2152800 - Способ культивирования и модификации гетерогенных клеток млекопитающих

Способ культивирования и модификации гетерогенных клеток млекопитающих

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и иммуноонкологии, и касается проблемы вакцинации против опухолевых клеток и вакцинотерапии онкологических заболеваний. Сущность изобретения: в полиакриламидный гель (находящийся in vivo) вводят гетерогенные клетки млекопитающих, в том числе и опухолевые, что приводит к возможности длительного культивирования клеток в организме млекопитающих. Изобретение приводит к модификации гетерогенных клеток, заключающейся в снижении их пролиферативной активности и иммунизирующем эффекте на организм млекопитающего. 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 ил.

Известно, что проблема трансплантации органов, тканей, клеточных культур млекопитающих сопряжена с трудностями связанными с "приживляемостью" чужеродных тканево-клеточных агентов в организме реципиента. Существующие способы пересадки алло-, гетеро-, ксенотрансплантантов требуют или мощной иммуносупресивной терапии реципиента или оригинальных методик. К последним относятся способы трансплантации клеток различных органов плодов человека и животных, т.е. используется эффект несложившейся видовой специфичности. Таким образом проводят трансплантацию культур островковых клеток поджелудочной железы 24-26 недельных плодов человека в паренхиму печени или в воротную вену в эксперименте крысам.

Местом введения клеток может служить пульпа селезенки или мышцы передней брюшной стенки. Известны случаи лечения аналогичным методом людей, страдающих сахарным диабетом. (Скалецкий Н.М. "Влияние культивирования островковых клеток поджелудочной железы на их выживание в организме ксеногеного реципиента": Всесоюзная конференция по трансплантации органов 1995 г., стр. 219-220).

Представляет интерес пересадка клеток Лейдига в тестикулярную ткань мужским особям для лечения бесплодия, так как реакция отторжения не наступает из-за наличия гематотестикулярного барьера. (Зыбин Д.В. "Способ лечения больных с нарушением мужской половой сферы методом трансплантации". Патент РФ N 2026643 от 20.01.95).

В результате обоих описанных способов были получены хорошие результаты по сохранению жизнеспособности и активности трасплантируемых клеток. Но в первом случае определенным недостатком способа можно считать использование только эмбриональных клеток, а во втором - клеточной терапии подвергаются только мужские особи.

Известен способ вакцинации и вакцинотерапии опухолей с помощью живых клеток. Применяемые клетки являются гибридомами или трансфецированными клетками, аллогенными или аутогенными. Недостатками являются кратковременное существование клеток в организме и соответственно низкий иммунизирующий эффект. (В.Е. Souberbielle, M.Westby, S.Ganz, J.Kayaga. Comparison of four strategies for tumor vaccination in the B-16 FIO melanoma model. Gene therapy 1998, 1447-1454).

Наиболее близкими предложенному способу являются следующие способы.

Трансплантация ОКПЖ (островковых клеток поджелудочной железы) с использованием микрокапсуляции. Способ состоит в введении ОКПЖ (алло- или ксеногенных), инкапсулированных в сферы альгинатного геля. Сферы имплантируют интраперетониально. Имплантация сфер полностью заменяет терапию инсулином на 175 дней, но при этом одновременно применяется иммуносупрессивная терапия. Крысам с индуцированным диабетом вводят бычью ОКПЖ без иммуносупрессии. Нормогликемия поддерживается от нескольких недель до месяца.

Недостатком способа является необходимость применения иммуносупрессивной терапии, кроме того, определенные трудности представляет приготовление капсул in vitro. (Lanza R. P., Ecker D.M., Marsh J.P. Transplantation of islets using microencapsulation: studies in diabetic rodents and dogs. J. Mol.Med. 1999 Jan. 77(1): 206-10).

Известен способ вакцинации и вакцинотерапии опухолей с помощью живых клеток. Применяемые клетки являются гибридомами или трансфецированными клетками, аллогенными или аутогенными. Недостатками являются кратковременное существование клеток в организме и соответственно низкий иммунизирующий эффект. (В. Е. Souberbielle, M.Westby, S.Ganz, J.Kayaga. Comparison of four strategies for tumor vaccination in the B-16 FIO melanoma model. Gene therapy 1998, 1447-1454).

Наиболее близкими предложенному способу являются следующие способы.

Трансплантация ОКПЖ (островковых клеток поджелудочной железы) с использованием микрокапсуляции.

Способ состоит в введении ОКПЖ (алло- или ксеногенных), инкапсулированных в сферы альгинатного геля. Сферы имплантируют интраперетониально. Имплантация сфер полностью заменяет терапию инсулином на 175 дней, но при этом одновременно применяется иммуносупрессивная терапия. Крысам с индуцированным диабетом вводят бычьи ОКПЖ без иммуносупрессии. Нормогликемия поддерживается от нескольких недель до месяца.

Известен способ вакцинации и вакцинотерапии опухолей с помощью живых клеток. Методика состоит в получении гибридом опухолевых клеток и аллогенных дендритных клеток (или макрофагов). Полученные гибридомы используют как вакцинные препараты.

Недостатком является невысокий иммунизирующий эффект, обусловленный кратковременным существованием введенных клеток в организм реципиента. (Gajewski T.F., Fallarino F. Rational development of tumor antigen-specific immunization in melanoma. Theraputic Immunology, 1997,2,211-225).

Сущностью предложенного способа является обеспечение возможности длительного существования гетерогенных клеток в организме реципиента, что достигают путем предварительного введения млекопитающим полиакриламидного геля, с последующей инъекцией в образовавшуюся капсулу гетерогенных клеток млекопитающих. В качестве гетерогенных клеток используют опухолевые клетки и клетки Лейдига.

В общем виде способ осуществляют следующим образом.

Формируют соединительно-тканную капсулу путем подкожного введения полиакриламидного геля (ПААГ) объемом 1,0 мл крысам линии Wister и объемом 0,5 мл мышам линий C57BLACK и BALB/C.

В эксперименте участвуют разнополые особи. В гелевую капсулу вводят клетки Лейдига половозрелых поросят, крыс и зеленых мартышек или опухолевые клетки. Контролем служат животные, которым вводят клетки под кожу.

Суспензию жизнеспособных клеток Лейдинга тестикул половозрелых поросят, крыс и зеленых мартышек готовят, используя растворы, содержащие питательный субстрат для клеток, в частности составами стандартных сред Игла, среды 199, раствором Хэнкса и т.п.

Следующие примеры иллюстрируют осуществление изобретения.

Пример 1. Культуру клеток Лейдига новорожденных поросят в объеме 0,5 мл с концентрацией клеток 5 млн в 1 мл вводят в образованную полиакриламидным гелем капсулу самкам крыс Wister.

Контрольной группе животных той же линии, пола и антропологических данных вводят культуру клеток -Лейдига новорожденных поросят подкожно. Перед введением клеточной культуры измеряют содержание тестостерона в сыворотке крови животных. Последующие измерения тестостерона в сыворотке крови проводят с различными интервалами в течение 7 месяцев одновременно у экспериментальных и контрольных животных.

Количество животных в опыте и контроле по 2 особи.

Пример 2. Культуру клеток Лейдига половозрелых зеленых мартышек в объеме 0,5 мл с концентрацией клеток 5 мл в 1 мл вводят в образованную полиакриламидным гелем капсулу самкам крыс линии Wister.

Контрольной группе животных той же линии, пола и антропологических данных вводят культуру клеток Лейдига половозрелых зеленых мартышек подкожно. Перед введением клеточной культуры измеряют содержание тестостерона в сыворотке крови животных. Последующие измерения тестостерона в сыворотке крови проводят с различными интервалами в течение 7 месяцев, одновременно у экспериментальных и контрольных животных. Количество животных в опыте и контроле по 2 особи.

После 7 месяцев наблюдения животных забивают и проводят гистологическое исследование, которое показывает наличие большого количества жизнеспособных клеток Лейдига, что позволяет сделать вывод о возможности жизнедеятельности ксено- и гетерогенных клеток в организме реципиента с использованием геля.

Пример 3. Опытной партии мышей линии BALB/C (в количестве 6 особей), подкожно вводят ПААГ в объеме 0,5 мл. В гель вводят клетки опухоли меланомы мыши В-16 в объеме 1 мл с концентрацией клеток 1 млн.

Контрольной группе мышам линии BALB/C (в количестве 6 особей) подкожно вводят клетки меланомы мыши В-16 в объеме 1 мл. с концентрацией клеток 1 млн.

Известно что, у мышей линии BALB/C меланомы мышей В-16 не дают роста. В контрольной группе животных рост опухоли не обнаружен у всех 6 особей. В опытной группе животных, путем пальпаторного исследования, отмечен рост опухоли в ПААГ у всех 6 особей. На 60 день опытных животных с мышиной меланомой В-16 в геле забивают. Гель с опухолевыми клетками извлекают в асептических условиях и переводят в монослойную культуру на питательной среде РПМИ-1640 с 10% фитальной сывороткой. Фрагменты капсулы с опухолевыми клетками фиксируют в нейтральном растворе формалина и проводят гистологическое исследование, которое позволяет судить о более высокой дифференциации меланомных клеток и потере ими пролиферативной активности (табл.1 [1-2]).

Пример 4. Культуру клеток, полученную по примеру 1, в количестве 1 мл с концентрацией клеток 1 млн. вводят мышам линии С57 BLACK подкожно (количество особей 6).

Известно, что опухоль меланомы мышей В-16 у линии мышей С57 BLACK дает рост опухоли в 100% случаев, гибель животных наступает на 20-25 день в 100% случаев.

Контрольной группе мышей C57BLACK вводят культуру клеток меланомы мыши В-16 в количестве 1 мл с концентрацией клеток 1 млн.

У опытных мышей появление признаков роста опухоли отмечают через 30-33 дня, в контроле через 5-8 дней. Срок жизни опытных мышей составляет 60-65 дней, контрольных - 20-23 дня (табл. 2).

Пример 5. Мышам линии C57black (в количестве 6 особей) вводят ПААГ в объеме 0,5 мл подкожно. В гель вводят культуру клеток меланомы человека SKMEL28 в объеме 1 мл с концентрацией клеток 1 млн.

Контрольной группе мышей, той же линии, (в количестве 6 особей) вводят подкожно культуру клеток меланомы человека SKMEL28 в объеме 1 мл с концентрацией клеток 1 млн.

Известно что, культура клеток меланомы человека не дает роста у мышей в 100% случаев. В опытной группе животных в геле определяется пальпированием рост опухоли на 15-20 день после инъекции. У контрольных животных рост опухоли не отмечен (таблица 1 [3-4]).

Пример 6. Группе опытных животных (количество особей 6), описанных в примере 3, вводят культуру клеток меланомы мыши В-16 подкожно в объеме 1 мл с концентрацией клеток 1 млн. Контрольной группе мышей линии C57BLACK (количество особей 6) вводят подкожно культуру клеток меланомы мыши В-16 в объеме 1 мл с концентрацией клеток 1 млн.

У контрольных животных на 7-15 день развиваются подкожные меланомы в диаметре приблизительно 3-5 см. В это же время у опытных мышей признаков опухоли не обнаружено (табл.3).

Вывод: таким образом, полученные результаты позволяют предложить способ культивирования гетерогенных клеток в ПААГ in vivo, в результате чего снижается пролиферативная активность опухолевых клеток и культивируемые клетки оказывают на организм иммунизирующее действие, что может быть использовано для вакцинации и вакцинотерапии.

Формула изобретения

1. Способ культивирования и модификации гетерогенных клеток млекопитающих с последующим использованием их для получения вакцинных препаратов, отличающийся тем, что культивирование гетерогенных клеток осуществляют длительное время в живом организме путем предварительного введения млекопитающему полиакриламидного геля с последующей инъекцией в него гетерогенных клеток млекопитающих.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гетерогенных клеток используют опухолевые клетки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве гетерогенных клеток используют клетки Лейдига.

4. Способ по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что модификация клеток заключается в снижении их пролиферативной активности и иммунизирующем действии на организм.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

Способ культивирования и модификации гетерогенных клеток млекопитающих

Патент 2152800