Нуклеиновые кислоты, модифицированные аминокислотами

Нуклеиновые кислоты, модифицированные аминокислотами

Реферат

 

Описываются новые производные аминокислот или аминоспиртов формулы 1 в любой из групп I, II: где N обозначает азот. Группа I: Х обозначает chr₂OH, где R₂ обозначает Н, (низший алкил)амин или (низший алкил)имидазол; Y обозначает Base-(CH₂)_n-, где Base обозначает негалогенизированное вариабельное нуклеозидное основание, где n равно 1-7; А обозначает карбонил; Z обозначает Н или ОR₃, где R₃ обозначает Н, низший алкил, (низший алкил)амин или (низший алкил)имидазол; W обозначает chr₄OH, где R₄ обозначает Н, (низший алкил)амин или (низший алкил)имидазол. Группа II: А обозначает карбонил; Х обозначает Ваsе-(CH₂)_n-, где Ваsе обозначает негалогенизированное вариабельное нуклеозидное основание, где n равно 1-3; Y обозначает -CH₂OH; W обозначает -CH₂OH; Z обозначает Н. Соединения по изобретению являются аналогами олигонуклеотидов, в которых фуранозное кольцо встречающейся в природе нуклеиновой кислоты заменено на остаток аминокислоты или модифицированного аминоспирта. В некоторых воплощениях новые соединения по изобретению, в частности, пригодны для антисмыслового контроля экспрессии генов. Соединения по изобретению также могут быть использованы в качестве зондов для гибридизации нуклеиновых кислот или в качестве праймеров. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 4 табл., 34 ил.

Область изобретения Изобретение относится к области аналогов полинуклеотидов, в которых отсутствуют фуранозные кольца.

Уровень техники Олигонуклеотиды, которые связываются последовательность-специфическим образом с комплементарными нуклеиновыми кислотами (смысловой цепи) с помощью водородных связей так, чтобы ингибировалась экспрессия гена, обычно называют антисмысловыми олигонуклеотидами. Эти синтетические олигонуклеотиды связывают мишень (мРНК) и ингибируют таким образом трансляцию РНК-мессенджера. Такой антисмысловой принцип (Uhlmann, Е. et al., Chem. Reviews, 1990, 90, 543-584; и Stein, С.A. et al., Cancer Res., 1988, 48, 2659-2688) используется в природе для регуляции экспрессии генов. Этот антисмысловой принцип был использован в лабораторных условиях не только для ингибирования, но также для активации экспрессии генов. Впервые в 1978 Замечник и Стефенсон предложили применять синтетические олигонуклеотиды в целях терапии (Stephenson, M. L. ; and Zamecnik, P. С., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 280 and 285). Специфическое ингибирование антисмысловыми полинуклеотидами основано на специфическом Уотсон-Криковском спаривании оснований между гетероциклическими основаниями антисмыслового олигонуклеотида и вирусной нуклеиновой кислоты. Процесс связывания олигонуклеотидов с комплементарными нуклеиновыми кислотами называется гибридизацией. В частности, интересен олигомер, имеющий последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований мРНК, кодирующей белок, необходимый для развития болезни. Путем специфической гибридизации с такой мРНК может быть нарушен синтез белка, кодируемого этой мРНК.

Получение немодифицированных олигонуклеотидов, то есть олигонуклеотидов, имеющих структуру ДНК, является центром внимания многих групп ученых в последнее десятилетие. Синтез с помощью фосфорамидитов согласно Карузерс (McBride, L. J. ; and Caruthers, M.H., Tetrahedron Letts., 1983, 24, 245), первоначально предложенный Летсинджером (Letsinger, R.L.; and Lunsford, W.B. , J.Amer.Chen.Soc., 1976, 98, 3655) как фосфиттриэфирный метод, в настоящее время является наиболее эффективным методом получения фосфодиэфирных олигонуклеотидов. Когда в качестве антисмысловых олигонуклеотидов используют нормальные (то есть немодифицированные) олигонуклеотиды, возникает проблема их нестабильности из-за действия нуклеаз и недостаточного проникновения через мембрану. Для того чтобы антисмысловые олигонуклеотиды были способны ингибировать трансляцию, они должны достигнуть внутренности клетки неизмененными. Свойства, полезные для олигонуклеотидов, используемых для антисмыслового ингибирования, включают в себя: (1) устойчивость олигонуклеотидов к действию вне- и внутриклеточных ферментов; (2) способность проходить сквозь клеточную мембрану; и (3) способность гибридизоваться с ДНК или РНК мишенью (Agarwal, K.L. et al. , Nucleic Acid Res., 1979, 6, 3009; Agawal, S. et al., Proc Natl Acad Sci. USA. 1988, 85, 7079). Таким образом, необходимо получить аналоги полинуклеотидов, которые имеют указанные выше свойства, для использования в качестве антисмысловых или для использования в качестве праймеров или гибридизационных зондов.

Модифицированные полинуклеотиды уже были синтезированы, такие модификации полинуклеотидов включают в себя метилфосфонаты, фосфоротиоаты, различные амидаты и сахарные группировки видов нуклеиновых кислот. Эти замещения в скелете придают в некоторой степени усиленную стабильность, но имеют недостаток, заключающийся в получении хирального фосфора в составе связи, что приводит к образованию 2ⁿ диастереомеров, где n - число модифицированных диэфирных связей в олигомере. Наличие таких множественных диастереомеров значительно ослабляет способность модифицированного олигонуклеотида гибридизоваться с последовательностями-мишенями. Некоторые из таких замещений также оставляют способность поддерживать отрицательный заряд, а присутствие заряженных групп снижает способность этих соединений проникать сквозь клеточные мембраны. Существует много других недостатков, связанных с такими модификациями связей, зависящих от конкретной природы связи.

Были синтезированы некоторые аналоги олигонуклеотидов, содержащие модификацию сахара. Модификации сахаров (дезокси)рибозных нуклеиновых кислот, предназначенные для обеспечения того, что понимали под улучшенными структурами, особенно структурами, которые лучше проникают в клетки, включали в себя -ДНК, гомо-ДНК, морфолино- и тионуклеозиды и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК). Общая схема синтеза для получения таких аналогов должна была включать в себя первичную гидроксильную группу нуклеозида или его нуклеотида, связанную либо с полимерным носителем, либо с последовательность-специфичным 3'-нуклеотидом через атом фосфора в пятивалентной или трехвалентной степени окисления. Методы специфичного связывания представлены фосфитнотриэфирным (фосфорамидитным), фосфодиэфирным и гидрофосфонатным методами. Имеющиеся в продаже мономеры и связанные с полимерными носителями мономеры пригодны для таких методов в силу наличия защищенных оснований (G, A, C, T, U и других гетероциклов) совместно с защищенными атомами фосфора, что позволяет хранить их и предотвращает неспецифические реакции во время процесса связывания.

Виды нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные сахара, неионные скелеты или ациклические полиамиды (АПА), имеют, в некоторой степени, одно или несколько из следующих свойств, полезных для модификации гена: усиленная стабильность дуплекса (эффективность гибридизации), повышенная специфичность к мишеням, устойчивость к действию нуклеаз, улучшенное проникновение в клетку и содействие в важных терминирующих событиях нуклеиновых кислот (например активность РНазы H, каталитическое расщепление, остановка гибридизации и другие). Было также предложено использовать карбонатные диэфиры. Однако эти соединения являются высоко нестабильными, и такая карбонатно-диэфирная связь не поддерживает тэтраэдрическую конфигурацию, устанавливаемую фосфором в фосфодиэфире. Аналогично, карбаматные связи, являясь ахиральными, придают тригональную симметрию, и было показано, что поли dT, имеющий такую связь, не гибридизуется строго с dA (Coull, J.М. et al. Tetrahedron Letts., 1987, 28, 745; Stirchak, E.p. et al., J.Org.Chem., 1987, 52, 4202).

В более поздней литературе появляются сведения об ациклических аналогах cахаров (Augustyns, К.A. et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 2587-2593). Включение этих ациклических нуклеозидов в состав олигонуклеотидов влечет за собой пропуск в Tm в зависимости от числа линкеров, встроенных в эти олигомеры. Обнаружено, что эти олигонуклеотиды являются устойчивыми к действию ферментов и спариваются с основаниями комплементарной последовательности. Учитывая недостатки полинуклеотидов и известных аналогов полинуклеотидов, интерес представляет создание новых аналогов полинуклеотидов для использования в антисмысловом ингибировании и других методиках, применяющих олигомеры.

Такие попытки с модификацией как сахарных, так и скелетных компонентов имеют ряд недостатков при использовании в качестве терапевтических средств и в других методах. Следовательно, требуются более серьезные улучшения этих свойств, прежде чем станет возможным использование в качестве эффективных терапевтических, диагностических и исследовательских средств. Согласно этому, давно имеется необходимость в улучшении олигомерных аналогов олигомеров олигонуклеотидов как фармацевтических соединений.

Согласно настоящему изобретению предлагаются новые олигонуклеотиды и их структурные предшественники, более устойчивые к действию нуклеаз, обладающие повышенной стабильностью в физиологических условиях и которые могут быть нейтрально или положительно заряжены, что могло бы облегчить проникновение в клетку. Далее, новые олигонуклеотиды по изобретению обладают улучшенными гибридизационными свойствами по отношению к гибридизуемым нуклеиновым кислотам-мишеням.

Олигомеры по настоящему изобретению в общем характеризуются тем, что содержат серию встроенных линкеров или мономеров, подходящую для связывания гетероциклических оснований с нуклеиновой кислотой-мишенью последовательность-специфичным образом. Когда описываемые здесь встроенные линкеры находятся в составе олигомеров, они могут обладать большей силой, чем единичная водородная связь, способствуя таким образом образованию при связывании компетентной конформации.

Нуклеомономеры по настоящему изобретению в основном характеризуются как группировки или остатки, заменяющие фуранозное кольцо, которое имеется в природных нуклеотидах, аминокислотными или модифицированными аминоспиртовыми остатками. Примерные мономеры и олигомеры по изобретению показаны в формулах 1-41. Включение этих описанных здесь мономеров в состав олигонуклеотидов позволяет синтезировать соединения с улучшенными свойствами; эти улучшенные свойства включают в себя (1) возросшую липофильность в результате удаления заряда, имеющегося благодаря фосфодиэфирным связям (Dalge, J.М. et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 1805), и (2) устойчивость к разрушению ферментами, такими как нуклеазы. Олигомеры, содержащие эти мономеры, могут быть совершенно стабильны для гибридизации с последовательностями-мишенями и превосходят немодифицированные нуклеозидные остатки в одном или нескольких применениях.

Краткое содержание изобретения Согласно настоящему изобретению предлагаются различные новые аналоги олигонуклеотидов, имеющие одно или несколько свойств, которые обеспечивают превосходство интересующих нас соединений над традиционными олигонуклеотидами при использовании в методах, применяющих олигонуклеотиды. Соединения по изобретению являются аналогами олигонуклеотидов, в которых фуранозное кольцо, имеющееся в природных нуклеиновых кислотах, заменено на аминокислоту или модифицированный аминоспиртовой остаток. В некоторых реализациях новые соединения по изобретению, в частности, полезны для антисмыслового контроля экспрессии генов. Соединения по изобретению также могут быть использованы как зонды для гибридизации с нуклеиновыми кислотами или как праймеры.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены мономерные предшественники аналогов олигонуклеотидов по изобретению. Эти мономерные предшественники могут быть использованы для синтеза интересующих нас аналогов полинуклеотидов.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены препараты интересующих нас аналогов полинуклеотидов, которые созданы для лечения или профилактики болезненных состояний. В еще одном аспекте согласно данному изобретению предложены способы лечения или профилактики заболеваний, в частности вирусных инфекций и нарушений клеточного роста. Интересующие нас способы лечения заболеваний включают в себя стадию, на которой вводят эффективное количество интересующих нас аналогов полинуклеотидов для использования в качестве антисмысловых ингибиторов.

Краткое описание чертежей На фиг. 1-25 показаны последовательности химических реакций, применяемых для синтеза мономеров и олигонуклеотидов по изобретению. Конкретнее: На фиг. 1 показан синтез связанного с L-серинолом тиминового мономерного фосфорамидита с -CH₂-CO-связью между тимином и серинолом.

На фиг. 2 показан синтез связанного с L-серинолом тиминового мономерного фосфорамидита с -CH₂-CH₂-связью между тимином и серинолом.

На фиг. 3 и 4 показан синтез связанного с замещенным L-серинолом тиминового мономерного фосфорамидита с -CH₂-CO-связью между тимином и серинолом.

На фиг. 5 показан синтез T-T димера с межнуклеотидной связью из 5 атомов, имеющего гидроксиламин в середине межнуклеотидной связи, с -CH₂-CO-связью между тимином и серинолом.

На фиг. 6 показан синтез тиминового мономерного фосфорамидита, в котором тимин присоединен к N-этилгидроксиламину через -CH₂-CO-связь.

На фиг. 7 показан синтез связанного с L-серинолом тиминового мономерного фосфорамидита, в котором группа NH₂ L-серина соединена с 2-гидроксиацетильной группой, и гидрокси-функция блокирована группой DMT. Этот строительный блок использован для 2'-5' соединения. На этом чертеже также показан синтез тиминового мономера, в котором NH₂ группа L-серина соединена с 2'-гидроксиэтильной функцией.

На фиг. 8 показан синтез Т-Т димера, имеющего гидроксаматный скелет с 2'-5' связью. В этом димере один строительный блок состоит из L-аспарагиновой кислоты и тимина, а другой - из L-серина и тимина. Этот димер имеет также две дополнительных амидных связи в скелете.

На фиг. 9 показан синтез Т-Т димера, имеющего гидроксаматный скелет с 2'-5' связью. В этом димере один строительный блок состоит из L-аспарагиновой кислоты и тимина, а другой - из L-серина и тимина. В этом димере отсутствует амидная связь в скелете.

На фиг. 10 показан синтез связанного с L-серинол--аланином тиминового мономерного фосфорамидита, в котором -аланин связывает тимин и серинол.

На фиг. 11 показан синтез связанного с L-серинол-алкиламином тиминового мономерного фосфорамидита, в котором алкиламин связывает тимин и серинол.

На фиг. 12 показан синтез Т-Т димера, имеющего гидроксаматный скелет с 4'-5' связью. В этом случае димер состоит из двух единиц L-аспарагиновой кислоты и двух тиминовых единиц с ацетиловым линкером между тимином и аспарагиновой кислотой.

На фиг. 13 показан синтез Т-Т димера, имеющего гидроксаматный скелет с 4'-5' связью. В этом случае димер состоит из двух единиц L-аспарагиновой кислоты и двух тиминовых единиц с этиловым линкером между тимином и аспарагиновой кислотой.

На фиг. 14 показан синтез связанного с N-гидроксаминовой кислотой тиминового строительного блока.

На фиг. 15 показан синтез связанного с L-аспарагиновой кислотой тиминового строительного блока с N-гидроксиламиновым линкером между тимином и аспарагиновой кислотой.

На фиг. 16 показан синтез Т-Т димера, имеющего гидроксаматный скелет с 4'-5' связью. В этом случае группа карбоновой кислоты связана с тиминовым строительным блоком через N-гидроксиламиновый линкер.

На фиг. 17 показан синтез тимидинуксусной кислоты, замещенной N-гидроксиламинокислотным строительным блоком 150 и его аналогом 149. Эти мономерные строительные блоки полезны для получения нуклеиновой кислоты с гидроксаматными скелетами.

На фиг. 18 показан синтез тимидинуксусной кислоты, замещенной гидроксиламином, содержащим аминокислотные строительные блоки 157 и 158. Эти мономеры полезны для получения нуклеиновой кислоты, имеющей амидный скелет с гидроксиламиновой функциональностью.

На фиг. 19 показан синтез связанного с L-серинолом тимидинового строительного блока 166, имеющего гидроксиламиновую группировку между тимином и серинолом. Этот строительный блок полезен для получения нуклеиновой кислоты со связями 4'-5'.

На фиг. 20 показан синтез связанного с глутаминовой кислотой-глицином тимидинового мономера 174. Этот мономерный строительный блок полезен для получения нуклеиновой кислоты с амидными скелетами и связями 2'-5'.

На фиг. 21 показан синтез связанного с глицинол-глицином тимидинового строительного блока 181 и 182, имеющего гидроксиламиновую группировку между тимином и глицинолом. Эти строительные блоки полезны для получения нуклеиновой кислоты со связями 2'-5'.

На фиг. 22-24 показан синтез связанных с рибозной аминокислотой тимидиновых строительных блоков 191, 199 и 207. Эти строительные блоки полезны для получения олигонуклеотидов, имеющих рибозоамидный скелет.

На фиг. 25 показан твердофазный синтез олигонуклеотида 211, имеющего рибозоамидный скелет.

На фиг. 26 показан синтез 1-O-(4,4'-диметокси-тритил) -2- [амино(тиминилацетил)] -L-пропан-3-O-(N,N-диизопропил) --цианоэтилфосфорамидита.

На фиг. 27 показан синтез 1-O-(4,4'-диметокси-тритил)-2- [амино(тиминилацетил)]-D-пропан-3-O-(H,H-диизопропил) --цианоэтилфосфорамидита.

На фиг. 28 показан синтез 2-[(-(4,4'-диметокси-тритил) -O-ацетил)амино] -3- тиминил-L-пропан-1 -O-(N,N-диизопропил) --цианоэтилфосфорамидита.

На фиг. 29 показан синтез N-(тиминилацетил)-N-[[(2-изобутирил) окси] этил] -O-бензилгидроксиламина.

На фиг. 30 показан синтез (2R,4S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-2- [N₃-бензоил(тимин-1-ил)]метил-4-фталимидо-пирролидина.

Детальное описание конкретных воплощений Определения и аббревиатуры В настоящем изобретении использованы следующие ниже термины и подразумевается, что они определяют указанное ниже.

Используемый здесь термин "антисмысловая" терапия относится к введению или генерации in situ ДНК или РНК олигомеров или их аналогов, которые специфично связываются с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Это связывание может происходить путем традиционного комплементарного спаривания оснований либо с помощью другого механизма, например, в случае связывания ДНК-дуплексов, с помощью специфических взаимодействий в большой бороздке двойной спирали. В общем случае термин "антисмысловой" относится к ряду приемов, в основном используемых согласно данному описанию в уровне техники, и включает любую терапию, основывающуюся на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями. Эти приемы антисмыслового регулирования генов хорошо известны специалисту в области молекулярной биологии, описания антисмыслового регулирования генов приведены, например, в патенте США 5107065, патенте США 5166195, патенте США 5087617 и Crooke, Annual Review Pharmacology Toxicology 1992 32; 329-376.

Термины "олигомер" или "олигонуклеотид" применяются как взаимозаменимые и включают в себя встречающиеся в природе соединения, такие как РНК или ДНК, а также их синтетические аналоги, включая соединения по изобретению. Если не указано другое термины "олигомер" и "олигонуклеотид" относятся как к ДНК/РНК, так и к их синтетическим аналогам. Термин "олигомер" применяют к соединениям, содержащим два или большее число нуклеомономеров, ковалентно присоединенных друг к другу с помощью фосфодиэфирной связи или других заменяющих связей. Если не указано иное, термин "олигомер" не следует понимать как ограничивающий длину. Таким образом, олигомер может иметь всего лишь два ковалентно увязанных нуклеомономера (димер), либо быть значительно длиннее. Олигомеры могут быть связаны компетентно и, таким образом, образовывать пары с однонитевой или двунитевой последовательностями нуклеиновых кислот. Олигомеры (например димеры - гексамеры) также могут быть использованы в качестве синтонов для более длинных олигомеров, как описано ниже. Олигомеры могут содержать сайты, не являющиеся основаниями, и псевдонуклеозиды.

Олигомеры включают в себя олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, полидезоксирибонуклеотиды (содержащие 2'-дезокси-D-рибозу или ее модифицированные формы), то есть ДНК, полирибонуклеотиды (содержащие D-рибозу или ее модифицированные формы), то есть РНК, и любой другой тип полинуклеотидов, являющихся N-гликозидами или C-гликозидами пуриновых или пиримидиновых оснований или модифицированных пуриновых или пиримидиновых оснований.

Подразумевается, что олигомеры, как здесь используется этот термин, также включают в себя соединения, в которых соседние нуклеомономеры связаны через гидроксаматные связи. Элементы, обычно присутствующие в олигомерах, такие как фуранозное кольцо и/или фосфодиэфирная связь, могут быть заменены любым подходящим функционально эквивалентным элементом. Подразумевается, что термин "олигомер" включает в себя любую структуру, которая служит каркасом или поддержкой для оснований, причем этот каркас позволяет осуществлять связывание с нуклеиновыми кислотами-мишенями последовательность-зависимым образом. Традиционные известные олигомеры могут быть разделены на четыре группы, которые характеризуются как имеющие (1) связи в виде фосфодиэфиров или аналогов фосфодиэфиров (фосфоротиоатов, метил-фосфонатов и т.д.), (2) заменяющие связи, которые содержат нефосфорные изостеры (рибоацеталь, формацеталь, карбамат и т.д.), (3) морфолиновые остатки, карбоциклические остатки или другие фуранозные сахара, такие как арабиноза или гексоза, вместо рибозы или дезоксирибозы, (4) нуклеомономеры, связанные через амидные связи, или ациклические нуклеомономеры, связанные через любую подходящую заменяющую связь.

Термин "нуклеомономер", используемый здесь, относится к группировке, содержащей (1) основание, ковалентно связанное с (2) второй группировкой.

Нуклеомономеры включают в себя нуклеозиды, нуклеотиды или основания, присоединенные к аминоспирту. Нуклеомономеры могут быть связаны с образованием олигомеров, которые связывают мишени или комплементарные последовательности оснований нуклеиновых кислот последовательность-специфичным образом.

"Вторая группировка", как используется здесь, относится к соединению, соединенному с нуклеомономером, и включает в себя аминокислотную/аминоспиртовую группировку, обычно серинол, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, глицин, и те виды, которые содержат модификации аминокислотной группировки, например в которых один или большее число водородов заменено другой функциональностью (смотри формулы 24-41), или одна карбоновая кислота превращена в функцию спирта, аминов, тиолов, гидроксиламинов и т.п. Нуклеомономеры, как определено здесь, также включают в себя основания, связанные с аминокислотами или аминоспиртами и/или аналогами аминокислот/спиртов, имеющих свободную карбоксильную/гидроксильную группу и/или свободную аминогруппу и/или их защищенные формы.

Термин "нуклеозид", как используется здесь, относится к его аминокислотным и аминоспиртовым производным, как описано ниже, несущим пурин, пиримидин, или их аналоговым формам, как определено ниже, но в которых отсутствует связывающая группировка, такая как аналог фосфодиэфира или модифицированная межнуклеотидная связь. Под "5'" нуклеозидом подразумевают нуклеозид, обеспечивающий возможность связывания линкера по 5' углероду. "5'" конец линкера связывается с 5' нуклеозидом. "3'" конец линкера связывается с 3' положением следующего нуклеозида. Если присутствует модифицированный нуклеозид, который не включает именно 3' и/или 5' углерод, то для специалиста должно быть понятно, что эта "3'" и "5'" терминология для описания полярности нити используется по аналогии с ДНК и РНК.

Термин "нуклеозид", как использовано здесь, относится к основанию, ковалентно присоединенному к аналогу аминоспирта/аминокислоты и содержащему линкер между основанием и аминокислотой/аминоспиртом. Термин нуклеозид естественно включает рибонуклеозиды, дезоксирибонуклеозиды или любой другой нуклеозид, являющийся N-гликозидом или С-гликозидом основания.

Термин "нуклеотид", как использовано здесь, относится к нуклеозидам, имеющим фосфатную группу или аналог фосфата (группы с фосфором в той же степени окисления, как в фосфатной группе, например тиофосфат, амидат).

Термин "основание", как использовано здесь, относится к широкому ряду нуклеозидных оснований, включая пуриновые, пиримидиновые гетероциклы и аналоги гетероциклов и их таутомеры. Пурины включают в себя аденин, гуанин и ксантин, примером аналога пурина является 8-оксо-N₆-метиладенин и 7-деазаксантин. Пиримидины включают в себя урацил и цитозин и их аналоги, такие как 5-метилцитозин, 5-(1-пропинилурацил), 5-(1-пропинилцитозин), 5-метилурацил и 4,4-этанцитозин. Когда "основания" включены в подходящую молекулярную рамку считывания, например фосфодиэфирный скелет, они способны принимать участие в спаривании оснований, которое имеет место в двунитевой ДНК или других двунитевых нуклеиновых кислотах со сходными структурами. Основания также способны принимать участие в спаривании оснований в нуклеиновой кислоте с тройной спиралью.

Термин "модификация сахара", как использован здесь, относится к любому остатку аминокислоты или аминоспирта, кроме 2'-дезоксирибозы.

Термин "амино кислота/спирт", как использован здесь, относится к любым природным аминокислотам и спиртам, как "R'", так и "S'" изомерам.

Термин "нуклеозидные связи", как использован здесь, относится к связи, которая существует внутри мономера.

Термин "связь", как использован здесь, относится к группировке, которая используется для соединения основания с аминокислотой/аминоспиртом и их производными.

Термин "межнуклеотидные связи", как использован здесь, относится к фосфодиэфирной группировке (-O-Р(O)(O)O-) или любой другой функционально эквивалентной группировке, которая ковалентно связывает соседние нуклеомономеры.

Термин "заменяющие связи", как использован здесь, относится к любому аналогу нативной группы или любой подходящей группировке, которая ковалентно связывает соседние нуклеомономеры. Заменяющие связи включают в себя аналоги фосфодиэфиров, например, такие как фосфотиоаты и метилфосфонаты, и не содержащие фосфора связи, такие как амиды, гидроксаматы, гидроксиламин. Заменяющие связи включают в себя не содержащие фосфора связи (2',5' связи, 3',5' связи, 4',5' связи) по изобретению.

Термин "перекрестносшивающая группировка", как использован здесь, относится к группе или группировке в олигомере, которая образует ковалентную связь с нуклеиновой кислотой-мишенью. Перекрестносшивающая группировка включает в себя ковалентно сшивающие виды, которые ковалентно связывают олигомер с нуклеиновыми кислотами-мишенями либо спонтанно (например N⁴, N⁴-этаноцитозин) или с помощью фотоактивации (например псорален) и т. п.

Термин "блокирующие группы", как использован здесь, относится к заместителям, кроме H, которые ковалентно связаны с олигомерами или нуклеомономерами либо в качестве защитной группы, сочетающей группы для синтеза, OPO_3-2, либо другого традиционного конъюгата, такого как твердая подложка, метка, антитело, моноклональное антитело или его фрагмент и т.п. Не подразумевается, что "блокирующая группа", как использовано здесь, сконструирована только как защитная группа, согласно слэнговой терминологии, но подразумевается, что она также включает, например, сочетающие группы, такие как H-фосфонаты или фосфорамидиты.

Термин "защитная группа", как использован здесь, относится к любой группе, способной защитить О-атом, S-атом или N-атом, к которому она присоединена, от участия в реакции или связывании. Такие защитные группы для N-атомов на основной группировке в нуклеомономере и их введение хорошо известны из уровня техники. Частными примерами подходящих защитных групп являются: диизобутилформамидин, бензоил, силил и т.п. Подходящими защитными группами для O-атомов и S-атомов являются, например, DMT, ММТ, FMOC или сложные эфиры. "Защитные группы", как использовано здесь, включают в себя любую группу, способную предотвращать участие O-атома, S-атома или N-атома, к которому она присоединена, в реакции или связывании. Такие защитные группы для O-, S- или N- атомов в нуклеомономерах описаны и способы их введения традиционно известны из уровня техники. Защитные группы также включают в себя любую группу, способную предотвратить реакцию и связывание на карбоновых кислотах, тиолах и т.п.

Термин "сочетающая группа", как использован здесь, относится к любой группе, способной создавать связь или заменяющую связь между нуклеомономерами, такой как гидрофосфонат и фосфорамидит.

Термин "конъюгат" или "конъюгатная группировка", как использован здесь, относится к любой группе, присоединенной к олигомеру на терминальном конце или внутри самого олигомера. Конъюгаты включают в себя твердые подложки, такие как силикагель, стекло с контролируемыми порами и полистерен; метки, такие как флюоресцентные, хемилюминисцентные, радиоактивные атомы или молекулы, ферментные группы и репортерные группы; транспортные агенты для олигомеров, такие как поликатионы, сывороточные белки и гликопротеины и полимеры и т.п. Другие конъюгатные группировки включают в себя О-холестерин, полиэтиленгликоль (ПЭГ), аминокислоты, интеркаляторы, выводящие полинуклеотиды группировки, перекрестносшивающие функциональности, липиды, гидроксаматы, алкилирующие агенты и т.п.

Термин "синтон", как использован здесь, относится к структурной единице внутри аналога олигонуклеотида по изобретению.

Термин "трансфекция", как использован здесь, относится к любому способу, подходящему для усиленной доставки олигомеров в клетки.

Термин "субъект", как использован здесь, относится к растению или животному, включая млекопитающих, в частности человека.

Термин "производные" и мономерные составляющие их олигомеры включают в себя все, традиционно известные их уровни техники. Например, олигонуклеотиды могут быть ковалентно связаны с различными группировками, такими как интеркаляторы, вещества, взаимодействующие именно с малой бороздкой двойной спирали ДНК и другими произвольно выбранными конъюгатами, такими как метки (радиоактивные, флюоресцентные, ферментные и т.д.). Производные этих добавочных группировок могут быть (но не обязательно) получены через модифицированную скелетную связь как часть самой связи. Например, интеркаляторы, такие как акридин, могут быть связаны через -R-CH₂-, присоединенную через любой доступный -ОН или SH, например на концевом 5' положении РНК или ДНК, 2' положении РНК или ОН или SH, созданном в 5 положении пиримидинов, например вместо 5 метила цитозина, производное которого содержит -CH₂CH₂CH₂OH или -CH₂CH₂CH₂SH в 5 положении. Может быть присоединен широкий ряд заместителей, включая те, которые связываются традиционными связями. Согласно этому, указанные группировки ОН в олигомере формулы (1) могут быть заменены фосфонатными группами, защищенными стандартными защитными группами, или активированы для получения дополнительных связей с другими нуклеотидами, или могут быть связаны со сконъюгированным заместителем. 5'-концевой ОН традиционно является фосфорилированным; 2'-ОН или ОН заместители на 3'-конце также могут быть фосфорилированы. Также могут быть получены производные гидроксилов со стандартными защитными группами.

Термин "аналог фосфодиэфира", как использован здесь, относится как к аналогу традиционной фосфодиэфирной связи, так и к альтернативным связывающим группам. Эти альтернативные связывающие группы включают в себя, но не ограничены воплощениями, в которых O-P(О) заменен на P(O)S, P(O)NR₂, P(O)R, P(O)OR', где R является H или алкилом (1-7C) и R' является алкилом (1-7С). Не все аналоги фосфодиэфиров в одном и том же олигомере должны быть идентичными, единственным требованием является то, что по меньшей мере одна из этих связей является модифицированной межнуклеотидной связью, как здесь описано.

"Аналоговые" формы пуринов и пиримидинов - это формы, известные из уровня техники, многие из которых используются в качестве химиотерапевтических агентов. Примеры включают в себя (но не исчерпываются этим списком): 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N⁵-метиладенин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5- (карбоксигидроксиметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5- карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5- карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N₆- изопентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N₆-метиладенин, 7-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилгуанозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N₆-изопентениладенин, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота, оксибутоксозин, псевдоурацил, геозин, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин. Особенно предпочтительным аналогом является 5-метилцитозин (используемая здесь аббревиатура: Cme).

Термин "изостеричный", как использован здесь, относится к пространственным и ориентационным свойствам межнуклеозидной связи; фактом является то, что эти свойства являются настолько похожими на свойства нативной фосфодиэфирной связи, что модифицированный олигонуклеотид, содержащий изостерическую связь, будет заменять, замещать, имитировать и/или гибридизоваться с нативным олигонуклеотидом.

Термин "рибозоамид", как использован здесь, относится к межнуклеотидной связи, существующей между двумя нуклеооснованиями. Эта рибозоамидная межнуклеотидная связь содержит комбинацию рибоза/(2'-дезокси) и аминокислотной функциональностей.

В данном описании использованы различные аббревиатуры для функциональных групп и соединений. Эти аббревиатуры понятны специалисту в области органической химии, например "Ph" обозначает фенил, "Me"- метил, "(1-7С)" обозначает, что данная цепь содержит от 1 до 7 углеродов, и т.д.

Описание изобретения Согласно данному изобретению предложены новые аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированные аминокислотные/аминоспиртовые связи между основаниями и скелетами (фосфодиэфир, фосфоротиоаты и другие, как показано в табл. А), также называемые модифицированными нуклеотидными связями. Эти модификации или их функциональные эквиваленты заменяют сахарную группировку, которая лежит между скелетом и основаниями, на производные аминокислоты, например как показано в формуле 24. Согласно настоящему изобретению также предложены новые нуклеомономеры и способы их включения в состав олигомеров, содержащих эти нуклеомономеры.

Согласно данному изобретению предложены различные нуклеомономерные соединения, имеющие структуры формул 1-23.

Олигомеры по изобретению являются полимерами, содержащими одно или несколько интересующих нас мономерных соединений, соединенных так, чтобы обеспечить структурный аналог ДНК или РНК. Олигомеры по изобретению содержат два или большее число нуклеомономеров и могут содержать фактически любое число нуклеомономеров, хотя олигомеры, состоящие из 200 или меньшего числа нуклеомономеров, обычно легче синтезировать. Соединения формул 1-23 могут быть присоединены друг к другу через 4'-5' связи, 3'-5' связи и 2'-5' связи, как видно из формул 24-41.