Лечебно-профилактическая зубная паста

Лечебно-профилактическая зубная паста

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии. Зубная паста содержит продукты метаболизма бактерий Bacillus subtilis, носитель, консервант, отдушку, пенообразующий и подслащивающий компоненты, при этом в качестве продуктов метаболизма бактерий используют биомассу бактерий рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ВКПМ 7092 или штамма Bacillus subtilis ВКПМ 7048 в споровой форме, выращенную на агаре и содержащую этот агар с титром не менее 10⁶ спор/г, в качестве пенообразующего компонента используют продукт щелочного гидролиза яичного меланжа, в качестве консерванта - шиконин, а в качестве отдушки - фруктовую эссенцию, а в качестве носителя - мел или смесь мела и геля полиэтиленоксида. Зубная паста обладает противомикробным и противовирусным действием. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к косметологии и медицине, а именно к стоматологии, и касается лечебно-профилактических препаратов, используемых для ухода за зубами и полостью рта.

Полость рта является благоприятной средой обитания для многих видов микробов; в ней имеются достаточное количество питательных веществ, оптимальная температура, слабощелочная реакция. В полости рта насчитывается около 160 видов микроорганизмов. В ней находятся естественные обитатели (Lactobacillus acidophilus, Treponema macrodentium), диплококки, стрептококки, микрококки, Entamoeba gingivalus и многие другие. Кроме того, в полости рта обнаруживают посторонние или заносные микробы, которые поступают из внешней среды вместе с пищей, водой и воздухом.

На слизистой оболочке рта встречаются патогенные и условно-патогенные виды (стрептококки, стафилококки, бактероиды, коринебактерии дифтерии, дифтероиды, боррелии, фузобактерии, актиномицеты амебы и трихомонады). Большое количество микробов обнаруживают у шейки зубов, в промежутках между зубами.

В развитии заболеваний органов полости рта и челюстей принимают участие непатогенные, условно-патогенные и патогенные бактерии, вирусы, грибы и простейшие. К основным заболеваниям полости рта относят кариес, периодонтит, гингивит, пародонтоз, стоматит, герпес (обусловлен вирусом простого герпеса) и различные аденовирусные инфекции.

Известна зубная паста, содержащая (мас.%): мел (36,0 - 40,0), натрийкарбоксиметилцеллюлозу (1,3 - 1,5), глицерин (20,0 - 25,0), лаурилсульфат натрия (1,0 - 1,5), щелочную протеазу из Bacillus licheniformis (0,5 - 2,0), хлористый калий (0,3 - 0,5), параформ (2,0 - 2,5), парфюмерное масло (2,0 - 2,5), отдушку (1,0 - 1,5) и воду - остальное (авторское свидетельство СССР N 1082431, МПК³ A 61 K 7/16, опубл. 30.03.84 г.). Хлористый калий является стабилизатором фермента, а параформ и лаурилсульфат используют в качестве консервантов.

Однако такая зубная паста имеет недостаточное очищающее и противовоспалительное действие, что связано, по-видимому, с использованием нативного водорастворимого фермента, который быстро инактивируется в полости рта. Средство имеет недостаточное профилактическое действие, т.к. не обладает противовирусным эффектом и достаточным антимикробным действием. Кроме того, содержащиеся в составе препарата компоненты (лаурилсульфат натрия и параформ) могут вызвать у некоторой категории пользователей зубной пасты аллергию и воспалительные процессы на слизистой полости рта. Причем такой химически синтезированный консервант, как параформ (формалин), оказывает вредное влияние на кожу человека и обладает явно выраженными мутагенными свойствами. Параформ хорошо проникает через слизистые оболочки полости рта и при длительном применении как гигиеническое средство (зубная паста) может вызвать эритерму слизистой оболочки и даже отек. Указанное вещество при длительном применении обладает токсичностью и канцерогенностью, вызывает аллергию (Debrue B. STP Pharma, 1989, - v. 5, Hors. Ser. - p. 83 - 87).

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является зубная паста, содержащая ферментный препарат, носитель, лаурилсульфат натрия, отдушку и воду. В качестве ферментного препарата паста содержит комплекс протеиназ из Bacillus subtilis, в качестве носителя - гель полиэтиленгликоля и дополнительно бензоат натрия, сахарин, фосфатный буфер и краситель (Патент РФ N 2060030, МПК⁶ A 61 K 7/16, опубл. 20.05.96 г.), при следующем соотношении компонентов, мас.%: Комплекс протеиназ из Bacillus subtilis - 2,5 - 5,0 Гель полиэтиленгликоля - 85,0 - 90,0 Лаурилсульфат натрия - 1,0 - 2,0 Бензоат натрия - 1,0 - 2,0 Фосфатный буфер - 0,5 - 1,0 Сахарин - 0,1 - 0,2 Отдушка - 1,0 - 2,0 Краситель - 0,05 - 0,1 Вода - Остальное Зубная паста оказывает очищающий и противовоспалительный эффект.

Однако такое средство имеет недостаточное профилактическое действие, т. к. не обладает противовирусным эффектом и достаточным противомикробным действием. Кроме того, оно содержит в своем составе натрия лаурилсульфат, который как химической компонент синтетического происхождения нежелателен в составе для ухода за полостью рта человека. Используемый в средстве лаурилсульфат натрия необратимо блокирует работу ферментов слизистой оболочки полости рта, меняя их строение ("выворачивая" молекулу), и, таким образом, нарушает в некоторой степени нормальное функционирование клеточной системы слизистой полости рта, является промотором аллергических реакций.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такой лечебно-профилактической зубной пасты, которая обладала бы как противомикробным, так и противовирусным действием на основе природных биологически активных компонентов.

Указанная задача решается тем, что в зубной пасте, содержащей продукты метаболизма бактерий Bacillus subtilis, носитель, консервант, отдушку, пенообразующий и подслащивающий компоненты, согласно изобретению в качестве продуктов метаболизма бактерий Bacillus subtilis используют биомассу бактерий рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ВКПМ 7092 или штамма Bacillus subtilis ВКПМ 7048 в споровой форме, выращенную на агаре и содержащую этот агар, с титром не менее 10⁶ спор/г при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%: Биомасса бактерий Bac.subtilis штаммов ВКПМ 7092 или ВКПМ 7048, приготовленная на агаре и содержащая этот агар, с титром не мене 10⁶ спор/г - 10,0 - 50,0 Отдушка - 0,1 - 1,0 Пенообразующий компонент - 0,5 - 4,0 Консервант - 0,1 - 2,0 Подслащивающий компонент - 0,05 - 0,5 Носитель - Остальное до 100% В качестве пенообразующего компонента используют продукт щелочного гидролиза яичного меланжа, в качестве консерванта - шиконин, в качестве отдушки - фруктовую эссенцию, а в качестве носителя - мел или смесь мела и геля полиэтиленоксида в соотношении не менее 1:1, или гель полиэтиленоксида.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7048 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7048 от 31.05.95 г. Штамм получен из природного изолята селекционным путем. Штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибкового роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: трихофитов, микроспориумов, эпидермофитонов, кандида и других грибков.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7092 (pBMB105) получен путем трансформации штамма B. subtilis ВКПМ В-7048 рекомбинантной плазмидой ДНК pBMB105, содержащий ген -2-интерферона. Полученный штамм депонирован во всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7092. Плазмида pBMB5 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген -2-интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид -амилазы B. amyloliquefaciens для секреции интерферона в культуральную среду, а также несущую устойчивость к канамицину.

Пенообразующий компонент получают путем щелочного гидролиза яичного меланжа. Щелочной гидролиз проводят при соотношении яичного меланжа и щелочи не более 40:1 (патент РФ N 2044539, МПК⁶ A 61 K 7/50, опубл. 27.09.95 г.).

Шиконин (консервант) получают экстракцией корней воробейника краснокорневого. Шиконин обладает также противоопухолевыми и противовоспалительными свойствами, а также используется в косметике как краситель (М.М. Козыренко, В.П. Булгаков и др. Биосинтез производных шиконина в каллусной культуре // Растительные ресурсы. - М., 1991, вып. 4, - с. 78-90).

Гель полиэтиленоксида (ПЭО) является водорастворимым полимером и обеспечивает удобство приготовления и пользования средством: создает объемную структуру препарату, способствует смягчению поверхности слизистой оболочки. Гель полиэтиленоксида содержит 1-2% полиэтиленоксида и остальное - вода, упакованная в структуре данного полимера после облучения раствора, например, ускоренными электронами с образованием геля (ТУ 9154-004-11821987-93).

Пример 1. Технология приготовления зубной пасты Методика культивирования бактерий рода Bacillus subtilis для получения бактериальной биомассы, используемой в зубной пасте. Для получения биомассы спор бактерий культивируют штамм бактерий B.subtilis ВКПМ В-7092 или B. subtilis ВКПМ В-7048 на плотной питательной среде следующего состава: Агар - агар - 20 г/л Пептон - 12 г/л Дрожжевой экстракт - 5 г/л NaCl - 5 г/л Вода - До 1 л На 1 литр агаризованной среды требуется 15-20 мл бактерий одного вида с титром (10⁶ - 10⁸) кл/мл. Питательную среду формируют в емкостях в виде слоев, на которые наносят посевные дозы каждого указанного вида бактерий рода Bacillus. Культивирование бактерий осуществляют в термостате при температуре +(34-37)^oC в течение 20-24 часов. Далее емкость переносят в термостат с температурой +(6-10)^oC и выдерживают при этой температуре в течение 1-2 суток до образования спор бактерий. При указанном способе культивирования может быть получена биомасса с титром спор (3-10)10¹⁰ спор/г.

Далее полученную биомассу бактерий смешивают в реакторе с гелем полиэтиленоксида или гелем полиэтиленоксида и мелом, взятых в соотношении 1:1, отдушкой, пенообразующим компонентом, консервантом, подслащивающим компонентом и носителем при следующем соотношении компонентов, мас.%: Биомасса бактерий Bac. subtilis штаммов ВКПМ-7092 или ВКПМ 7048, приготовленная на агаре и содержащая этот агар, с титром не менее 10⁶ спор/г - 10,0 - 50,0 Отдушка - 0,1 - 1,0 Пенообразующий компонент - 0,5 - 4,0 Консервант - 0,1 - 2,0 Подслащивающий компонент - 0,05 - 0,5 Носитель - Остальное до 100% Ниже приведены примеры (2-5) составов зубной пасты (мас.%).

Пример 2.

Биомасса бактерий Bac. subtilis штамма ВКПМ-7092, приготовленная на агаре и содержащая этот агар с титром не менее 10⁶ спор/г - 10,0 Фруктовая эссенция - 0,1 Продукт щелочного гидролиза яичного меланжа - 0,5 Шиконин - 0,1 Подслащивающий компонент - 0,05 Мел - Остальное до 100% Пример 3.

Биомасса бактерий Bac. subtilis штамма ВКПМ-7048, приготовленная на агаре и содержащая этот агар с титром не менее 10⁶ спор/г - 20,0 Фруктовая эссенция - 0,5 Продукт щелочного гидролиза яичного меланжа - 2,0 Шиконин - 1,0 Подслащивающий компонент - 0,1 Смесь мела и геля полиэтиленоксида в соотношении 1:1 - Остальное до 100% Пример 4.

Биомасса бактерий Bac. subtilis штамма ВКПМ-7048, приготовленная на агаре и содержащая этот агар с титром не менее 10⁶ спор/г - 40,0 Фруктовая эссенция - 0,7 Продукт щелочного гидролиза яичного меланжа - 3,0 Шиконин - 1,5 Подслащивающий компонент - 0,3 Смесь мела и геля полиэтиленоксида в соотношении 2:1 - Остальное до 100% Пример 5.

Биомасса бактерий Bac. subtilis штамма ВКПМ-7092, приготовленная на агаре и содержащая этот агар с титром не менее 10⁶ спор/г - 50,0 Фруктовая эссенция - 1,0 Продукт щелочного гидролиза яичного меланжа - 4,0 Шиконин - 2,0 Подслащивающий компонент - 0,5 Гель полиэтиленоксида - Остальное до 100% Пример 6. Данные по хранению зубной пасты на основе биомассы спор бактерий Bacillus subtilis Для установления срока годности и условий хранения препарата проведены соответствующие исследования.

Из таблицы следует, что в течение 12 месяцев хранения зубной пасты при температуре +24^oC биологическая активность препарата практически не изменилась, что подтверждает его высокую термостабильность.

Пример 7. Исследование антивирусной активности зубной пасты, содержащей B. subtilis ВКПМ В-7092 Для исследования антивирусной активности образцов препарата готовят питательную среду следующего состава: Пептон - 12 г/л Дрожжевой экстракт - 5 г/л NaCl - 5 г/л Вода - До 1 л Канамицин - 50 мг/л Далее 1 г пасты смешивают с 9 мл физиологического раствора и прогревают при температуре 80^oC 15 минут. Затем берут 1 мл полученной смеси и вносят в колбу емкостью 1 л, содержащую выше приведенную питательную среду в количестве 100 мл. Колбу помещают на шейкерный аппарат и выращивают клетки B. subtilis при скорости вращения 105 об/мин до завершения процесса спорования.

Противовирусную активность препарата, содержащего штамм B. subtilis ВКПМ В-7092, определяют по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (ВВС) на культуре клеток Л-68.

ВВС предварительно пассируют на куриных эмбрионах по ТУ 42-14-99-77, проводят не менее 3-х пассажей при заражающей дозе 100-1000 ТЦД₅₀/0,1 мл. Инфекционная активность материала должна составлять 110⁶-110⁷ ТЦД₅₀/мл. Монослой клеток Л-68 выращивают на матрасе вместимостью 1000 мл в присутствии ростовой среды (среда Игла МЕМ с двойным набором ингредиента по ФС 42-7ВС-90 - 90%, сыворотка плодов коровы по ФС 42-7ВС-90 - 10%) с антибиотиками (канамицин 100 тыс. Ед/мл), после чего клетки снимают со стекла, суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают их количество в счетной камере Горяева. После этого клеточную взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс. кл/мл. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл клеточной взвеси и через 2-3 суток инкубации при 37^oC получают монослойную культуру.

После сформирования монослоя отсасывают ростовую среду, в первую лунку вносят 20 мкл образца стерильного фильтрата клеток штамма ВКПМ В-7092, полученного как описано выше, и 180 мкл поддерживающей среды; после осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносят во вторую лунку, смешивают со 100 мкл поддерживающей среды и т.д. Клетки выдерживают 24 ч при 37^oC и после этого в каждую лунку вносят 100 тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение в половине проб, вируса ВВС и выдерживают при 37^oC 24-48 ч. Через 1 сутки проводят первый учет, через 2 суток - второй. Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью референс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона, и выражают в международных единицах (МЕ).

Все исследуемые образцы обладают антивирусной активностью 310⁵ - 510⁵ МЕ/л.

Пример 8. Исследование антагонистической активности зубной пасты, содержащей бактерии штаммов B. subtilis ВКПМ-7048 и ВКПМ В-7092 Полученная зубная паста исследуется на антагонистическую активность в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяют методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-культур используют Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Staphylococous aureus, Candida albicans, E. coli и др. Используемые тест-микробы должны удовлетворять следующим требованиям: находиться в S-форме, иметь типичные морфологические и ферментативные свойства.

Используемые штаммы тест-микробов давали положительную кератоконьюнктивальную пробу на морских свинках.

Тест-штаммы стафилококков образовывали зону гемолиза размером 3-5 мм вокруг своих колоний через 18-20 часов роста на кровяном агаре, коагулировали плазму крови кролика в течение 2-х часов, вызывали некроз в течение 48-72 часов при внутрикожном введении кролику 200 млн. микробных клеток суточной культуры в 0,2 мл физиологического раствора.

Исследование антагонистической активности зубной пасты, содержащей штамм B. subtilis ВКПМ В-7048 или ВКПМ В-7092, производят на плотной среде Гаузе N 2.

Зубная паста, содержащая штамм B. subtilis ВКПМ В-7048 или ВКПМ В-7092, характеризуется следующими показателями зон задержки роста тест-культуры, мм: Shigella sonnei - 5-7 Salmonella typhimarium - 6-8 Staphylococcus aureus - 13-15 Candida albicans - 15-20 E. coli - 5-7 Таким образом, исследуемая зубная паста, содержащая бактерии B. subtilis, обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностью за счет наличия антагонистической активности спор бактерий рода Bacillus и действия альфа-2-интерферона, содержащегося в биомассе. Препарат применяют для профилактики дисбактериозов полости рта различной природы, стрептококковых и стафилококковых инфекций, везикулярного стоматита, простого герпеса.

Биомасса бактерий, продукты метаболизма этих бактерий, включающие рекомбинантный альфа-2 интерферон, используемые в препарате, отличаются высокой устойчивостью к слюне и ферментам полости рта.

Через слизистую полости рта интерферон попадает в кровь. При этом повышается фагоцитарная активность лейкоцитов крови, повышается иммунный статус организма и устойчивость к различным видам вирусных (герпес и аденовирусные инфекции) и других заболеваний.

Зубной пастой пользуются не реже 2-х раз в день.

Промышленная применимость. Предлагаемая зубная паста может быть приготовлена как в условиях крупных косметических фарик, так и в цехах мелких фирм, имеющих соответственное оборудование и условия для организации производства.

Формула изобретения

Лечебно-профилактическая зубная паста, содержащая продукты метаболизма бактерий Bacillus subtilis, носитель, консервант, отдушку, пенообразующий и подсушивающий компоненты, отличающаяся тем, что в качестве продуктов метаболизма бактерий Bacillus subtilis используют биомассу бактерий рекомбинантного штамма Bacillus subtilis ВКПМ 7092 или штамма Bacillus subtilis ВПКМ 7048 в споровой форме, выращенную на агаре и содержащую этот агар, с титром не менее 10⁶ спор/г при следующем количественном соотношении компонентов, мас.%: Биомасса бактерий Bac. Subtilis штаммов ВПКМ-7092 или ВКПМ 7048, приготовленная на агаре и содержащая этот агар, с титром не менее 10⁶ спор/г - 10,0 - 50,0 Отдушка - 0,1 - 1,0 Пенообразующий компонент - 0,5 - 4,0 Консервант - 0,1 - 2,0 Подслащивающий компонент - 0,05 - 0,5 Носитель - Остальное до 100% 2. Лечебно-профилактическая зубная паста по п.1, отличающаяся тем, что в качестве пенообразующего компонента используют продукт щелочного гидролиза яичного меланжа, в качестве консерванта - шиконин, в качестве отдушки - фруктовую эссенцию, а в качестве носителя - мел, или смесь мела и геля полиэтиленоксида в соотношении не менее 1:1, или гель полиэтиленоксида.

РИСУНКИ

Рисунок 1