Глюкозаминовые дисахариды, способ их получения, фармацевтическая композиция

Глюкозаминовые дисахариды, способ их получения, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к (16)глюкозаминовым дисахаридам, имеющим общую формулу I, где R₁, R₂, R₃, R₄, R₂', R₃', R₄', R₆' имеют значения, указанные в формуле изобретения, а также к способу их получения и к фармацевтической композиции, включающей в качестве активного ингредиента эти дисахариды. Соединения по изобретению могут быть использованы при лечении или профилактике, как иммуномодулирующие, противоопухолевые агенты и компоненты вакцины. 3 c. и 30 з.п.ф-лы, 19 ил., 13 табл.

Настоящее изобретение относится к специфическим глюкозаминовым дисахаридам, в частности к 2-N- и/или 2'-N- ацилированным глюкозаминовым дисахаридам, где по крайней мере одна из ацильных групп разветвлена, и к соединениям, содержащим эти дисахариды. Далее, настоящее изобретение относится к способам получения этих дисахаридов из исходного продукта, содержащего радикал липида А липополисахаридов, исходный материал которых подвергается специфической щелочной обработке. Изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим эти дисахариды в качестве активного ингредиента, и, наконец, к применению этих дисахаридов в лечении и профилактике.

Липополисахариды представляют эндотоксины микроорганизмов, таких как грам-отрицательные бактерии, и включают полисахаридный компонент и липидный компонент. Этот липидный компонент, также называемый липидом А, определяет эндотоксические свойства липополисахаридов (Rietschel Е. Th. et al.in Immunobiology, Volume 186, pages 169-190 [1993]).

В US-A-4 912 094 описываются модифицированные липополисахариды, которые проявляют менее выраженные эндотоксические свойства, тогда как их антигенные, и иммуностимулирующие свойства сохраняются. Эти модифицированные липополисахариды 3-O-деацилированы и могут быть переведены в 3-O-деацилированные дисахариды путем кислотного гидролиза. Из этих соединений монофосфорил 3-O-деацилированный дисахарид является менее токсичным, чем дифосфорил 3-O-деацилированный дисахарид.

Настоящее изобретение касается дисахаридов, которые являются 3-O-деацилированными и 3'-O-деацилированными или содержат в 3-O- положении и/или в 3'-O-положении короткую O-присоединенную алкильную или ацильную группу, и содержат по крайней мере N-связанную разветвленную ацильную группу во 2-положении, 2'-положении, или в обоих: 2-положении и 2'- положении. Эти соединения проявляют, по-прежнему, пониженную эндотоксичность, хотя сохраняют биологическую активность (такую как иммуномодуляция) и проявляют противораковую активность.

Хотя синтетические 3-O- и 3'-O-деацилированные глюкозаминовые дисахариды, содержащие N-присоединенную ацильную группу во 2- и 2' -положении (соединение 307, Takeda, Н. et al. in CRC Critical Reviews in Microbiology, Volume 16, pages 477-523 [1989]; и соединение LA-19-PP, Rietschel et al. [1993]) проявляли некоторую иммунобиологическую активность в определениях in vitro, неожиданным было то, что эти специфические глюкозаминовые дисахариды проявляют сочетание пониженной эндотоксичности и сохраненной биологической активности, но эти активности значительно более слабые, чем у контрольных бактериальных образцов липида А. Они также лишены типичной эндотоксической активности.

Соответственно, настоящее изобретение касается (16) глюкозаминовых дисахаридов, имеющих общую формулу где R₁ представляет гидроксильную группу, дигидроксифосфоноилоксигруппу или ее заряженные формы, (C₁-C₅) ацилокси группу; (C₁-C₅) алкилокси группу, или группу X; R₂ и R'₂ каждая является ацильной группой или группой Y при условии, что, по крайней мере, R₂ или R'₂ являются группой Y; R₃ и R'₃ каждая представляют водород, (C₁-C₃) алкильную группу, или (C₁-C₃) ацильную группу; R₄ представляет водород, (C₁-C₃) алкильную группу; или (C₁-C₃) ацильную группу; R'₄ представляет водород, (C₁-C₅) ацильную группу, (C₁-C₅) алкильную группу, диметоксифосфоноильную группу, или фосфоногруппу или ее заряженные формы; и R'₆ представляет водород, гидроксильная группа, дигидроксифосфоноилоксигруппу, гидроксисульфонилоксигруппу, их заряженные формы, или группу Z; где группа X выбрана из группы, содержащей карбокси (C₁-C₅) алкоксигруппу; -O-CH-[(CH₂)_m COOH][(CH₂)_nCOOH] группу, где m = 0-5 и n = 0-5; фосфоно (C₁-C₅) алкильную группу; диметоксифосфоноилоксигруппу; гидроксисульфонилоксигруппу; гидроксисульфонил (C₁-C₅) алкильную группу; и заряженные формы группы X; где группа Y выбрана из группы, содержащей ацилоксиацильную группу, ациламиноацильную группу, ацилтиоацильную группу, (C₁-C₂₄) алкилоксиацильную группу, (C₁-C₂₄) алкиламиноацильную группу, (C₁-C₂₄) алкилтиоацильную группу; и где группа Z выбрана из группы, содержащей (C₁-C₂₄) алкилоксигруппу; (C₁-C₂₄) ацилоксигруппу; 3-деокси-D-манно-2- октулосоновую кислоту (KDO); (KDO)_n, где n = 1-10; полисахаридную боковую цепь, такая как боковая цепь натурального липополисахарида; компонент ядра, такой как компонент, происходящий из натурального липополисахарида; и амино- (C₁-C₈) алкилкарбоксильную группу; и их соли.

Данные глюкозаминовые дисахариды проявляют гораздо более низкую эндотоксичность, определяемую а исследовании лизата амебоцита limulus (LAL), чем липополисахариды (LPS, ЛПС), например, от E.coli, липид A и модифицированный липид A в соответствии с US-A-4912094. Более того данные глюкозаминовые дисахариды индуцируют реакционноспособные промежуточные продукты оксида азота и цитокины, такие как интерлейкин 1-альфа (ILI-alpha, ИЛ1-альфа), IL-6, фактор некроза опухоли (TNF, ФНО) и простагландин (PGE, ПГЕ).

Кроме того, данные дисахариды проявляют противоопухолевую активность, такую как в случае перитонеального карциноматоза.

И наконец, острая токсичность данных дисахаридов крайне низка. После внутривенного введения 100 мг дисахарида на кг массы тела смертности у мышей Swiss зарегистрировано не было.

Настоящее изобретение относится также к способу получения данных глюкозаминовых дисахаридов с использованием в качестве исходного продукта биологического образца, а именно, некоторого исходного продукта, содержащего радикал липида A полисахаридов из микроорганизмов, таких как грамотрицательные бактерии. Согласно изобретению этот исходный продукт подвергают, по крайней мере, обработке щелочью так, чтобы удалить O-присоединенные ацильные и/или O-присоединенные оксиацильные группы сахаров. Если приемлемо, обработанный щелочью исходный продукт может быть подвергнут дальнейшим обработкам для удаления полисахарида и ядерного компонента (путем обработки кислотой) и для замещения и обмена заместителей в 1-положении, 2-положении, 3-положении, 4-положении, 2'-положении, 3'-положении, 4'-положении, 6'- положении.

Однако согласно изобретению глюкозаминовые дисахариды могут быть получены путем синтеза, исходя из соответствующего глюкозаминового дисахарида, и введения целевых заместителей во 2- и/или 2'-положении.

Благодаря крайне низкой эндотоксичности в сочетании с описанной выше биологической активность эти дисахариды по изобретению представляют собой наилучший активный ингредиент фармацевтической композиции. Такая фармацевтическая композиция и дисахариды как таковые могут использоваться в качестве иммуномодулирующего агента, противоопухолевого агента и как компонент вакцины.

Глюкозаминовый дисахарид по изобретению (a(16)D- глюкозаминовый димер) характеризуется тем, что каждый глюкозамин содержит в 3- и 3'-положении гидроксильную группу или короткую O- присоединенную алкильную или ацильную группу, не существенно изменяющую эндотоксичность и/или биологическую активность, и, кроме того, по крайней мере одну N-присоединенную разветвленную ацильную группу во 2- или 2'-положении или в обоих 2- и 2'- положениях. Оставшееся 2'- или 2-положение ацилировано. Вероятно, наличие двух гидрофобных цепей во 2-положении и 2'-положении, по крайней мере одна из которых находится в виде разветвленной ацильной группы, придает дисахариду сочетание крайне низкой эндотоксичности и сохраненной биологической активности.

Разветвленная ацильная группа, которая здесь обычно обозначается как группа Y, выбрана из групп, содержащих ацилоксиацильную группу, ациламиноацильную группу, ацилтиоацильную группу, (C₁-C₂₄)алкилоксиацильную группу, (C₁-C₂₄)алкиламиноацильную группу и (C₁-C₂₄)алкилтиоацильную группу.

В случае ацилоксиацильной группы две ацильные группы связаны через атом кислорода, в случае ациламиноацильной группы через NH-группу и в случае ацилтиоацильной группы через атом серы. Другие члены группы Y, (C₁-C₂₄) алкилоксиацильная группа, (C₁-C₂₄)алкилтиоацильная группа и (C₁-C₂₄)алкиламиноацильная группа, могут быть получены, исходя из соответствующей гидроксижирной кислоты.

Преимущественно, группа Y представляет собой N-присрединенную ацильную группу, разветвляющуюся в ее 3-положении, например, 3-ацилоксиацильная группа, 3-ациламиноацильная группа, 3-ацилтиоацильная группа. То же относится и к указанным выше (C₁-C₂₄) алкильным эквивалентам.

Преимущественно, члены группы Y содержат один или два ацильных радикала, предпочтительно выбранных из остатков жирных кислот, остатков гидроксижирных кислот и остатков оксожирных кислот. Когда ацилоксиацильная группа является, преимущественно, 3-ацилоксиацильной группой, такие ацильные радикалы содержат остаток 3-гидроксижирной кислоты или, для эфирно-присоединенной группы, остаток 3-оксожирной кислоты. Типичными примерами ацилоксиацильной группы являются 3-гидрокси (C₄-C₂₄) ацилы жирных кислот, которые эфирно-связаны по 3-гидроксиположению с (C₁-C₂₄) карбоновой кислотой. Ацилоксиацильная группа, предпочтительно, является 3-гидрокси(C₈-C₁₈)ацилом жирной кислоты, который связан эфирной связью по 3-гидроксиположению с (C₁₀-C₁₈) жирной кислотой. Такие ацилоксиацильные группы представлены в липид A-компоненте грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Campylobacter jejuni, Rhodocyclus gelatinosus, Chromobacterium violaceum, Neisseria meningitidis, Salmonella minnesota.

В первой группе глюкозаминовых дисахаридов по изобретению ацилоксиацильная группа является N-присоединенным 3-гидроксиC₁₄-ацилом жирной кислоты, эфирно-связанным по 3- гидроксиположению с C₁₂жирной кислотой с данной ацилоксиацильной группой по 2'-положению. В другом выбранном глюкозаминовом дисахариде по изобретению ацилоксиацильная группа является N-присоединенным 3-гидроксиC₁₄-ацилом жирной кислоты, эфирно-связанным по 3-гидроксиположению с C₁₄-жирной кислотой, и ацилоксиацильная группа находится предпочтительно во 2'- положении.

В другом выбранном глюкозаминовом дисахариде по изобретению ацилоксиацильная группа является N-присоединенным 3- гидроксиC₁₄-ацилом жирной кислоты, эфирно-связанным по 3- гидроксиположению с C₁₂-жирной кислотой с данной ацилоксиацильной группой во 2-положении. В другом выбранном глюкозаминовом дисахариде по изобретению ацилоксиацильная группа является N-присоединенным 3-гидроксиC₁₄-ацилом жирной кислоты, эфирно-связанным по 3-гидроксиположению с C₁₂-жирной кислотой с ацилоксиацильной группой как во 2-положении, так и во 2'- положении.

Когда группа Y содержит хиральный центр, изобретение охватывает все R- и S-энантиомеры и любую рацемическую смесь.

Другой N-присоединенный заместитель может быть ацильной группой или также ацилоксиацильной группой. Согласно второй группе дисахаридов по изобретению ацильная группа является 3- гидрокси (C₄-C₂₄) жирной кислотой, предпочтительно 3-гидрокси(C₁₀-C₁₈) жирной кислотой. В выбранных дисахаридах по изобретению ацильная группа является 3-гидроксиC₁₄-жирной кислотой во 2-положении или во 2' -положении.

Однако N-присоединенный заместитель может являться также ацилоксиацильной группой, определенной выше, и содержащей N-присоединеннный 3-гидрокси(C₁₄-C₂₄)ацил жирной кислоты, который эфирно-связан по 3- гидроксиположению с (C₁-C₂₀)карбоновой кислотой, предпочтительно, предпочтительно 3-гидрокси(C₈-C₁₈) жирной кислоты, эфирно-связанный по 3-гидроксиположению с (C₁₀-C₁₈) -жирной кислотой. Более предпочтителен дисахарид, где R₂ является N-присоединеннным 3-гидрокси C₁₄-ацилом жирной кислоты, эфирно-связанным по 3-гидроксиположению с C₁₂-жирной кислотой или C₁₆-жирной кислотой, и где R₂ является N-присоединеннным 3-гидроксиC₁₄-ацилом жирной кислоты, эфирно-связанным по 3-гидроксиположению с C₁₂-жирной кислотой и C₁₄-жирной кислотой.

Замечено что в группе Y ацильные группы и/или ацильная или алкильная группа могут быть связаны между собой.

В данной спецификации термин "остаток жирной кислоты" означает: значительно гидрофобная цепь из C₂-C₃₀ атомов, которая может быть неразветвленной, разветвленной, насыщенной, моно- или полиненасыщенной, с включенными одним или более гетероатомами, такими как азот, кислород, сера, и которая может быть замещена одним или более заместителями, такими как гидроксил, оксо, ацилокси, алкокси, амино, нитро, циано, галогено, сульфгидрил, при условии, что биологическая активность затрагивается не существенно. Пример замещенного остатка жирной кислоты (содержащего амидно-присоединенный заместитель) описан Onozuka, К. et al. in Int.J.Immunopharmac, Volume 15, pages 657-664 [1993].

Заместитель R₁ может быть (C₁-C₅)ацилоксигруппой или (C₁-C₅)алкилоксигруппой, тогда как R₄ может быть (C₁-C₅) ацильной группой или (C₁-C₅) алкильной группой, при условии, что свойства глюкозаминовых дисахаридов затрагиваются не существенно. Кроме того, R₁ может быть гидроксильной группой, a R₄ может быть водородом. Предпочтительно, R₁ и R₄, каждая, могут быть фосфоросодержащей группой. В частности, такая группа в 1-положении и 4'-положении может влиять на биологическую активность, такую как различная стимуляция цитокинов (смотри Takada, D.C. and Ryan,J., CRC Press, Volume I, pages 107-134 [1992], в особенности page 123).

Выбранные дисахариды по изобретению содержат дигидрокси-фосфоноилоксигруппу по 1-положению и фосфоногруппу по 4-положению, причем группа в 1-положении находится предпочтительно в конфигурации.

Заместитель R₁ может быть также представлен группой X. Группа X обычно обладает отрицательным зарядом при физиологическом pH. Группа X может быть кapбoкси(C₁-C₅)алкилоксигруппой. Группа X может быть также дикарбоновой кислотой формулы -O-CH-[(CH₂)_mCOOH] [(CH₂)_nCOOH], где m = 0-10 и n = 0-10, как, например, m и n=0, m и n=1, и m=1 и n=3. Заместитель в виде дикарбоновой кислоты по 1-положению, где m и n=1, описан Onozuka, К. et al. (1993). Вместо дикарбоновой кислоты группа X может представлена фосфоно(C₁-C₅)алкильной группой, такой как фосфонометильная группа или фофсфоноэтильная группа.

Замещенная группа X может также иметь вид сульфатной группы или гидроксисульфонил(C₁-C₅)алкильной группы, как, например, гидроксисульфонилметильная группа.

Заместитель R₃ и R'₃ могут быть короткой алкильной или ацильной группой, которая не влияет существенно на эндотоксичность и/или биологическую активность глюкозаминовых дисахаридов по изобретению. Примерами являются (C₁-C₃)алкильная группа и (C₁-C₃)ацильная группа. Предпочтительно, заместители R₃ и R'₃ оба являются водородами, что означает, что 3-положение и 3'-положение не ацилированы.

Заместитель R₄ по 4-положению может быть (C₁-C₃) алкильной группой или (C₁-C₃) ацильной группой, значение которых было описано выше. 4-O-Ацилированный дисахарид может быть синтезирован с использованием способа, описанного Kusumoto S. et al., ACS Symposium Series, Volume 231, pages 237-254, (1993). Однако по 4-положению предпочтительна гидроксильная группа (R₄=H).

Заместитель R₆ может быть водородом, гидроксильной группой, дигидроксифосфоноилоксигруппой, дигидроксисульфонилоксигруппой и их заряженными формами.

В целях улучшения водорастворимости глюкозаминовых дисахаридов по изобретению заместитель по 6'-положению может иметь выраженный гидрофильный характер, обусловленный группой Z. Группой Z может быть 3-деокси-D-манно-2-октулосоновая кислота (КДО) или несколько молекул КДО, таких как присутствуют во внутреннем ядре натуральных полисахаридов, вплотную примыкающих к липид A-компоненту.

Группа Z может быть также полной или частичной полисахаридной цепью, такой как боковая цепь из натуральных липополисахаридов или ядерный компонент натуральных липополисахаридов.

Группа Z также может быть амино(C₁-C₈)алкилкарбоксильной группой.

Водорастворимость дисахаридов по изобретению с одной стороны определяется наличием заряженных групп, гидрофильным характером заместителя по 6'-положению. С другой стороны, водорастворимость может быть также улучшена, если дисахарид находится в виде соли, такой как соль, содержащая один или более катионов щелочных металлов и/или ионов аммония, образующий пару с, например, дигидроксифосфоноилоксигруппами, карбоксильными группами, фосфоногруппами, гидроксисульфонилоксигруппами и гидроксисульфонилалкильными группами, если таковые присутствуют.

Отмечается, что любая алкильная или ацильная цепь или радикал может быть неразветвленной, разветвленной, насыщенной, моно- или полиненасыщенной, с включением одного или более гетероатомов, таких как азот, кислород, сера, и которая может быть замещена одним или более заместителями, такими как гидроксил, оксо, ацилокси, алкокси, амино, нитро, циано, галогено, сульфгидрил, при условии, что биологическая активность не затрагивается существенно.

Глюкозаминовые дисахариды по изобретению могут быть получены из исходного продукта, содержащего радикал липида A липополисахаридов, которые присутствуют в микроорганизмах, таких как грамотрицательные бактерии. Данные липополисахариды присутствуют, например, в фракции, содержащей поверхностную структуру данных микроорганизмов и в липополисахаридах из нее. Выбранными грамотрицательными бактериями, используемыми в качестве источника исходного продукта, является Escherichia coli и Haemophilus influenzae. Однако имеющиеся в продаже ЛПС или липид A могут быть использованы в качестве исходного продукта.

Избирательное деацилирование по 3-положению и по 3'-положению проводится с использованием обработки щелочью. Условия щелочной обработки выбираются такими, чтобы оба глюкозамина 3- гидроксидеацилировались. Обработка щелочью может проводиться с использованием гидроксидов, карбонатов и фосфатов, таких как гидроксид натрия или карбонат калия. Показательными органическими щелочными агентами являются алкиламины, такие как диэтиламин и триэтиламин. Обработка щелочью, как правило, проводится в водной и органической среде. pH обычно находится в пределах 10-14, как, например, 11-13, в практических условиях pH бывает, например, 12.2. Обработка щелочью, как правило, проводится при температуре между температурой окружающей среды и 70^oC, такой как 37^oC. Временной период зависит от типа исходного продукта. Если исходить из микроорганизмов, период времени колеблется между 1 часом и 10 днями, как, например, 8 часов и 5 дней, но, как правило, в пределах 8-40 часов. Если исходить из липополисахаридов или липида A, период времени может быть 0,2-10 часов, как, например, 1-5 часов. На практике период времени примерно равен от 1.5 до 3 часов.

Когда исходный продукт содержит в 6'-положении ядерный компонент, который надо удалить, исходный материал подвергают обработке кислотой для удаления ядерного компонента. Данная обработка кислотой может проводиться до или после описанной выше обработки щелочью. Обработка кислотой проводится при pH 1-5, предпочтительно, при pH в пределах 2.5-4.5, как правило, при pH выше чем 3, и ниже чем 4.5, как, например, при 3.5. При pH 1 и ниже глюкозаминовый дисахарид дефосфорилируется, что приводит к монофосфорилированной форме. Кислоты, которые можно использовать, - минеральные и органические кислоты, такие как соляная кислота и ледяная уксусная кислота. Период времени обработки кислотой от примерно 30 минут до 5 часов. Как, например, 1-2 часа. Во время обработки кислотой температуру повышают до примерно 70-100^oC, как, например, 80-100^oC, на практике 95^oC. Впоследствии температуру снижают до температуры окружающей среды.

Глюкозаминовые дисахариды по изобретению могут также быть получены, исходя из соответствующего де-, моно- или дифосфорилированного глюкозаминового димера путем присоединения ацилоксиацильной группы, ациламиноацильной группы и/или ацилтиоацильной группы по обоим 2-положению или 2'-положению.

После частичного деацилирования данных глюкозаминовых дисахаридов по изобретению и разделения продуктов получаемые глюкозаминовые дисахариды имеют в своем составе разветвленную ацильную группу по 2-положению или по 2'-положению.

Глюкозаминовые дисахариды по изобретению могут быть применены в фармацевтической композиции или лекарстве и использованы как иммуномодулирующий агент для ингибирования, стимулирования или индуцирования толеризации продукции реакционноспособных промежуточных форм оксида азота и цитокинов в зависимости от частоты применения и от дозировки, как противоопухолевый агент, например, Т-клеточный реактивации, как компонент вакцины, как конкурент за места связывания эндотоксина и как модулятор интерлейкинов. Благодаря крайне низкой эндотоксичности данные дисахариды почти или значительно свободны от побочных эффектов.

Дисахариды по настоящему изобретению могут применяться систематически или ограниченно с использованием внутривенной инъекции, подкожной инъекции, интраперитонеальной инъекции, внутримышечной инъекции и т.п. Дозировка варьируется в зависимости от пациента - животного или человека, возраста, массы тела, симптомов или заболевания, подлежащего излечению, желаемого терапевтического эффекта путем введения, периода лечения и т.п. Удовлетворительные эффекты будут получены при дозировке от 0.001 до 500 мг на кг массы тела, вводимых одной или более дозами в день или в форме для длительного высвобождения.

Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель для, например, неперорального введения водных или неводных растворов, суспензий и эмульсий. Водные растворы или суспензии могут содержать дистиллированную воду или физиологический раствор. Неводные растворы могут включать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, спирты. Композиция может содержать другие добавки, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульсифицирующие агенты, диспергирующие агенты и т.п.

Для более полного понимания настоящего изобретения дана отсылка к следующим примерам, которые приведены здесь лишь в целях иллюстрации и не предназначаются для ограничения рамок настоящего изобретения.

Пример 1 Escherichia coli I-1147 (депонированную в CNCM 3 октября 1991 г под номером I-1147) культивировали в культуральной среде, композиция которой описана в таблице 1.

Раствор-концентрат олигометаллов: 2,5 г FeCl₂H₂O, 0,25 г CoCl₂6H₂О, 0,25 г NaMoO₄7H₂O, 0,25 г Мn3SO₄4H₂O, 0,25 г ZnSO₄7H₂O, 0,25 г NiSO₄7H₂O, 0,05 г H₃BO₄, 0,05 г CuSO₄, затем добавить 1,0 л H₂O, перемешать и добавить 1,1 мл H₂SO₄ (85%).

pH культуральной среды доводили, используя 5 н. NaOH, 5% аммиак или 25% HCI. Escherichia coli I-1147 культивировали при аэрировании и перемешивании (500 об/мин), 37^oC и при pH 6,9.

Содержимое ферментера после этого инактивировали, используя температурную обработку (105^oC в течение 2 минут).

Инактивированное содержимое ферментера подвергали ультрафильтрации (отсечение 1000 kD) и оставшиеся бактерии отмыли, используя 0,6% водный раствор NaCl. Отмытую суспензию бактерий концентрировали путем ультрафильтрации. Выход биомассы составлял 764 г сухого веса.

Биомассу разбавляли до 7,0 г/л и подвергали щелочной обработке путем добавления 345 мл 10,77 N NaOH и инкубации при 37^oC в течение 40 часов (pH 12,2).

Щелочной экстракт подвергали первой ультрафильтрации (отсечение 1000 kD), и фильтрат - второй ультрафильтрации (10 kD). Задержанный остаток подвергали обработке кислотой.

Задержанный остаток разбавляли 7,0 л воды и подкисляли при помощи 370 мл ледяной уксусной кислоты (конечный pH 3,52). Смесь прогревали при 95^oC в течение 120 минут при перемешивании. После этого кислую суспензию охлаждали до 25^oC. Осадок отделяли путем центрифугирования (4000 X g в течение 50 минут). Осадок вновь суспендировали в воде (3,7 л) и подвергали экстракции пропан-2-олом (4,3 л) и через 60 минут при 25^oC добавляли 252 мл триэтиламина (pH 9,0) и продолжали перемешивание в течение 24 часов.

Супернатант собирали путем центрифугирования (4000 X g, 25^oC в течение 50 минут) и осадок вновь экстрагировали 90% пропан-2- олом. Супернатанты объединяли и подвергали хроматографии с обращенной фазой (Waters No. 10001, Preparative C₈, Альтернативно, обработанный кислотой экстракт подвергали ультрафильтрации и задержанный остаток (>1000 kD) концентрировали и диализовали против 5 объемов воды. Диализированный остаток разводили 9 объемами пропан-2-ола и устанавливали pH 9 с помощью триэтиламина (TEA). Экстракцию проводили при перемешивании в течение 2 часов.

Супернатант удаляли, как описано выше, и осадок вновь экстрагировали пропан-2-олом. Супернатанты объединяли и подвергали вакуумному концентрированию (40^oC, 12 Topp), и, в конце, подвергали хроматографии с обращенной фазой C₁₈ Prep Sep Pak (Waters N. 10001).

Каждый из двух супернатантов разводили двумя объемами воды, и смешивали с 5 мМ тетрабутиламмоний фосфатом (TBAP) и наносили на колонку, содержащую 50 г обращенной фазы C₁₈ Prep Sep Pak (Waters N. 10001, препаративная C₁₈, прекондиционированную 250 мл CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 5 мМ TBAP. Колонку промывали 60% CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 5 мМ TBAP и 40% пропан-2-олом: H₂O 9:1, (по объему) + 5 мМ TBAP. Дисахариды по изобретению элюировались во фракции при 30% CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 5 мМ TBAP и 70% пропан-2-ол:H₂O 9:1, (по объему) + 5 мМ TBAP.

Дисахаридную фракцию, полученную при хроматографии с обращенной фазой, разбавляли водой 1:1, (по объему) + 25 мМ TBAP и наносили на препаративную ЖХВР колонку (Millipore- Waters Bondapak C₁₈ 300 15М, 300 мм X 47 мм). Дисахаридная фракция по изобретению элюировалась 67% пропан-2-олом:H₂O 9:1, (по объему) + 25 мМ TBAP и 33% CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 25 мМ TBAP. Эта фракция содержала 55 мг дисахарида A по изобретению.

Обессоливание дисахарида Соль удаляли из аликвот фракции дисахарида A следующим образом. Колонка Sep Pak Vac C₁₈ Plus (silica C₁₈, 0,6 мл, Waters N. 20515) была последовательно кондиционирована введениями 5 мл CHCl₃ - CH₃OH 2:1, (по объему), 5 мл CH₃CN и 5 мл CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему). Образец был нанесен на колонку после разведения фракции ЖХВР тремя объемами H₂O, с доведением общего объема разведенного образца до 6 мл. TBAP затем был смыт 10 мл CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 10 мл мМ HCl, и последующими 10 мл CH₃CN. Чистый дисахарид A затем снимали 5 мл CHCl₃-CH₃OH 2:1, (по объему).

Фракцию высушивали выпариванием в вакууме (12 Topp) при 35^oC. Обессоленный дисахарид A растворяли в H₂O:TEA 1000:1, (по объему) для биологических или биохимических определений, или в хлороформ:метаноле 2:1, (по объему) для FAB-MS.

Получение в виде натриевой соли Колонка, содержащая 10 г обращенной фазы C₁₈Prep Sep Pak (Waters N. 10001, препаративная C₁₈,125 ), была последовательно прекондиционирована 50 мл CH₃CN и 50 мл CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему).

Образец (фракция ЖХВР) был нанесен на колонку после разведения в 1 объеме H₂O. После связывания колонку промыли 100 мл CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 5 мл TBAP. Дисахарид снимали 50 мл пропан-2-ола:H₂O 9:1, (по объему) + 5 мл TBAP.

Полученную фракцию очищали следующим образом. Колонка, содержащая 20 мл быстро текущей Q-Sepharose (Pharmacia 17-0510-01), была последовательно уравновешена 30 мл NaOH 1М и промыта водой для нейтрализации, затем 30 мл HCl 1М и промыта водой для нейтрализации.

Образец наносили непосредственно на колонку. После связывания несвязавшийся материал смывали 200 мл H₂O и 100 мл пропан-2-ола:H₂O 9:1, (по объему). Дисахарид элюировали 100 мл NaCl 0,9%:изопропанолом 1:1, (по объему).

Окончательная очистка была проведена следующим образом. Колонку, содержащую 10 г обращенной фазы C₁₈ Prep Sep Pak, последовательно прекондиционированную 50 мл CH₃CN, 50 мл CHCl₃:CH₃OH 2:1, (по объему), 50 мл CH₃CN и 50 мл 50% CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему). Образец наносили на колонку после разведения 1 объемом воды. После связывания колонку промывали последовательно 200 мл H₂O, 200 мл пропан-2-ола:H₂O 9:1, (по объему) и 50 мл CHCl₃CN. Дисахарид элюировали 50 мл CHCl₃-CH₃OH 2:1, (по объему). Фракцию высушивали упариванием в вакууме (12 Topp) при 35^oC.

Натриевая соль была легко растворима в воде (до 100 мг/мл).

Пример 2 Haemophilus influenzae (полученный из Национальной Коллекции Типов Культур - National Collection of Type Cultures (АТСС 9795)) культивировали в культуральной среде, состав которой описан в таблице 2.

Культуральная среда была дополнена гемином (10 мг/л) и NADH (4 мг/л). pH доводили до 7,0 +/- 0,3, используя 5 н. NaOH или 25% HCl. После начала установления стационарной фазы культивирование прерывали и содержимое ферментера инактивировали температурной обработкой (100^oC в течение 100 секунд). Инактивированную культуру центрифугировали и отделенную биомассу разбавляли 0,6% водным раствором NaCl (приблизительно 60 г/л). Щелочную обработку проводили путем добавления 10 н. NaOH до конечной концентрации 0,2 н. NaOH. Обработку проводили при 37^oC в течение 5 дней при непрерывном перемешивании.

Обработанный щелочью лизат непосредственно подвергали кислотной обработке после подкисления до pH 3,5 ледяной уксусной кислотой. Смесь прогревали при 95^oC в течение 120 минут, после чего охлаждали до комнатной температуры.

Осадок центрифугировали (10 000 X g, 30 минут при 4^oC), a супернатант отбрасывали.

Осадок вновь суспендировали в CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) и доводили pH до 9, применяя TEA. После центрифугирования (15 000 X g, 10 минут) супернатант доводили до 5 мМ TBAP. Супернатант наносили на колонку Sep Pak Vak Cis (10 г silica 018, 35 мл., Waters N. 43345), кондиционированную 50 мл CH₃CN: H₂O 1:1, (по объему). Фракцию, содержащую дисахарид B по изобретению, элюировали 50 мл пропан-2-олом:H₂O 9:1, (по объему) + 5 мМ TBAP.

Эту фракцию концентрировали выпариванием (35^oC, 12 Topp) приблизительно до 2 мл. Фракцию центрифугировали (15 000 X g, 5 минут) и супернатант наносили на полупрепаративную C₁₈ колонку ЖХВР (Macherey-Nagel N.715806, 250 мм х 10 мм O, Nucleosil 300-7C18). Фракцию, содержащую дисахарид B, по изобретению, элюировали во фракцию, содержащую 28% CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 25 мМ TBAP и 72% пропан-2-ол:H₂O 9:1, (по объему) + 25 мМ TBAP.

Дисахарид B обессоливали, используя метод, подобный приведенному в примере 1.

Пример 3 Липополисахарид Escherichia coli 0111: D4 (Sigma, продукт No. L3024) подвергали щелочной обработке в присутствие 0,2 М NaOH при 37 С в течение 1,5 часов. Раствор нейтрализовали 1 М фосфорной кислотой.

400 мкл обработанного щелочью раствора LPS концентрировали путем ультрафильтрации (Millipore Ultrafree-MC, UFC3 LGC OO, отсечение 10 kD).

Задержанный остаток (> 10 kD) разводили в 400 мкл H₂O и подвергали кислотной обработке путем доведения ледяной уксусной кислотой до 0,2 М концентрации уксусной кислоты. Подкисленный раствор нагревали при 95^oC в течение 120 минут. После охлаждения до 25^oC осадок осаждали центрифугированием (15 000 X g, 10 минут), а супернатант отбрасывали. Осадок разводили в 20 мкл H₂O:TEA 1000:1, (по объему) и этот раствор наносили на аналитическую C₁₈ колонку ЖХВР (Supelco N. 58985, Supelcosil LC-18, 3 мкм, 150 мм х 4,6 мм О). Дисахаридную фракцию по изобретению элюировали во фракцию, содержащую 42% CH₃CN: H₂O 1: 1, (по объему) + 5 мМ TBAP и 58% пропан-2-ол:H₂O 9:1, (по объему) + 5 мМ TBAP.

Пример 4 Раствор 2 мг/мл Липида A из Escherichia coli F-583 (Sigma, продукт N L5399) готовили на смеси H₂O:TEA 1000:1 (по объему) и этот раствор подвергали щелочной обработке, используя 2 М NaOH при 37^oC в течение 2,5 часов. Раствор нейтрализовали, используя 1 М фосфорную кислоту.

Нейтрализованный раствор наносили на аналитическую колонку ЖХВР (Supelco N 58958, Supelcosil LC- 18, 3 мкм, 150 мм x 4,6 мм). Дисахариды по изобретению элюировали 42% CH₃CN:Н₂O 1:1, (по объему) + 5 мМ TBAP и 58% пропан-2-ол:Н₂O 9:1 (по объему) + 5 мМ TBAP.

Пример 5 2-Амино-2-деокси-6-O-(2-амино-2-деокси-4-O-фосфоно- -D-глюкопиранозил)- -D-глюкопиранозилдигидрофосфат [Holst et al. Eur. J. Biochem. 214 (1993) 695-701] обрабатывали в метаноле с метоксидом натрия (точно 4,0 мол. эквив.) и затем (R)- 3-додеканоилокситетрадекановым ангидридом (2,2 мол. эквив.) [полученный взаимодействием (R)-3-додеканоилокситетрадекановой кислоты с DDC (0,5 мол. эквив.) в безводном дихлорметане, см. Charon et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1. (1984) 2291-2295]. Через 12 часов при комнатной температуре добавляли воду (2-кр. объем по отношению к метанолу) и смесь экстрагировали диэтиловым эфиром (для удаления 3-додеканоилокситетрадекановой кислоты). Водную фазу концентрировали и сырой дисахарид C по изобретению подвергали ЖХВР с обращенной фазой. Продукт растворяли в H₂O:TEA 1000:1 (по объему) и добавляли тетрабутиламмоний (TBAP)до концентрации 5 мМ. Этот раствор затем наносили на препаративную колонку ЖХВР (Millipore-Waters Bondapak C₁₈ 300 15М, 300 мм х 47 мм). Дисахарид C элюировали градиентом CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 25 мМ TBAP (раствор A) и пропан-2-ола:H₂O 9:1 (по объему) +25 мМ TBAP (раствор B) (50%A / 50%B - 0%A-:100%В при 1%/мин, скорость 80 мл/мин.). Обессоливание проводили следующим образом. Фракцию ЖХВР, содержащую дисахарид C, разводили водой, затем наносили на колонку C₁₈-Sep Pak Vak Plus (Waters) [C18 силикагель с обращенной фазой, последовательно прекондиционированной CHCl₃:CH₃ОН 2:1 (по объему), CH₃CN, CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему)]. TBAP удаляли путем последовательного промывания CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему), 10 мМ HCl и CH₃CN. Чистый дисахарид C элюировали CHCl₃:CH₃OH 2:1, (по объему).

Пример 6 Водную фазу, содержащую дисахарид C, полученный по примеру 5 (до очистки), обрабатывали водным раствором гидроокиси натрия (точно 1,0 моль. эквив. ; концентрация, приводящая к начальному значению pH 12,5); через 24 часа при комнатной температуре смесь доводили до pH 6,5-7 и наносили на препаративную колонку ЖХВР (Millipore-Waters Bondapak C18 300 15М, 300 мм х 47 мм). Дисахариды A и D элюировали градиентом CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 25 мМ TBAP (раствор A) и пропан-2-ол:H₂O 9:1, (по объему) + 25 мМ TBAP (раствор B) (75%A: 25%B - 0%A: 100%B при 1%/мин, скорость тока 80 мл/мин). Фракции ЖХВР, содержащие дисахариды A и D обессоливали, как описано для дисахарида C в примере 5.

Пример для сравнения (не по изобретению) Раствор липида A 10 мг/мл из Escherichia coli F-583 (продукт Sigma N L5399) получали в смеси H₂O:триэтиламин в соотношении 1000:1, (по объему) и затем подвергали щелочной обработке 0,2 М NaOH при 37^oC в течение 20 минут. Этот период времени был достаточен только для 3-O деацилирования липида A (Myers et al. in Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions, pages 145-156 [1990], Elsevier Science Publishers).

Раствор нейтрализовывали ортофосфорной кислотой. Для биологических определений его разводили в 0,1% TEA/0,9% NaCI и использовали без дальнейшей очистки.

Для FAB-MS образец этого обработанного щелочью липида А очищали при помощи ЖХВР с обращенной фазой (Supelco N 58985, Supelcosil LC18, 3 мкм, 15 мм х 4,6 мм). Главный пик, элюирующийся при 18% CH₃CN:H₂O 1:1, (по объему) + 5 мМ TBAP и 82% пропан-2-ол:H₂O 9:1, (по объему) + 5 мМ TBAP, обессоливали в условиях, описанных в примере 1. Анализ FAB-MS дал молекулярный ион 1570,1 единиц массы (расчетный 1569,1 ед