Proceedings of the 12th American Peptide Symposium, Cambridge, MA, p.40, J.A.Smith and J.E.Rivier, eds, Escom, Leiden (1992)).

Приведенный перечень аналогов бомбезина приведен только в качестве доказательства их получения и существования. Данный перечень может быть продолжен, а изобретение не ограничивается приведенным перечнем.

Пример 1 Водный раствор эмбоновой кислоты, содержащий избыток щелочи, добавили к ацетатному раствору цетрореликса ацетата. При этом взяли эквимолярное количество пептида (рассчитанное на свободное основание) по отношению к эмбоновой кислоте. В результате образовались желтые кристаллы эмбоновой кислоты. При добавлении разбавленного раствора гидроксида натрия до pH 7-7,5 эмбоновая кислота растворилась и соосадилась с декапептидом в виде водной соли эмбоната цетрореликса. Молярное соотношение пептид : эмбоновая кислота составило 2:1 (моль/моль). Осадок отфильтровали, промыли водой и высушили.

Пример 2 Ацетат цетрореликса и эмбоновую кислоту в эквимолярном соотношении растворили в диметилацетамиде, и раствор добавили по каплям в воду. Белый осадок композиции цетрореликс эмбонат пептид : эмбоновая кислота с соотношением 2:1 (моль/моль) отфильтровали и высушили.

Пример 3 Цетрореликс и эмбоновую кислоту в молярном соотношении 1:1,6 растворили в диметилацетамиде, с возможным содержанием воды, и полученный раствор добавили по каплям в воду. Желтый осадок отфильтровали и высушили. Полученный осадок перевели в пастообразное состояние 70%-ным этанолом, высушили при 35 ^oС и просеяли через сито с размерами 80-125 мкм.

Пример 4 Щелочной раствор эмбоната добавили к водному этанольному раствору ацетата пептида (цетрореликс, антареликс, ганиреликс, антид, A-75998 или аналог бомбезина) в молярном соотношении пептид : эмбоновая кислота, равном 2:1. Белый осадок отфильтровали и высушили. Сухой осадок смочили 50%-ным этанолом, высушили в вакуумной сушильной камере и пропустили через сито.

Полученный белый осадок содержит композицию пептид : эмбонатная соль в соотношении 2:1 (моль/моль).

Пример 5 Щелочной раствор эмбоната добавили к водно-этанольному раствору ацетата пептида в молярном соотношении пептид : эмбоновая кислота, равном 1:1,6. Желтый осадок отфильтровали и высушили. Высушенный осадок смочили 50%-ным этанолом, высушили в вакуумной сушильной камере при 35^oC и просеяли через сито. Полученный желтый продукт содержал пептид-соль эмбоната в соотношении 2:1 в избытке эмбоновой кислоты.

Эксперименты по продолжительности действия на животных: Суспензии осадков ввели подкожно крысам-самцам в дозе 0,5 мг цетрореликса на кг веса тела и измеряли после введения действие пептида по уровням тестостерона в плазме. Действие цетрореликса заключается в снижении уровня тестостерона. Инъекционную суспензию тестировали в соответствии с DE 40232134 A1. Указанная суспензия содержала эмбонат пептида в сополимерах поли(молочной-гликолевой кислот). Продолжительность действия лекарственной формы цетрореликса без рилизинг-эффекта определили при исследовании водного раствора ацетата цетрореликса.

На фиг. 3 показано значение уровня тестостерона, определенного после 300 ч введения крысам-самцам водного раствора ацетата цетрореликса (D-20761). Эффект подавления тестостерона достигался в течение 6 ч после введения. Подавление до значения ниже 1 нг/мл еще можно было отметить у двух животных через 24 ч, а у трех других через 48 ч или два дня.

На фиг. 2 показан уровень тестостерона после 300 ч у четырех животных (N 11-14) после введения той же дозы цетрореликса в виде суспензии эмбоната цетрореликса (D-20762) без вязких добавок, полученной в Примере 1 (D-20762). Подавление тестостерона также достигалось спустя 6 ч после введения, уровни повышались выше 1 нг/мл у одного животного спустя 192 ч (восемь дней), у других трех животных достоверно продолжалось до девятого дня.

На фиг. 4 показаны изменения уровня тестостерона у крыс, при лечении эмбонатом согласно изобретению (размер частиц 80-125 мкм).

Сравнение фиг. 2-3 с фиг. 4 убедительно показывает преимущество предложенного препарата.

Формула изобретения

1. Слаборастворимая соль аналога рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона РГ-ЛГ, размеры частиц которой составляют 5 - 200 мкм, отличающаяся тем, что аналогом РГ-ЛГ является цетрореликс, антареликс, ганиреликс, антид или А-75998.

2. Соль по п.1, отличающаяся тем, что диаметр частиц составляет 10 - 150 мкм.

3. Соль по п.1, отличающаяся тем, что диаметр частиц составляет 20 - 125 мкм.

4. Слаборастворимая соль аналога бомбезина, отличающаяся тем, что диаметр частиц составляет 5 - 200 мкм.

5. Соль по любому из пп.1 - 4, отличающаяся тем, что является солью эмбоновой кислоты.

6. Фармацевтическая композиция, содержащая соль по любому из пп.1 - 5.

7. Применение соли по любому из пп.1 - 5 для получения медицинских препаратов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Центарис ГмбХ (DE)

Извещение опубликовано: 20.08.2004        БИ: 23/2004