Композит гексапептида со стабилизированной дисульфидной связью с веществом металлом, фармацевтические композиции на его основе, способы их получения и применения для лечения заболеваний на основе регуляции метаболизма, пролиферации, дифференцировки и механизмов апоптоза в нормальных и патологически измененных тканях

Композит гексапептида со стабилизированной дисульфидной связью с веществом металлом, фармацевтические композиции на его основе, способы их получения и применения для лечения заболеваний на основе регуляции метаболизма, пролиферации, дифференцировки и механизмов апоптоза в нормальных и патологически измененных тканях

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, а именно к способам получения лекарственных средств на основе активных метаболитов пептидной природы, которые могут быть использованы в клинической практике. Композит включает соединение на основе окисленного глутатиона и вещества-металла в соотношении 3000:1 и 1:1, в котором вещество-металл включает металл, выбираемый из группы, состоящей из платины и палладия, при этом соединение на основе окисленного глутатиона может быть дериватом или солью, выбираемой из группы, состоящей из солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов и солей переходных металлов. Технический результат: расширение спектра средств для стимуляции, а также усиления и пролонгирования способности стимулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов и для лечения лиц, страдающих заболеваниями, в основе которых лежат нарушения регуляции, метаболизма, пролиферации, дифференцировки и механизмов апоптоза клеток. 5 с. и 74 з.п. ф-лы, 22 ил., 42 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, а именно к способам получения лекарственных средств, на основе активных метаболитов пептидной природы, которые могут быть использованы в клинической практике для профилактики и лечения различных патологических синдромов и заболеваний посредством дифференцированного воздействия на процессы метаболизма, пролиферации, дифференцировки и апоптоза нормальных и трансформированных клеток.

Современная фармакоиндустрия, постоянно интенсифицирующая внедрение в практическую медицину противоинфекционной и противоопухолевой химиотерапии, способствует масштабированию двух медико-биологических проблем: формированию резистентности (привыкания и падения фармакологической эффективности) к лекарственным препаратам, в том числе вследствие активации системы MDR-генов; и формированию резорбтивных нежелательных эффектов, проявляющихся в первую очередь повреждением системы иммунокомпетентных клеток и гемопоэза: кардио-, гепато-, нефро- и нейротоксичностью. Основная причина этих негативных явлений - широчайшее применение синтезируемых химиотерапевтических средств, средств, продуцируемых одноклеточными организмами весьма эффективных по своим физико-химическим механизмам, но чужеродных для человеческого организма по своей природе.

В этой связи теоретическая и практическая медицина все настойчивее обращает свой взор в сторону естественных ключевых метаболитов, представляющих собой внутриклеточные биохимические факторы, как правило, пептидной природы, предназначенные для запуска цепных реакций обмена веществ в клетках, наработки и модификации ряда биологически активных соединений, и регуляции физиологически важных и физиологически адекватных процессов.

Метаболиты, к которым обращаются достаточно активно, являются, в частности, серосодержащие пептиды и их производные, в первую очередь - это группа тиолов. В этой группе известен трипептид восстановленного глутатиона - глутамил-цистеинил-глицин; далее - GSH), биологические эффекты которого исследуются широчайшим образом.

Известен димер трипептида глутатиона - глутатион окисленный (бис-(-L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин - далее GSSG), в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками.

Установлены [1] уникальные свойства окисленного глутатиона (GSSG) стимулировать/модулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических (в том числе колониестимулирующих, то есть ростовых) факторов. При этом стабилизация указанными в [1] фармацевтическими решениями времени пребывания в биологических средах экзогенно введенного GSSG в окисленной форме усиливало эти эффекты. Известны процессы, развивающиеся в клетках (тканях и, следовательно, в органах) после взаимодействия с цитокинами, которые обусловлены универсальным влиянием цитокинов на основные сигнал-передающие системы и через них на геном клеток, что определяет регулирующие эффекты цитокинов на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз.

В международной заявке WO 97/21444- [2] представлена группа лекарственных средств, содержащих в качестве действующего вещества производные окисленного глутатиона (GSSG) в виде его солей; или использование композитных препаратов, включая комбинации GSSG с веществами, пролонгирующими или усиливающими действие GSSG или его солей; или производных в качестве новых композиций, то есть формул новых соединений, когда последние получают посредством создания ковалентной связи между GSSG и вторым веществом. При этом впервые было показано, что технические решения, которые в той или иной степени стабилизируют молекулу GSSG в дисульфидной форме, значительно эффективнее и целенаправленнее индуцируют продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов в нормальных, но в большей степени и целесообразнее в патологических условиях. Более того, лекарственные формы производных GSSG, характеризующиеся большей степенью стабильности молекулы GSSG в дисульфидной форме, обладали новой фармакокинетикой в биологических средах и проявляли способность индуцировать продукцию более широкой палитры цитокинов и гемопоэтических факторов, что определяло наличие в большей степени модулирующих, а не только стимулирующих эффектов; воспроизведения эффектов некоторых цитокинов, например IL-2.

Известны способы получения димера трипептида глутатиона, то есть окисленного глутатиона - GSSG из его предшественника, восстановленного глутатиона (GSH).

В настоящее время существуют три основных метода окисления восстановленной формы глутатиона. Во-первых, известно, что реакция окисления достаточно лабильных меркапто-SH-групп цистеина в молекуле глутатиона [3] окисляется уже такими мягкими окислителями как кислород воздуха [4, 5]. Однако скорость реакции в данном случае низкая и для количественного выхода требуется очень продолжительное время (многие сутки). Катализ ионами тяжелых металлов, и особенно токсичной меди создает существенные трудности для получения чистого фармацевтического препарата.

Вторым методом является использование более мощных окислителей, например, таких как перекись водорода, йод, ферроцианид калия и др. [6, 7]. Реакции в этих случаях проходят значительно быстрее (от десятков минут до нескольких часов), однако их общим существенным недостатком является трудно контролируемые реакционные условия, что приводит к значительному загрязнению целевого вещества продуктами окисления, то есть производными соответствующих кислот. Это вызывает необходимость подключения дополнительных, иногда достаточно трудоемких средств очистки, что резко удорожает процесс.

К третьей группе методов следует отнести использование в качестве окислителей газообразных веществ (окислов азота), сульфоксидов и других соединений, среди которых можно найти достаточно редкие и абсолютно неприемлемые для масштабирования [8, 9].

Наиболее близким способом по технической сущности к способу получения окисленного глутатиона как композита со стабилизированной дисульфидной связью является способ получения окисленного глутатиона из восстановленного с использованием перекиси водорода как окислителя [6]. Процесс проводится в водном растворе pH около 8,0-8,5 с использованием эквивалента перекиси водорода, при комнатной температуре. Время прохождения реакции около 1 ч, выход целевого продукта - 90%. Основными примесями (до 10%) являются продукты окисления, очистка от которых возможна только при использовании дорогостоящего метода препаративной ВЭЖХ, и поэтому может резко увеличить себестоимость препарата.

Заявляемым изобретением решается задача создания и получения нового фармацевтически приемлемого соединения с заданными свойствами на основе GSSG, т. е. структурного аналога окисленного глутатиона, а именно гексапептида со стабилизированной дисульфидной связью.

В заявляемом изобретении используется следующая, принятая в этой области терминология.

"Композит" обозначает смесь различных химических веществ. "Смесь" может быть физической смесью или химической смесью, то есть в ней может присутствовать химическое взаимодействие, включающее химическую связь или электростатическое взаимодействие. В одном из воплощений изобретения смесь может быть приготовлена посредством растворения и/или суспендирования различных химических веществ в растворе и высаживания либо отфильтровывания полученного сухого вещества. В другом воплощении идеи изобретения смесь может быть гомогенным раствором, включающим различные химические вещества.

"Соединением на основе окисленного глутатиона" называется любое соединение, обладающее базовой структурой димера трипептида глутатиона, в котором димер включает группу или соль, или производное глутаминовой кислоты, связанное с цистеиновой группой, или солью, или производным, связанным с группой или солью, или производным глицина, и каждая единица соответственно связана друг с другом посредством атомов серы цистеина, формирующими связь сера-сера (дисульфидная связь). "Производное" может быть получено при реакции, по крайней мере, одной реактивной группы соединения на основе окисленного глутатиона или предшественника с другим химическим веществом. Примером соединения на основе окисленного глутатиона является сам GSSGPt, т.е. гексапептид со стабилизированной дисульфидной связью.

Понятие "фармацевтически приемлемая соль" подразумевает производное композита в виде соли, приемлемой для введения в организм, не оказывающей нежелательные, вредные эффекты на организм и включающей, например, катионы натрия, лития, цинка или ванадия, или соответственно - натриевая, литиевая, цинковая или ванадиевая соль.

Понятие "фармацевтически приемлемая композиция" (дериват) подразумевает композит или его производное как фармацевтически приемлемое вещество и может включать, коме того, группу активных метаболитов или другие химические соединения. Например, композиция или производное может включать и быть ковалентно связанным с фенилаланином или цистеамином.

Понятие "метаболизм" подразумевает совокупность всех биохимических реакций, происходящих в живом организме, отвечающих за сохранение жизнеспособности данного организма [12].

Понятие "пролиферация" подразумевает воспроизводство или умножение сходных форм (клеток) за счет составляющих (клеточных) элементов [13, 14].

Понятие "дифференцировка" подразумевает приобретение или обладание признаками, отличающими от оригинала, с переходом клетки от выполнения сравнительно примитивных функций к более сложным, специализированным функциям с появлением или усилением морфологической и/или функциональной гетерогенности, присущих данному типу клеток, посредством экспрессии тканеспецифических генов [15, 16, 17, 18].

Понятие "апоптоз" подразумевает морфологически распознаваемую форму генетически программированной, физиологической клеточной смерти, инициируемой внеклеточными либо внутриклеточными сигналами [19, 20, 21].

Понятие "цитокины" подразумевает белковой природы регуляторные вещества, продуцируемые различными видами клеток, играющие ключевую роль в развитии иммунного ответа, гематопоэзе и патогенезе различных заболеваний, осуществляющие свой эффект посредством активации генов, участвующие в регуляции всех звеньев иммунной системы [19, 22].

Понятие "лекарственное средство", используемое в данной заявке, подразумевает использование любой лекарственной формы, содержащей композит настоящего изобретения, например GSSGPt или производные, которые обладают терапевтическим эффектом при лечении онкологических, инфекционных, гематологических, иммунологических, нейродистрофических и других заболеваний.

Под "онкологическими и инфекционными заболеваниями", "депрессией кроветворения и иммунитета различного происхождения" и "другими заболеваниями" понимаются любые указанные заболевания или состояния, вызванные или сопровождающиеся угнетением красного или белого ростка кроветворения либо депрессией количественных или функциональных показателей системы иммунитета, а также любые другие заболевания или патологические состояния, при которых стимуляция/модуляция эндогенной продукции вышеупомянутых цитокинов и гемопоэтических факторов, и/или индукция механизмов апоптоза была бы целесообразна по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

В настоящем изобретении раскрывается ряд соединений на основе окисленного глутатиона, имеющих стабилизированную дисульфидную связь, и, в частности, композит, включающий соединение на основе окисленного глутатиона и вещества-металла, в соотношении от 3000: 1 до 1:1, в котором вещество-металл включает металл, выбираемый из группы, состоящей из платины и палладия, при этом соединение на основе окисленного глутатиона химически взаимодействует с веществом-металлом. В одном из воплощений изобретения вещество-металл включает металл, выбираемый из группы, состоящей из платины и палладия. Группа данных металлов, выбранных в связи с тем, что платина и палладий обладают каталитическими свойствами в отношении влияния на окислительные реакции. Предпочтительно, чтобы металлом была платина, так как она при меньших концентрациях является эффективным катализатором. В идеальном варианте вещество-металл в комбинации с соединением на основе окисленного глутатиона представляет собой вещество, растворимое в биологических средах. Незначительные части вещества-металла могут быть нерастворимы, пока эта нерастворимая часть не оказывает какие-либо токсические или опасные эффекты на биологические системы. Вещество-платина выбирается из группы, включающей соль платины, координационное соединение платины и органометаллическое соединение платины. Предпочтительно, чтобы вещество-платина было координационным соединением платины, таким, как цис-платин (cis-Pt(NH₃)₂Cl₂ или хлорид платины (хлористая соль платины)).

В предпочтительном воплощении изобретение представляет собой новое соединение на основе окисленного глутатиона и cis-диаминодихлорплатины. В описании используется удобное краткое обозначение: например, композит, включающий сам GSSG и цис-платин, будет обозначаться как GSSGPt. Производные будут обозначаться с помощью добавленных химических групп, например бис-[гистидил]-GSSGPt.

В настоящем изобретении также приводится способ получения окисленного глутатиона как композита со стабилизированной дисульфидной связью общей формулы: бис-( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин динатриевая соль с веществом- платиной, таким как cis-диаминодихлорплатина, в предпочтительном мольном соотношении 3000:1, наиболее предпочтительно в мольном соотношении 1000:1.

Согласно изобретению, композит характеризуется стабилизированной дисульфидной связью при введении его в биологические среды, а следовательно, большей продолжительностью времени полужизни препарата в биологических средах именно в форме глутатион дисульфида.

Общая методика получения композита в настоящем изобретении заключается в использовании восстановленного глутатиона в реакции окисления с добавлением окислителя перекиси водорода в комбинации с веществом-платиной, в частности с cis-диаминодихлорплатиной в качестве катализатора. Это позволяет использовать меньшее количество перекиси водорода (например, 0,9 эквивалента), благодаря этому исключить образование продуктов переокисления и приводит к очень высокому выходу GSSG (более 98% по данным ВЭЖХ). Таким образом, полученный продукт является очень чистым и не требует дополнительной очистки.

Следует отметить, что простое смешение готового окисленного глутатиона, полученного любым из изложенных выше способов, с комплексным соединением платины в указанной пропорции дает значительно меньший технологический и экономический эффект. В этом случае требуются дополнительные затраты на приобретение готового окисленного препарата (стоимость которого в 2-3 раза превышает стоимость восстановленной формы глутатиона), или самостоятельное проведение синтеза окисленной формы, выделение средств на дорогостоящую очистку полученного препарата, то есть получение композита в две стадии.

В изобретении заявляется метод стабилизации дисульфидной связи соединения на основе окисленного глутатиона. Метод включает взаимодействие соединения на основе окисленного глутатиона с веществом-металлом. Вещество-металл включает металл, выбираемый из группы, состоящей из платины и палладия. "Стабилизация дисульфидной связи" относится к процессу сохранения связи между двумя атомами серы и предотвращения быстрого превращения соединения на основе окисленного глутатиона (GSSG) в восстановленную форму (GSH). Или же стабилизация дисульфидной связи может приводить к увеличению времени существования соединения на основе окисленного глутатиона. При сохранении соединения на основе глутатиона в окисленной форме в течение более длительного времени это соединение может быть фармацевтически эффективным в течение соответственно более длительного времени в биологических средах.

Одно из воплощений изобретения - "взаимодействие соединения на основе окисленного глутатиона с веществом-металлом" - включает наличие соединения на основе глутатиона и реакцию этого соединения с окислителем и веществом-металлом. Термин "соединение на основе глутатиона" относится к любому соединению, обладающему структурой, включающей глутаминовую кислоту/соль/производное, связанное с цистеином/солью/производным, связанным с глицином/солью/производным. Примеры соединения на основе глутатиона включают сам глутатион или любое производное, где производное может быть получено посредством реакции реактивной группы с другим химическим веществом. Полученный продукт будет структурным аналогом окисленного глутатиона, т.е. гексапептидом со стабилизированной дисульфидной связью. Таким образом, в этом воплощении соединение на основе глутатиона находится в восстановленной форме, такой, как GSH, и реакция с окислителем включает окисление соединения на основе глутатиона для получения связи "сера-сера". Окислителем может быть любое вещество, которое может разрывать S-H связь соединения на основе глутатиона, получая атом водорода и соединение, имеющее радикал на основе серы, который в конечном итоге может реагировать с другим радикалом на основе серы, приводя к образованию связи "сера-сера". В технике хорошо известны различные окислители, которые могут разрывать S-H связь. В предпочтительном воплощении окислитель выбирается из группы, состоящей из кислорода и перекиси водорода.

В этом методе реакция соединения на основе глутатиона с окислителем и веществом-платиной включает реакцию окисления. Относительные количества реагентов - предпочтительно 1 эквивалент соединения на основе глутатиона с менее чем 1 эквивалентом окислителя, такого, как перекись водорода, и более предпочтительно с 0,9 эквивалента перекиси водорода. В другом воплощении идеи изобретения реакция окисления включает реакцию между 1 эквивалентом соединения на основе глутатиона с от 0,0003 эквивалента до 1 эквивалента вещества-платины, предпочтительно от 0,001 эквивалента до 1 эквивалента, более предпочтительно от 0,001 эквивалента до 0,1 эквивалента, и даже более предпочтительно от 0,001 эквивалента до 0,01 эквивалента, в присутствии менее чем 1 эквивалента окислителя. В другом воплощении 1 эквивалент соединения на основе глутатиона вступает в реакцию с 1 эквивалентом вещества-платины в присутствии менее чем 1 эквивалента окислителя.

В одном из воплощений изобретения метод включает окисление соединения на основе глутатиона посредством 0,9 эквивалента перекиси водорода и 0,001 эквивалента цис-платина. Одним из преимуществ данного метода является увеличение скорости окисления соединения на основе глутатиона. Другим преимуществом этого метода является то, что увеличивается выход получаемого композита более чем до 98% и этот увеличенный выход сопровождается возросшей чистотой. Очисткой этого метода является то, что увеличивается выход получаемого композита более чем до 98% и этот увеличенный выход сопровождается возросшей чистотой. Очистка этого композита существенно упрощается до такой степени, при которой может быть использована жидкостная хроматография, позволяющая получить чистоту выше 99%, что соответствует фармацевтическим стандартам. Методы в предыдущей технике позволяли достигнуть чистоты 75-93% окисленного глутатиона в зависимости от метода.

В предпочтительном воплощении композит синтезируется в одну стадию посредством окисления восстановленного глутатиона в присутствии cis-диаминодихлорплатины, которая может функционировать в качестве катализатора реакции окисления. Условия реакции могут точно регулироваться с помощью менее чем 1 эквивалента перекиси водорода. Впоследствии может быть уменьшено образование продуктов переокисления, что приводит к практически количественному выходу продукта. Таким образом, этот одноэтапный синтез композита обеспечивает существенное технологическое упрощение и производство композита GSSGPt со стабилизированной дисульфидной связью.

Сущность данного способа заключается в использовании водного раствора исходного восстановленного глутатиона в виде мононатриевой соли, к которому при комнатной температуре при перемешивании добавляется 0,9 эквивалента перекиси водорода и 0,001 эквивалента одного из нижеперечисленных комплексных водорастворимых соединений платины или палладия состава: a) Pt[(NH₃)₂]Cl₂cis-диаминодихлорплатина (II), б) K₂[PtCl₄] potassium tetrachloroplatinate (II), в) K₂[PdCl₄] potassium tetrachloropalladate (II), выступающими в роли катализатора реакции окисления.

Реакция окисления протекает около 1,5-2 ч. Контроль за полнотой прохождения окисления осуществляется методом ВЭЖХ. Завершение процесса осуществляется лиофильной сушкой реакционного раствора. В результате получают целевой продукт - композит, состоящий из окисленной формы глутатиона и cis-диаминодихлорплатины в мольном соотношении 1000:1, что подтверждается спектральным анализом на платину и натрий. Пептидная составляющая полученного композита по данным аминокислотного анализа, спектра ПМР, времени удерживания в ВЭЖХ соответствует гексапептиду - бис-( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицину, то есть окисленной форме глутатиона. Содержание посторонних примесей не превышает 2%, выход продукта в виде динатриевой соли 96-98% в расчете на сухой композит.

МЕТОДИКА СИНТЕЗА КОМПОЗИТА GSSG С КОМПЛЕКСНЫМ СОЕДИНЕНИЕМ ПЛАТИНЫ (II) ИЛИ ПАЛЛАДИЯ (II).

Восстановленный глутатион GSH 170 г (0,55 моль) суспендируют в 200 мл воды и прибавляют при перемешивании 139 мл (0,55 моль) 4N раствора NаOH и затем один из трех нижеперечисленных растворов: а) 170 мл 0,05% водного раствора cis-диаминодихлорплатины [Pt(NH₃)₂Cl₂] (0,28 мМоль); б) 235 мл 0,05% водного раствора тетрахлорплатината калия K₂[PtCl₄] (0,28 мМоль); в) 185 мл 0,05% водного раствора тетрахлорпалладата K₂[PtCl₄] (0,28 мМоль).

Полученный прозрачный слегка желтый раствор охлаждают при помощи льда до температуры 18-20^oC и добавляют 283 мл 3% раствора перекиси водорода (раствор H₂O₂) небольшими порциями в течение примерно 5 мин, с такой скоростью, чтобы температура реакционной смеси не превышала 22-25^oC (погруженный термометр).

Через 30 мин после прибавления всего количества раствора перекиси водорода (H₂O₂), внутрь реакционного раствора помещают электрод pH-метра и определяют pH раствора, а затем по каплям добавляют 4N раствор натра едкого до pH 5,6-5,8, при этом контролируют температуру, которая должна быть в пределах 22-25^oC. Далее охлаждение убирают и перемешивание продолжают уже при комнатной температуре в течение еще 30 мин.

Контроль полноты прохождения реакции окисления осуществляют методом ВЭЖХ. Жидкостной хроматограф для ВЭЖХ типа Beckman, Sol. Module 126, Det-168, снабженный колонкой Luna Phenomenex ODS 4,6х250 mm, или аналогичный, подготавливают к работе согласно инструкции по пользованию. Для приготовления мобильной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 20 см³ ацетонитрила (ТУ 6-09-14-2167-84), 1 см³ свежеперегнанной трифторуксусной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой. Перемешивают и дегазируют встряхиванием в вакууме.

Через 30 мин после прибавления всего количества раствора перекиси водорода осуществляют контроль за полнотой прохождения реакции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для этого из реакционной смеси при помощи микрошприца отбирают 10 мкл и растворяют их в 1 мл мобильной фазы (0,1% трифторуксусная кислота: ацетонитрил, 98:2). 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф Beckman 126 Solvent Module, Diod Array Detector Module 168, колонка Luna Phenomenex ODS 4,6х250 mm или аналогичный. Элюирование в изократическом режиме 30 мин в системе 0,1% трифторуксусная кислота: ацетонитрил, 98:2; скорость потока 1 мл/мин, детектирование при 220 нм, сканирование 190-600 нм.

Время удерживания в данных условиях для восстановленного глутатиона 5,0+0,5 мин, время удерживания окисленного глутатиона 11,00,5 мин.

Если по данным ВЭЖХ после стандартного интегрирования хроматограммы содержание окисленной формы глутатиона составляет менее 97%, перемешивание продолжают в том же режиме еще 0,5 ч и контроль по ВЭЖХ повторяют.

Если результат равен или превышает 97%, реакцию считают законченной и переходят к фильтрованию реакционного раствора. Для этого используют фильтр с размером пор не более 0,7 мкм.

Потеря массы при сушке не должна превышать 5% при сушке до постоянного веса при 100^oC в вакууме (1 мм Hg) над CaCl₂ и P₂O₅.

Содержание основного вещества в готовом продукте по данным ВЭЖХ не ниже 98%.

Таким образом получают окисленный глутатион в виде композита с комплексным соединением Pt(II) или Pd(II).

Внешний вид: белый порошок без запаха.

Растворимость: растворим в воде, изотоническом растворе хлорида натрия 0,9% для инъекций; нерастворим в спирте 95%, хлороформе, эфире и других органических растворителях.

Прозрачность и цветность раствора: раствор 0,05 г препарата в 10 мл воды прозрачен и бесцветен. pH 0,1% раствора: 5.0-6.0 потенциометрически, прибор pH/mV/^oC meter Cole Parmer, модель 59003-15 или аналогичный.

Подлинность: а) аминокислотный анализ (6 н. HCl, 110^oC, 20 ч), глицин - 2.0 15%; глутаминовая кислота - 2.0 15%; цистеин-2.0 40%; аминокислотный анализатор ААА "Т-339 М" Pragu или аналогичный.

б) ВЭЖХ - по времени выхода соответствует стандарту бис- ( - L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин динатриевая соль.

Условия хроматографирования: прибор BECKMAN "Gold Nouveau Chromatography Data System" Version 1.0, Diod Array Detector Module 126 или аналогичный.

Проба - 20 мкл 0,1% раствора препарата в мобильной фазе, хроматографирование на колонке ULTRASPERE ODS 250х4,6 мм с обращенной C₁₈ фазой в изократическом режиме ацетонитрил-0,1% трифторуксусная к-та (2:98); скорость потока 1 мл/мин, детектирование при 220 нм, сканирование 190-600 нм.

Чистота (содержание основного вещества): а) по ВЭЖХ не ниже 98%.

б) по аминокислотному анализу: не ниже 85% (анализ согласно Разделу "Подлинность", пункт "а" с точной навеской) Методика определения содержания элементов Точная навеска пробы (около 50 мг) растворялась в 50 мл бидистиллированной воды и раствор использовался для анализа.

Содержание платины определялось количественно методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе модели PQe, фирмы VG Elemental, Англия.

Относительная точность анализа 5%.

Содержание других элементов определяется количественно методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе модели TRACE 61E фирмы Thermo Jarrell Ash, США. Относительная точность анализа 5%: г) содержание натрия (Na) по эмиссионному спектральному методу: 7,0 0,5% д) содержание платины (Pt) по масс-спектральному методу: 0,032 0,01% е) содержание палладия (Pd) по масс-спектральному методу: 0,017 0,01% Содержание элементов, мкг/г: Серебро (Ag) - <1.0 (менее 0.0001%) Алюминий (Al) - 2.0 Мышьяк (As) - <1.0 Кадмий (Cd) - <0.05 Медь (Cu) - <0.5 Титан (Ti) - <0.5 Сурьма (Sb) - <0.5.

В настоящем изобретении заявляется метод усиления и пролонгирования способности соединения на основе окисленного глутатиона стимулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов. Метод включает этапы взаимодействия соединения на основе окисленного глутатиона с веществом-металлом в соотношении от 3000:1 до 1:1. Вещество-металл включает металл, выбираемый из группы, состоящей из платины и палладия.

В настоящем изобретении заявляется метод лечения лица, страдающего каким-либо заболеванием. Метод включает введение лицу, нуждающемуся в таком лечении, композита, состоящего из соединения на основе окисленного глутатиона и вещества-металла в соотношении от 3000:1 до 1:1 в количестве, эффективном для стимуляции эндогенной продукции цитокинов и/или гемопоэтических факторов, или и тех и других, до достижения терапевтического эффекта. Вещество-металл включает металл, выбираемый из группы, состоящей из платины и палладия. Терапевтический эффект включает облегчение, профилактику или лечение нежелательного состояния организма и может включать процесс, выбираемый из группы, состоящей из регуляции пролиферации нормальных клеток, регуляции дифференцировки нормальных клеток, и индукции апоптоза трансформированных клеток, где трансформированные клетки могут включать больные клетки, в первую очередь опухоле- трансформированные и вирус-трансформированные клетки.

В одном из воплощений изобретения соединение на основе окисленного глутатиона имеет общую формулу: в которой A, В, D, E, G и H может выбираться из группы, состоящей из органической части и соли органической части. Предпочтительно, чтобы "органическая часть" позволяла соединению на основе окисленного глутатиона сохранять растворимость в биологических средах и, кроме того, органическая часть не должна привносить токсические свойства в соединение на основе окисленного глутатиона в применяемых дозах. Понимается, что A, B, D, E, G и H могут быть одинаковыми или различаться. Предпочтительно, чтобы каждая из групп A-H могла включать часть, выбираемую из группы, состоящей из аминогрупп, карбоксильных групп и амидов. Например, A-H могут означать аминокислоты или их производные, связанные амидной связью. Или же любые две из A-H групп могут быть связаны друг с другом, по крайней мере, одной ковалентной связью. Таким образом, A-H могут быть частью циклической структуры.

В одном из воплощений изобретения композит включает соединение на основе окисленного глутатиона в количестве, значительно превосходящем количества вещества-металла, предпочтительно в соотношении от 3000:1 до 1:1, более предпочтительно от 1000:1 до 1:1, более предпочтительно от 1000:1 до 10:1, даже более предпочтительно от 1000:1 до 100:1. В другом воплощении идеи изобретения композит включает равные количества соединения на основе окисленного глутатиона и вещества-металла, то есть соотношение 1:1.

В одном из воплощений изобретения соединение на основе окисленного глутатиона - это сам окисленный глутатион (GSSG) и его соли, где оба A и E - это -CO₂H, оба B и D - это -NH₂, и оба G и H - это -CO₂M, где M - это противоион. Противоион может быть протоном, ионом с органическим основанием, таким как тетралкил-аммоний, щелочной металл, щелочноземельный металл, или переходный металл. Понимается, что в водной среде любая группа из A-H включает ионизированную группу, то есть A и E могут быть -CO₂, и B и D могут быть -NH₂⁺, и ионизированные группы нейтрализуются соответствующими противоионами.

Композит может быть получен различными методами, например при взаимодействии вещества-металла с глутатионом в присутствии окислителя, или же при добавлении вещества-металла к соединению на основе окисленного глутатиона.

Данные соединения и их лекарственные формы, полученные на основе композит с веществом GSSGPt, заявляются как лекарственные средства, способные в терапевтических целях в зависимости от исходного биологического состояния субъекта, нуждающегося в этом, стимулировать/модулировать эндогенную продукцию широкого спектра цитокинов и гемопоэтических факторов и/или воспроизводить эффекты цитокинов, а также осуществлять дифференцированное воздействие в отношении нормальных (регуляция метаболизма, пролиферации и дифференцировки) и трансформированных клеток (индукция механизмов апоптоза). Понятие "трансформированные клетки" означает опухоле- и/или вирус-трансформированные клетки.

Изобретение поясняется рисунками, которые являются схематичными и были сделаны без намерения передать изображение в точном масштабе. В рисунках каждый идентичный или почти идентичный компонент, приведенный на разных рисунках, представлен одной цифрой. Для ясности не каждый элемент обозначен на каждом рисунке, и не каждый компонент для каждого воплощения идеи изобретения приведен в случае, если иллюстрация не является необходимой для того, чтобы позволить обычному специалисту в данной области понять изобретение.

На фиг. 1 показана структурная формула бис-(- L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицин динатриевой соли с cis-диаминодихлорплатиной.

На фиг. 2 показана схема синтеза композита динатриевой соли окисленного глутатиона с cis-диаминодихлорплатиной.

На фиг. 3 показана донорно-акцепторная связь между атомом платины и двумя группами NH₃ за счет неподеленных электронов атомов азота.

На фиг. 4 представлен предполагаемый механизм стабилизации дисульфидной связи молекулы GSSG за счет обмена лигандов: NH₃-групп на атомы серы дисульфидной связи, а также посредством образования донорно-акцепторной связи между атомом платины и двумя атомами серы за счет неподеленных электронов атомов серы.

На фиг. 5 представлены предполагаемые механизмы общей стабилизации молекулы GSSG за счет механизма, показанного на фиг.4, а также путем обмена лигандов NH₃ на NH₂ группы глутатиона (сближение NH₂ групп и соответственно GS фрагментов), формирующих новую "биофизику" композита GSSGPt, где () обозначают донорные сайты, а (O) - акцепторные сайты.

На фиг. 6 показаны основные сайты (обведены кругами) химической модификации молекулы GSSGPt.

На фиг. 7 показана структурная формула бис-фенилаланил-GSSGPt На фиг. 8 изображена схема синтеза бис-[L-фенилаланил- -L-глутамил-]-L-цистинил-бис-глицина с cis-диаминодихлорплатиной.

На фиг. 9 показана структурная формула литиевой соли бис-(- L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицина.

На фиг. 10 показана стадия обработки исходного восстановленного глутатиона перекисью водорода при pH 8 (стадия схемы синтеза литиевой соли GSSGPt).

На фиг. 11 показано извлечение свободного гексапептида бис-(- L-глутамил)-L-цистинил-бис-глицина (III, стадия схемы синтеза литиевой соли GSSGPt).

На фиг. 12 показан перевод окисленной формы GSSG (III) в литиевую соль GSSGPt.

На фиг. 13 показан характер деградации ДНК в нормальных клетках контрольной группы (1), после обработки: GSSG (2); GSSGPt (3) - время инкубации - 48 ч.

На фиг. 14 показан характер деградации ДНК в клетках HL-60 контрольной группы (2), после обрабо