Способ оплодотворения ин витро

Способ оплодотворения ин витро

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии. Осуществляют пункцию ооцита и вводят один или несколько из этих ооцитов в контейнер, содержащий культуральную среду, без введения воздуха или СО₂, предназначенную для оплодотворения и культивирования ооцита(ов), а также сперматозоидов, и вводят закрытый контейнер в вагинальную полость или в матку для обеспечения оплодотворения ооцита(ов) и культивирования эмбриона(ов). Причем процесс осуществляют без стимуляции цикла с контролем LH путем определения его содержания в крови и программированием пункции ооцита в зависимости от значения LH. Перед введением контейнера в вагинальную полость он может выдерживаться для созревания при 37°С в течение приблизительно 2-3 ч. Заявлен также комплект оборудования для реализации данного способа, содержащий прибор для экспресс-определения содержания LH, иглу для пункции ооцита, фильтрующую установку для приготовления спермы, контейнер для оплодотворения и/или созревания ооцита(ов) и культивирования эмбрионов и культуральные среды. Способ обеспечивает упрощение процедуры оплодотворения с высоким качеством. 2 с. и 15 з.п.ф-лы.

С момента рождения в 1978 году Луизы Броун, первого ребенка, рожденного в результате оплодотворения ин витро, в способе оплодотворения ин витро появилось мало крупных изменений.

Предшествующий уровень техники В настоящее время применение стимуляции яичников стало классическим, вследствие простоты программирования пункции ооцитов. Различные протоколы стимуляции яичников, цитрат кломифена - hMG, только hMG, FSH- hMG- и совсем недавно агонисты LH -RH вместе с hMG значительно увеличили количество ооцитов, собранных во время пункции (от 2,5 - 3,5, в среднем, до 8-10 в настоящее время). Следствием этого более значительного количества собранных ооцитов стало увеличение количества эмбрионов. Вследствие риска многоплодной беременности, вызванной переносом более трех эмбрионов, большинство центров искусственного зачатия оснащены морозильной установкой, позволяющей консервировать эмбрионы и вторично их пересаживать. Стоимость этих протоколов стимулирования с используемыми количествами гормонов и большим количеством исследований (определения содержания гормонов и эхографические исследования), необходимых для контролирования фолликулярного роста, очень высока.

Методика собственно оплодотворения, осуществляемая в лабораторных условиях с использованием инкубатора с СО₂, вытяжного шкафа ламинарного потока, инверсивного микроскопа требует значительных первоначальных капиталовложений (см. DAMEWOOD, M.D.: In Vitro Fertilization: Insurance and Financial considerations, Assisted Reproduetion Review I : 38, 1991).

К длительности манипуляций, вследствие сложности методики, добавляется необходимость контролировать такие параметры, как: содержание CO₂, температура и относительная влажность в инкубаторе. Это еще больше повышает стоимость процедуры. Эта высокая стоимость, оцениваемая в США в 6500 дол. за попытку, во Франции - приблизительно 15000 франков, осложняет развитие и распространение этой технологии.

К этому добавляется то, что результаты, полученные в лучших центрах по оплодотворению, все еще ниже естественной плодовитости, т.е. 20% беременностей на стимулированный цикл. Высокая стоимость, а также риск, вызванный непосредственно этим типом лечения (гиперстимулирование, многоплодная беременность, хранение и манипуляции с замороженными эмбрионами), побудили административные власти так называемых развитых стран принять меры по ограничению развития центров искусственного оплодотворения. Эти меры, без сомнения, идут вразрез с интересами бесплодных пар.

Опыт Заявителя в области оплодотворения ин витро с 1979 года позволил разработать новую процедуру, описанную ниже.

I. Внутривагинальное культивирование (CIV).

Сначала делается ссылка на международную публикацию WO 87/02879, заявка подана 07 ноября 1986 г. и опубликована 21 мая 1987 г. и на международную публикацию WO 88/08280, заявка подана 02 мая 1988 г. и опубликована 03 ноября 1988 г. Совокупность сведений, описанных в этих двух предшествующих публикациях, изобретателем которых является настоящий Заявитель, войдет составной частью в настоящее описание.

В первую очередь, было отмечено, что собственно технология оплодотворения может быть значительно упрощена. Таким образом, мы это показали на примере технологии так называемой "CIVETE" (внутривагинальное культивирование и перенос эмбриона), что добавление воздуха, обогащенного 5% CO₂, не было необходимым для поддержания хороших условий культивирования. Однако во избежание какого-либо повреждения культуральной среды необходимо наполнить ею полностью пробирку без добавления воздуха. Также, чтобы значительно не изменить pH культуральной среды, семенная концентрация (ответственная за метаболическое потребление) была значительно сокращена. 10000-20000 подвижных сперматозоидов/мл, тогда как по классической технологии, по меньшей мере, 50000 сперматозоидов/мл. Эта технология требует меньше манипуляций и не требует смены культуральной среды.

По классической технологии оплодотворения ин витро обнажение с помощью пипетки или иглы осуществляется через 18-30 часов после осеменения. Эта процедура требует определенной экспертизы и может нанести травму эмбриону. По технологии CIY спонтанное обнажение эмбрионов происходит в более 80% случаев. Это спонтанное обнажение соответствует спонтанному отделению клеток кумулуса, которые окружают корону (см. RANOUX C., AUBRIOT F.X., DUBUISSON J. B. CARDONE FOULOT H., POIROT C., CHEVALLIER O.,; A New in vitro fertilization technique: intravaginal culture. Fertil Steril 49: 654, 1988. RANOUX C. , SEIBEL V. C. : New technique in fertilization : intravaginal cutlure and microvolume straw, J In Vitro Fert "Embryo Transfer 7": 6, 1990), оно является отражением качества культуры и гамат. В случае токсичности, вызванной средствами (этиленоксид), либо в результате подготовки пункции ооцитов, эластичная строма плотных клеток окружает эмбрион, что требует ее удаления для оценки стадии развития. У эмбриона, в случае механического обнажения с помощью иглы или пипетки, никогда не было стадии развития больше 2 клеток в присутствии фрагментов и неравномерного, асимметричного и анормального вида клеток.

Технология CIY проста, менее дорогостояща, для нее требуется только небольшой инкубатор и стереомикроскоп, установленный под вытяжным шкафом ламинарного потока, небольших размеров. Она не требует крупной лабораторной инфраструктуры и, в частности, инкубатора с СО₂. Технология СIY обуславливает участие пациентки, что обеспечивает лучшие физиологические условия. Эта технология более физиологична, причем оплодотворение осуществляется в вагине при температуре тела с температурными колебаниями, обычно наблюдаемыми в периовуляционный период. Оплодотворение, осуществляемое внутривагинальным методом, поднимает меньше этических проблем и представляет меньше риска ошибки между гаметами. Кроме того, нет риска поломки инкубатора, что может поставить под угрозу оплодотворение нескольких пациенток. Вследствие своей простоты и стандартности эта технология не требует высокого уровня технической подготовленности персонала и легко воспроизводима без изменения результатов.

Кроме того, было показано, что результаты, полученные по технологии CIY, были эквивалентны результатам, полученным по классической технологии оплодотворения ин витро с 15% рождаемостью на пункцию.

II. Естественный цикл с программированием пункции путем введения hCG.

В результате многолетнего опыта стимуляции яичников с использованием различных протоколов, упомянутых выше, не наблюдалось значительного различия между этими протоколами в проценте рождаемости на попытку. Этот процент, даже в лучшие смены, всегда составлял от 10 до 15%. Это явилось основной причиной возврата к естественному циклу. Другими причинами явились успехи, достигнутые с момента рождения первого "младенца из пробирки".

В ходе первых попыток при естественном цикле фолликулярный рост контролировался путем определения содержания в моче экстрадиола (Е₂) и LH без эхографического контроля, откуда неопределенность в определении зрелости ооцита и в выборе наилучшего момента для проведения пункции ооцита. Эхографический контроль совместно с появлением экспресс-определения гормонального содержания в крови эстрадиола и LH позволили добиться большей точности в определении овуляции. Применение hCG в стимулированных циклах позволило программировать пункцию фолликул через 34-36 часов после инъекции, избегая, таким образом, пункций ооцитов в любой час дня и ночи.

Наконец, появление новых способов проведения пункций не посредством когелиоскопии, а посредством эхографического контроля с помощью вагинального зонда обеспечило значительный технический прогресс. Контролируемая эхографическая пункция не требует, как правило, анестезии и позволяет обойтись без хирургической инфраструктуры. Использование этих достижений позволило разработать упрощенный протокол естественного цикла с программированием пункции посредством hCG (см. FOULOT H., RANOUX C., DUBUISSON J.B., RAMBAUD AUBRIOT F. X. POJROT C., In vitro fertilization without ovarian stimulation: a simplified protocol appleid in 80 cycles. Fertil Steril 52: 617, 1989).

Раскрытие изобретения Контроль фолликулярного роста начинается только на 8 или 9 день цикла в зависимости от нормальной продолжительности цикла пациентки, количество гормональных определений очень ограничено, в среднем 5 на цикл с 2 или 3 аудиографическими исследованиями.

Если размер фолликулы превышает 18 мм при E2 180 пг/мл и без пикового значения LH, вводят hCG и берут пункцию ооцита через 34-36 часов. Если диаметр больше или равен 18 мм, а E2 выше или равно 180 мг/мл при LH от 20 до 40 U 1/л, hCG вводят немедленно и берут пункцию 24 часа после определения содержания в крови. Наконец, если LH 40 U 1/л, hCG не вводят, а пункцию производят на следующий день после количественного анализа.

Упрощенный протокол позволил получить в исследовании, проведенном на 80 попытках, 22,5% беременностей на цикл, из которых 17,5% развивающихся с рождением здоровых детей. В основу изобретения положена задача создать способ оплодотворения, в котором контроль фолликулярного роста был бы сокращен, прост и намного дешевле. Пункция одной фолликулы занимает мало времени, проста и хорошо переносима пациенткой. Этот способ не требует анестезии, а только премедикацию. Вследствие отсутствия медиации, сокращенного технологического времени, ограниченного использования одноразовых инструментов, стоимость процедуры значительно ниже. Отсутствие стимулирования и получение одного ооцита совсем устраняет риск гиперстимулирования. Проблемы, связанные с замораживанием эмбрионов, устранены. Не существует возможности многоплодной беременности с родовыми осложнениями и склонностью к заболеваниям новорожденных.

Эта задача решается тем, что в способе оплодотворения, при котором осуществляют пункцию ооцитов и ооцит(ы) вводят в контейнер, содержащий культуральную среду, без наличия воздуха или СО₂, предназначенный для оплодотворения и культивирования ооцита(ов), а также сперматозоидов, и закрытый контейнер вводят в вагинальную полость или в матку с целью оплодотворения ооцита(ов) и культивирования эмбриона(ов), согласно изобретению способ осуществляют без стимулирования цикла с контролем содержания в крови LH путем количественного анализа и программированием пункции ооцитов на основании значений E2 после первого удвоения значения LH.

Перед пункцией ооцитов не производится инъекция hCG, а предпочтительно сразу после пункции.

Предпочтительно для лиц 40 лет пункцию программировать через 34-36 часов после удвоения базового значения LH с содержанием ниже 40 U 1/л.

Предпочтительно для молодых пациенток после стагнации значения LH ниже 40 U 1/л после удвоения базового значения программируется пункция ооцитов приблизительно через 48 часов после определения удвоения базового значения.

Предпочтительно созревание ооцита(ов) осуществляется после отбора. Это созревание осуществляется предпочтительно путем поддержания температуры контейнера приблизительно 37^o в течение 2-6 часов.

Настоящее изобретение дает возможность применения этого способа для одного взятого и оплодотворенного ооцита.

Для осуществления способа предусматривается комплект оборудования, который включает устройство экспресс-определения содержания LH, иглу для пункции ооцита(ов), фильтрующую установку для приготовления спермы, контейнер для оплодотворения ооцита(ов) и культивирования эмбриона(ов) со средствами закрепления в неподвижном состоянии. К этому можно добавить культуральные среды для промывки фолликулы, подготовки спермы, созревания и оплодотворения ооцита. Каждый из упомянутых элементов комплекта оборудования сам по себе известен.

Кроме того, в комплект оборудования могут также включаться зеркало одноразового пользования, катетер для переноса одного или нескольких эмбрионов и/или шприц для инъекции hCG Наконец, все элементы, составляющие комплект оборудования, стерилизованы, герметично упакованы и предназначены для одноразового пользования.

Кроме того, поставленная задача решается тем, что в способе оплодотворения ооцита(ов) ин витро и культивирования эмбриона(ов), по которому поэтапно, в отсутствии обогащенного СО₂ воздуха, заполняют контейнер жидкой культуральной средой для ооцита и эмбриона и, по крайней мере, одним ооцитом и сперматозоидами, закрывают контейнер, вводят контейнер в вагинальную полость или в матку для оплодотворения и расщепления оплодотворенного(ых) ооцита (ов), согласно изобретению перед введением контейнера в вагинальную полость или матку его выдерживают при температуре 37^o в течение приблизительно 2-6 часов.

Варианты осуществления изобретения III. Оплодотворение ин витро в кабинете специалиста При простоте и высоком проценте успеха в каждой из процедур был рассмотрен полностью амбулаторный метод, который позволяет осуществить оплодотворение в кабинете специалиста при стерильности пары. В исследование были включены две группы: ГРУППА I (август 1990 - февраль 1991), в эту группу были включены 15 пациентов, II - моложе 40 лет и 4, возраст которых превышал 40 лет. Было проведено 25 попыток этой процедуры оплодотворения ин витро. 3 пациенткам были проведены по 3 процедуры, 4 - по 2 процедуры. Показаниями для выбора оплодотворения ин витро стали: для 9 пациенток - стерильность труб, для 3 - мужская стерильность, в 1 случае - необъяснимая стерильность и наконец в 2 случаях - фактор шейки матки. Группа 1 характеризуется и фундаментально отличается от группы 2 добавлением фазы образования желтого тела. В этой группе это добавление осуществлялось путем введения синтетического прогестерона внутримышечно каждый день, доза 25-50 мг.

ГРУППА 2 (март 1991 - май 1991): в эту группу были включены 16 пациенток. Каждой было проведено по 1 попытке, т.е. 16 попыток, 13 попыток было осуществлено на пациентках моложе 40 лет, 3 - на пациентках старше 40 лет. В 9 случаях стерильность обуславливалась непроходимостью труб, в 4 случаях - природа стерильности необъяснена, в 2 случаях - из-за эндометриоза, в последнем случае - из-за мужского фактора. В этой группе добавление фазы образования желтого тела было осуществлено с помощью hCG, как и изначально в ходе исследования спонтанного цикла. hCG вводится внутримышечно в день переноса 15000U 1/л и еще 2 раза с интервалом в 3 дня.

Что касается протокола, действия были практически идентичны для обеих групп. Возникшие во второй группе отличия, к ним мы вернемся позже, позволили разработать новый протокол спонтанного цикла, который является предметом настоящей заявки.

Контроль фолликулярного роста, критерии инъекции hCG для программирования пункции были такими же, как описано ранее, за исключением последних 8 попыток. Методика пункции фолликул была та же под эхографическим контролем. Однако лучший технический опыт позволил сократить наполовину среднюю продолжительность процедуры с 24 минут в первой группе (8-50 минут) до 12 минут, в среднем, во второй группе (7-25 минут).

Для технологии CIY была применена описанная процедура за исключением модификаций, к которым мы вернемся позже, и в соответствии с новым протоколом спонтанного цикла.

Был изменен еще один элемент - метод удержания пробирки в вагине. Сначала использовалась диафрагма, которая была заменена пластиковой губкой. Фактически, используемые в США диафрагмы содержат на поверхности вещество, разрушающее сперматозоиды, которое может отрицательно воздействовать на качество эмбриона. Перенос эмбриона осуществлялся классическим методом с помощью катетера.

РЕЗУЛЬТАТЫ: ГРУППА 1. Из 25 попыток, 18 привели к получению ооцитов, в 4 из них получено по 2 ооцита. Из этих 22 ооцитов после проведения CIY было получено 23 эмбриона, однако, только 2 биохимические беременности окончились переносом эмбрионов. В 7 попытках не получили ооциты, 5 - по причине разорванной или прорванной в ходе пункции фолликулы, 1 - из-за овуляции до пункции, в последнем случае ооцит не был получен после нескольких промывок.

ГРУППА 2. Из 16 попыток было получено 16 ооцитов, однако, 2 из них имели прорванную блестящую зону, таким образом, оплодотворение по технологии CIY окончилось только получением 14 эмбрионов. Были получены 4 беременности, из которых 3 клинические развивающиеся, биение сердца плода прослушивалось на эхографе. Другой интересный результат: процент спонтанно обнаженных зародышей, который составлял (8/22) для группы 1, тогда как во второй группе он достигал 86% (12/14) с эмбриональной стадией, чаще 4 или 5 клеток, тогда как в первой группе она составляла чаще, только 2 или 3 клетки.

Эти результаты ясно показывают преимущество процедуры, используемой во второй группе, по сравнению с процедурой в первой группе. Это различие частично объясняется большим опытом проведения процедуры и добавлением фазы образования желтого тела посредством hCG. Однако думается, что основным элементом является новый протокол спонтанного цикла, который детально описывается ниже.

НОВЫЙ ПРОТОКОЛ Фактически: 4 беременности в группе 2 были получены на последних попытках с использованием нового протокола. Последние 8 попыток были проведены на 8 пациентах, 5 - моложе 40 лет и 2 старше 40 лет. Показания: в 4 случаях - стерильность труб, в 2 - причина необъяснена и наконец в последнем случае - мужская стерильность. В этих 8 попытках hCG не вводился и пункция программировалась исключительно на основании значений LH с оценкой пикового значения LH. Были сохранены те же значения LH, которые использовали ранее. Первое удвоение базового значения LH с содержанием ниже 40 U 1/л было отмечено как точка отсчета пикового значения. Это удвоение содержания LH наблюдалось чаще в утренней пробе крови (от 8 до 10 часов). Тогда пункция программировалась через 34-36 часов после пробы крови, т.е. на следующий день вечером. Пробу крови синтетически брали после полудня (3-5 часов), выявляя иногда стагнацию LH со значением LH, приблизительно идентичным утреннему, и всегда 40 U 1/л. Анализ первых результатов и отсутствие беременности при этом типе стагнации заставляют думать, что пункция была осуществлена очень рано. При наличии стагнации пункция должна быть отложена на утро через день для лучшего созревания ооцитов.

За исключением пациенток 40 лет из-за большого риска овуляции до пункции, т. к. созревание ооцитов, по всей видимости, происходит у них быстрее. Значение LH при последующем определении (как правило, утром следующего дня) выявляет значение LH выше 40 U 1/л, поддерживая, таким образом, стагнацию, выявленную при предыдущем определении.

Опыт Заявителя показал, что если содержание E2 падает (на 30% от предшествующего значения) или остается стабильным (до 10% выше или ниже предшествующего значения) по сравнению с содержанием E2 при первом удвоении базового значения LH, пункция должна программироваться, как и предусмотрено, через 34-36 часов после первого удвоения LH. Фактически, пункция должна программироваться сразу же после того, как три определения E2 дают одинаковое значение после удвоения базового значения LH. Если содержание E2 на следующий день после рассматриваемого пикового значения LH увеличилось более чем на 20% от удвоенного значения по отношению к базовому значению, пункция осуществляется через 30-34 часа после достижения наивысшего содержания E2 (преждевременный ложный пик LH).

Другой особенностью стало введение 5000 U I hCG непосредственно после пункции ооцитов, причем добавление фазы образования желтого тела посредством hCG осуществляется, как описано ранее. При отсутствии точной информации о зрелости ооцита, после отбора ооцита добавляется фаза созревания. Ооцит помещается при 37^oC на 2-30 часов в пробирку, полностью наполненную культуральной средой (B2 Menezo) без воздуха и СО₂.

Результаты выявили качество этого типа протокола. Фактически, на 4 беременных пациентках - 3 - развивающиеся клинические беременности: - 1 у пациентки моложе 40 лет (29 лет 11 месяцев на момент процедуры), подвергшейся лечению от необъясненной стерильности, - 1 у пациентки 30 лет с эндометризом и при наличии мужского фактора, для которой эта технология была назначена в диагностических целях для выяснения возможности слияния двух гамет. Эта пациентка подверглась осеменению от донора перед этой попыткой из-за тяжелого мужского фактора, - у 1 пациентки старше 40 лет, подвергшейся лечению от эндометриоза.

Наконец, интересная абортивная беременность 32-летней пациентки, которая подверглась лечению от стерильности по необъяснимой причине. По всей видимости, пункция была взята слишком рано. Анализ четырех других случаев выявил: - для одной пациентки 38 лет с непроходимостью труб, осложненной мужским фактором, который вызвал получение эмбриона с неравномерными 2PN, который был перенесен, хотя практически не было шансов на успех (закон Массачусеттс обязывает перенести любой полученный размножением эмбрион).

- Для другой пациентки 32 лет эмбрион очень хорошего качества был получен на стадии 6 клеток, однако, по всей видимости, причиной неудачи стало его перенесение, крайне сложное и травматичное (несмотря на введение VALUM, VERSED и местную анестезию).

- Для третьей пациентки 40 лет с непроходимостью труб получен эмбрион невысокого качества с асимметричными и неравномерными бластомерами и остаточных тел.

- Наконец, для последней пациентки 35 лет с непроходимостью труб эмбрион на стадии 3 клетки был получен при преждевременной пункции ооцитов.

ВЫВОДЫ Предварительные исследования спонтанного цикла с программированием пункции посредством hCG выявили низкий процент беременностей при введении 5000 U1 hCG, при получении результатов, показывая начало пика LH (удвоение базового содержания при LH 40 U 1/л). Выдвигается гипотеза, что hCG был введен в неадекватный момент и вероятно должен был повлиять отрицательно на зрелость ооцитов. Опыт Заявителя по осуществлению пункции при пиковом значении LH, где наблюдались значительные колебания содержания E2 от 120 до 350 пг/мл при пиковом значении LH, подтвердил это. Также было отмечено, что фолликула непрочна и часто пропитывается в момент пункции. Эти две констатации побудили отказаться от введения hCG перед пункцией для использования в полной мере естественного цикла.

Существенное значение имеет введение 5000 U 1 hCG сразу же после пункции, фактически, одной из проблем оплодотворения ин витро, которая может объяснить низкий процент успеха, является, по всей видимости, отсутствие синхронности роста эмбриона и роста эндометрия. Эмбрион, находясь в оптимальных культуральных условиях, возможно, будет развиваться быстрее, чем в естественных условиях. Обратное было отмечено для эндометрия, созревание которого зависит от гормональной секреции клеток гранулозы. Потенциал клеток гранулозы может быть понижен в ходе пункции в соответствии с клетками, "оторванными" в процессе отсасывания фолликулярной жидкости и различных промывок фолликулы. Мы намеревались установить эту синхронность путем консервации эмбриона в течение короткого периода, за 24-36 часов до переноса, при температуре ниже 37^o (American Fertility Society 1990, p.38), или консервируя ооцит при 40^oC в культуральной среде на основе яичного желтка и криозащитного в течение 24 часов осеменением. Фактически, наиболее простым методом, который мы использовали, является вероятно введение hCG сразу после пункции. Таким образом, hCG будет стимулировать клетки гранулозы и увеличит содержание прогестерона в крови, что, как следствие созреванию эндометрия, а также его восприимчивости с целью имплантации эмбриона. Введение hCG должно быть задержано до момента осеменения, если созревание ооцита превышает 10 часов.

Основным элементом для программирования пункции, вероятно, является контроль изменения LH в крови. Программирование пункции ооцита по результатам двух определений LH в крови ежедневно может показаться неточным и малоэффективным. Однако результаты, полученные в первых 8 попытках, показали обратное как с точки зрения количества отобранных ооцитов (8/8), так и количества полученных эмбрионов (8/8). Этот новый протокол, основанный на двух определениях содержания E2 в крови в один день, оказалось дал эквивалентные результаты выше результатов пункции посредством введения hCG.

Основным этапом является определение момента времени, когда содержания LH становится выше 40 U 1/л. Получение этого результата ведет к осуществлению пункции через 24 часа после пробы крови и при необходимости к задержке момента пункции, программирование которой было предусмотрено на основании первых определений содержания LH. Добавление фазы созревания ооцитов при 37^oC в отсутствии воздуха, обогащенного СО₂, позволяет повысить качество ооцитов.

Сочетание естественного цикла с пункцией одного ооцита при эхографическом контроле и его оплодотворение по технологии CIY позволили при бесплодии впервые осуществить оплодотворение ин витро в кабинете специалиста. Эта технология, применяемая полностью в амбулаторных условиях, проста, легко воспроизводима, не требует наличия ни операционного зала, ни анестезии, ни сложных технических средств, используемые инструменты просты: стереомикроскопы, небольшой вытяжной шкаф ламинарного потока, инкубатор малой емкости, 37^oC без СО₂. Все это оборудование может легко храниться в рабочем кабинете, причем занимаемая площадь не превышает 2,3 м². Мелкое оборудование (игла для пункции, шприцы, чашки Петри, пробирки для приготовления спермы, пробирка или контейнер для CIY со своим методом закрепления в неподвижном состоянии, при необходимости, пластмассовое зеркало, комплексы, пластиковые зажимы, стерильный мешок для прикрытия вагинального зонда) и культуральная среда для промывки фолликулы, для промывки спермы, для созревания и оплодотворения ооцитов, причем все эти инструменты стерилизованы гамма-излучением и упакованы каждый в целлофановые мешки, являются оборудованием одноразового пользования. Выбор оборудования этого типа требует большого внимания и опыта для того, чтобы избежать токсичности и располагать оборудованием, наиболее приемлемым для процедуры этого типа.

К мелкому оборудованию, приведенному выше, можно было бы добавить фильтровальную установку для приготовления спермы, которую разработал заявитель, и уже известное устройство для экспресс-определения содержания LH, а также ампулы с hCG, используемые для добавления фазы образования желтого тела. Как минимум, комплект оборудования включает прибор экспресс-определения содержания LH, иглу для пункции ооцита(ов), контейнер для созревания ооцитов по технологии CIY и контейнер для оплодотворения тех же ооцитов, или, по необходимости, контейнер для созревания и оплодотворения ооцитов. По технологии, описанной в заявке на международный патент WO 88/08280, поданной 02 мая 1988 года, контейнер может, по крайней мере, частично поддаваться биологическому разрушению, содержание этой заявки включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

Комплект оборудования даст значительную экономию времени и энергии для практикующего врача, выполняющего процедуру этого типа, он станет гарантией наилучших условий выполнения процедуры.

Стоимость этой процедуры значительно сокращена, таким образом, делая оплодотворение ин витро доступным для бесплодных пар. Соединение естественного цикла и CIY гораздо более физиологично и не ставит те же этические проблемы, что классическая методика. Перечисленные преимущества вместе с результатами, безусловно предварительными, но очень удовлетворительными, позволяют выбрать эту методику лечения бесплодия. Эта процедура не будет использоваться исключительно в качестве последнего средства для лечения бесплодной пары, а в качестве первого исследования с целью точно оценить способность гамет к оплодотворению. Это позволяет избежать длительного и дорогостоящего исследования всех пар на бесплодие. Эти исследования будут тогда проводиться только для пар, у которых выявлено отсутствие слияния гамет в ходе процедуры, позволив, таким образом, потратить больше средства для решения реальных проблем стерильности.

Этот естественный цикл может сочетаться с методикой оплодотворения на пластинке, которую мы уже разработали. Оплодотворение ин витро с использованием пластинки, подвергающейся биологическому разрушению, крайне упростится. Тогда для процедуры не будет требоваться перенос эмбриона и целью технического вмешательства человека будет исключительно подготовка с помощью двух гамет (ооцит и сперматозоид) в оплодотворении, реально осуществляемом ин витро.

Единственным недостатком этой процедуры может быть отсутствие долгосрочного (более 24 часов) программирования пункции ооцита. Для этого был разработан новый протокол с использованием прогестерона. Прогестерон, по всей видимости, оказывает взаимообратное действие на LH, у некоторых он провоцирует появление пика LH, у других он его задерживает.

Фактически, было отмечено, что действие прогестерона на пик LH зависит от используемой дозы и от момента его введения. Опыт только на добровольном пациенте введения прогестерона в периовуляционный период в дозе 50 мг вагинальным путем каждые 12 часов позволил подтвердить полное исчезновение пика LH в течение 48 часов. Введение прогестерсна было осуществлено тогда, когда содержание эстрадиола достигло 150 пг/мл, т.е. несколько часов спустя появления пика LH. Считали, что ингибирование контролируется гипофизом. Однако неожиданным результатом стало прогрессирующее понижение содержания эстрадиола. Это понижение указывает, что при этой дозе прогестерон действует не только как ингибитор LH, но также как ингибитор FSH. Добавление натурального FSH, 2-6 ампул через 1-2 часа после введения прогестерона и в том же ритме каждые +12 часов, оказалось бы необходимым для поддержания возрастания содержания эстрадиола, повышения зрелости ооцита и во избежание преждевременной инволюции клеток гранулозы, что стало бы пагубным для качества ооцита. Введение FSH могло бы также найти применение в спонтанном цикле без подавления LH прогестероном для улучшения зрелости ооцита в случае слишком раннего в организационных целях программирования пункции. Таким образом, 2-6 ампул FSH (160- 450 U 1) могут вводиться тогда, когда наблюдается первое удвоение базового содержания LH и при получении результатов анализа крови, причем пункции ооцита проводится через 34-36 часов после пробы крови. Этот протокол был бы интересен для пациенток моложе 40 лет при стагнации LH. Патентная формула изменена в соответствии со ст.19.

Условные обозначения HMG - гормон, стимулирующий обмен веществ гамет, hСG - гормон хронического гонадотропина, FSH - фолликулостимулирующий гормон, ФСГ, LH - лютеинизирущий гормон, ЛГ.

Формула изобретения

1. Способ оплодотворения ин витро, предназначенный для применения в амбулаторных условиях, при котором после пункции ооцитов вводят один или несколько ооцитов в контейнер, содержащий культуральную среду, без наличия воздуха или CO₂, предназначенную для оплодотворения и культивирования ооцита(ов), а также сперматозоидов, и вводят закрытый контейнер в вагинальную полость или в матку для обеспечения оплодотворения ооцита(ов) и культивирования эмбриона(ов), отличающийся тем, что процесс осуществляют без стимуляции цикла и введения хорионического гонадотропина перед пункцией ооцитов и контроле содержания в крови эстрадиола (Е2) и LH, а программирование пункции ооцитов основывают на значениях Е2 после первого удвоения значения LH.

2. Способ оплодотворения по п.1, отличающийся тем, что определение содержания Е2 и LH в крови осуществляют 2 раза в день, один раз от 8 до 10 ч и один раз от 15 до 17 ч.

3. Способ оплодотворения по п.2, отличающийся тем, что при снижении Е2 на 30% или стабильности (т.е. 10% от предыдущего значения) по отношению к значению при первом удвоении LH пункцию программируют через 34 - 36 ч после первого удвоения значения LH.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при повышении Е2 более чем на 20% по сравнению со значением при первом удвоении значения LH пункцию осуществляют через 30 - 34 ч после повышения Е2 более чем на 20%.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что пункцию ооцита программируют сразу же после выявления стабильности при трех определениях содержания Е2 (т.е. 10% от предыдущего значения) после первого удвоения значения LH.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что созревание ооцита осуществляется после его отбора.

7. Способ оплодотворения по пп.1 - 6, отличающийся тем, что введение hCG осуществляют после пункции ооцита.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что ооцит, введенный в контейнер без воздуха или CO₂, выдерживают при 37^oС в течение времени от 2 до 6 ч.

9. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что осуществляют пункцию и оплодотворения ооцита.

10. Способ по одному из пп.1 - 9, отличающийся тем, что перед введением контейнера в матку его выдерживают при 37^oС приблизительно в течение 2 - 6 ч.

11. Комплект оборудования для реализации способа по пп.1 - 10, отличающийся тем, что он включает прибор экспресс-определения содержания LH, иглу для пункции ооцита, фильтрующую установку для приготовления спермы, контейнер для оплодотворения и/или созревания ооцита(ов) и культивирования эмбриона(ов) со своими средствами удержания и культуральные среды для промывки фолликулы, промывки спермы и созревания и оплодотворения ооцита.

12. Комплект оборудования по п.11, отличающийся тем, что контейнер(ы), по меньшей мере, частично подвергаются биологическому разрушению.

13. Комплект оборудования по п.11 или 12, отличающийся тем, что он включает зеркало одноразового пользования.

14. Комплект оборудования по пп.1 - 13, отличающийся тем, что включает катетер для переноса эмбриона(ов).

15. Комплект оборудования по пп.11 - 14, отличающийся тем, что включает шприц для введения hCG, шприцы для пункции ооцита, шприцы для промывки фолликулы.

16. Комплект оборудования по пп.11 - 15, отличающийся тем, что включает чашки Петри, компрессы и пластиковый мешок для прикрытия зонда.

17. Комплект оборудования по пп.11 - 16, отличающийся тем, что все элементы комплекта оборудования стерилизованы, герметично упакованы и предназначены для одноразового пользования.