Ингибитор пролиферации стволовых клеток и его использование

Ингибитор пролиферации стволовых клеток и его использование

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к использованию ингибиторов пролиферации стволовых клеток. В описании раскрываются способы выделения и использования факторов белковой природы, ингибирующих стволовые клетки, с целью регуляции аномального цикла стволовых клеток, а также для ускорения восстановления клеток периферической крови после химиотерапии. Кроме того, в описании и формуле изобретения раскрываются ингибиторы пролиферации стволовых клеток. Сущность изобретения заключается также в разработке способов лечения и создании фармацевтических композиций на основе этого ингибитора. Техническим результатом данного изобретения является расширение арсенала ингибиторов пролиферации стволовых клеток для использования в лечении онкологических заболеваний. 19 с. и 12 з.п. ф-лы, 7 табл., 15 ил.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к использованию ингибиторов пролиферации стволовых клеток для лечения человека и животных при аутоиммунных заболеваниях, при старении, раке, пациентов, имеющих миелодисплазию, предлейкозное состояние, лейкоз, псориаз или другие заболевания, включающие гиперпролиферативные состояния. Настоящее изобретение относится к способу лечения человека и животных либо в преддверии, либо после лечения химиотерапевтическими средствами или другими агентами, которые нарушают цикл развития стволовых клеток, либо в случае радиационного воздействия. И наконец, настоящее изобретение относится к способу совершенствования поддержания и роста культур стволовых клеток для использования их в процедурах ауто- и аллотрансплантации, а также в технике генного переноса.

Предпосылки создания изобретения Большинство клеток на конечной стадии систем обновления являются короткоживущими и должны постоянно замещаться новыми в течение всей жизни. Так, например, клетки крови происходят из самообновляющейся популяции мультипотетных гемопоэтических стволовых клеток [ГСК (HSC)]. В связи с тем, что гемопоэтические стволовые клетки необходимы для развития всех зрелых клеток гемопоэтической и иммунной систем, их выживание существенно для установления полностью функционирующей системы защиты хозяина у индивидуумов, подвергавшихся лечению химиотерапевтическими и другими средствами.

Продукция гемопоэтических клеток регулируется множеством факторов, стимулирующих рост и дифференциацию гемопоэтических клеток, некоторые из которых, например эритропоэтин и Г-КСФ (колониестимулирующий фактор), используются в настоящее время в клинической практике. Однако часть контролирующей системы, которая еще недостаточно хорошо изучена, представляет собой механизм регуляции по типу обратной связи, который приводит к образованию отрицательной ветви регуляторного процесса (Eaves et al., Blood 78:110-117, 1991).

Ранние исследования Лорда с соавт. выявили наличие растворимого белкового фактора в нормальных экстрактах мышиного и свиного костного мозга, которые обладают способностью к обратимому ингибированию цикла ГСК (Lord et al., Br. J. Haem. 34:441-446, 1976). Эта ингибирующая активность (молекулярная масса 50-100 кДа) была обозначена как ингибитор стволовых клеток [ИСК (SCI)] .

Очистку этого фактора из первичных источников не удалось провести до конца в связи с теми трудностями, которые возникают при исследованиях in vivo, требующих большого количества облученных мышей. Пытаясь преодолеть эти трудности, Прагнелл с сотр. (Pragnell et al.) разработали тест in vitro для простых гемопоэтических клеток [КОЕ-A (колониеобразующая клетка)] и проводили скрининг клеточных линий по наличию ингибирующей активности.

Поскольку в предшествующих исследованиях было показано, что макрофаги представляют собой возможный источник ИСК (Lord et al., Blood Cells 6:581-593, 1980), была отобрана клеточная линия макрофагов мышей J774.2 (Graham et al. , Nature 344:442-444, 1990). Стандартизованная среда из этой клеточной линии была использована для очистки, при этом был выделен ингибирующий пептид, который, как было показано, идентичен ранее описанному цитокин протеину 1-альфа, обнаруженному в макрофагах при воспалении [МВП (MIP)-1-альфа] . МВП-1-альфа был выделен из клеточной линии, но не из первичного материала. При этом, в то время как Грэхем с соавт. (Graham et al.) обнаружили, что антитела к МВП-1-альфа подавляют активность неочищенного экстракта из костного мозга, другие исследователи показали важность иных ингибиторов активности. Так, например, Грэхем с соавт. (Graham et al., J. Exp. Med., 178:925-32, 1993) предположили, что ФРТ (TGF ) (ростовой фактор Т-клеток-бета), а не МВП-1-альфа представляет собой первичный ингибитор гемопоэтических стволовых клеток. Более того, Иве с соавт. (Eaves et al., PNAS 90: 12015-19, 1993) предположили, что и МВП-1-альфа и ФРТ присутствуют в субоптимальных количествах в норме в костном мозге, а для ингибирования требуется синергическое взаимодействие этих двух факторов.

Ряд исследователей описали также другие факторы, ингибирующие стволовые клетки. Фриндель с соавт. (Frindel et al.) выделили тетрапептид из экстрактов костного мозга зародыша теленка и печени, которые содержали ингибирующие активности в отношении стволовых клеток (Lenfant et al., PNAS 86:779-782, 1989). Пауковитц с соавт. (Paukovitz et al., Cancer Res. 50:328-332, 1990) охарактеризовали пентапептид, который в своей мономерной форме является ингибитором, а в димерной форме - стимулятором циклического развития стволовых клеток. Были названы также другие факторы, которые обладают ингибирующей активностью в различных системах in vitro (Wright and Pragnell in Bailliere's Clinical Haematology, v. 5, pp. 723-739, 1992 (Bailliere Tinadall, Paris)).

К настоящему времени ни один из этих факторов не используется в клинической практике. Однако существует насущная потребность в эффективных ингибиторах стволовых клеток. Основной токсический эффект, сопровождающий химиотерапию или радиотерапию, выражается в разрушении нормальных пролиферирующих клеток, что может приводить к развитию супрессии костного мозга или к проявлению токсического воздействия на желудочно-кишечный тракт. При этом считается, что эффективный ингибитор стволовых клеток будет защищать эти клетки и позволит оптимизировать режим терапевтического воздействия. Поскольку доказана необходимость в различных стимулирующих цитокинах (т.е. Г-КСФ, ГМ-КСФ, эритропоэтин, ИЛ-II), определяемая той или иной клинической ситуацией, представляется очевидным, что для удовлетворения различающихся клинических запросов потребуется множество ингибирующих факторов.

I. Химиотерапия и радиотерапия рака Продуктивное исследование стимулирующих ростовых факторов привело в итоге к клиническому применению множества таких факторов (эритропоэтина, Г-КСФ и др.). В результате использования этих факторов снижались как летальность, так и уровень заболеваемости, связанной с химиотерапией и лучевой терапией. Дополнительные клинические плюсы, которые получают пациенты, подвергающиеся химио- или лучевой терапии, могут быть лучшим образом продемонстрированы с помощью альтернативной стратегии блокирования поступления стволовых клеток в клеточный цикл, защищая таким образом их от побочных токсических эффектов.

II. Трансплантация костного мозга Трансплантация костного мозга (ТКМ) представляет собой полезный в случае большого числа гематологических, аутоиммунных и злокачественных заболеваний способ лечения. В настоящее время используют ex vivo манипуляции с клетками для получения из первоначальных стволовых клеток популяцию, пригодную для трансплантации. Для оптимизации этого процесса требуется: (1) достаточное количество стволовых клеток, способных поддерживать длительный процесс восстановления гемопоэза; (2) снижение числа Т-тимфоцитов, индуцирующих болезнь "трансплантат против хозяина" и (3) отсутствие остаточных малигнизирующих клеток. Описываемая процедура может быть оптимизирована посредством включения ингибитора(ов) стволовых клеток в среду для роста ex vivo.

Эффективность очищения клеток костного мозга цитотоксическими средствами с целью удаления остаточного количества злокачественных клеток ограничена в связи с токсичностью этих соединений для нормальных гемопоэтических клеток и особенно для стволовых клеток, имеется потребность в эффективной защите нормальных клеток в процессе их очистки; такой защиты можно достигнуть, отобрав стволовые клетки из цикла для обработки эффективным ингибитором.

III. Сбор периферических стволовых клеток Использование стволовых клеток периферической крови [СКПК (PBSC)] для аутологичной трансплантации дает множество существенных преимуществ в сравнении с костным мозгом. У пациентов, которые в связи с развитием опухоли или проведением предшествующей радиотерапии, не имеют подходящих сайтов для отбора костного мозга, могут быть отобраны СКПК. Использование стволовых клеток крови устраняет необходимость проведения общей анестезии и хирургического вмешательства у пациентов, которые не в состоянии хорошо перенести такую процедуру. Практикуемая для сбора клеток крови технология афереза представляется достаточно эффективным способом, который широко используется в большинстве крупных медицинских центров. Основное ограничение этого метода связано с низкой частотой стволовых клеток в периферической крови при гомеостазе, в норме и высокая их частота в циклической стадии, наступающей после мобилизирующих процедур с применением лекарственных или ростовых факторов (таких, как циклофосфамид, Г-КСФ, фактор стволовых клеток). Эффективный ингибитор стволовых клеток был бы полезен для возвращения таких клеток в стадию покоя, что предотвратило бы таким образом снижение их количества в связи с дифференцировкой.

IV. Лечение гиперпролиферативных заболеваний Существует большое число заболеваний, для которых характерно наличие гиперпролиферативной стадии, в ходе которой разрегулированные стволовые клетки могут привести к избыточной продукции клеток конечной стадии. Такие заболевания, в развитии которых наблюдаются указанные состояния, включают, не ограничиваясь ими, псориаз, при котором имеет место перепроизводство эпидермических клеток, и предраковые состояния желудочно-кишечного тракта, для которых характерно появление кишечных полипов. Для лечения таких состояний может быть полезен ингибитор стволовых клеток.

V. Перенос генов Возможность переноса генетической информации в гемопоэтические клетки в настоящее время широко используется в клинических условиях. Костный мозг представляет собой весьма важную мишень для генной терапии в связи с облегченностью доступа к нему, с наличием обширного опыта работы с этой тканью и лечения ее ex vivo, а также как следствие способности клеток крови проникать в ткани.

Кроме того, при введении функционирующего гена в ранние стволовые клетки костного мозга гемопоэтической системы человека возможна коррекция ряда генетических дефектов человека.

Имеется несколько ограничений возможности введения генов в гемопоэтические клетки человека с использованием либо вектора ретровирусной природы, либо физической техники генного переноса: (1) низкая частота стволовых клеток в гемопоэтических тканях требует развития высокоэффективной техники генного переноса; (2) показано, что клетки, более быстро вступающие в цикл, обладают большей чувствительностью к векторной инфекции, однако повышение частоты инфекции посредством стимуляции пролиферации стволовых клеток с помощью ростовых факторов, как было выявлено, имеет негативный эффект на длительную генную экспрессию, поскольку клетки, содержащие трансгены, вступают необратимо в вынужденную дифференцировку, теряя при этом способность к самообновлению. Острота этих проблем снижается при использовании ингибитора стволовых клеток, который препятствует прохождению процесса дифференцировки и в результате этого потере способности к самообновлению.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к ингибитору стволовых клеток, который отличается следующими свойствами: а) удельная активность (ИК₅₀) меньше или равна 20 нг/мл в тесте с колониеобразующими клетками селезенки мышей (КОЕ-S) (см. пример 4); б) молекулярная масса больше 10000 и меньше 100000 дальтонов (на основании ультрафильтрации); в) активность чувствительна к действию трипсина; г) более гидрофобен, чем МВП-1 или ФРТ и может быть выделен с помощью хроматографии с обращением фаз (см. пример 12); д) биологическая активность сохраняется при нагревании в водном растворе в течение одного часа при 37^oC, 55^oC или 75^oC; е) биологическая активность сохраняется при осаждении раствором 1% соляной кислоты в ацетоне.

Предмет настоящего изобретения характеризуется, отличаясь этим от других кандидатов на роль ингибиторов стволовых клеток (т.е. МВП1 , ФРТ и различные олигопептиды), способностью достигать ингибирования в исследованиях in vitro после короткого прединкубационного периода (см. пример 5).

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим ИНПРОЛ (INPROL), для лечения различных заболеваний.

Настоящее изобретение относится к способу лечения пациентов, в отношении которых ожидается воздействие агентов, способных убить или повредить стволовые клетки. При этом данный способ заключается во введении такому пациенту эффективного количества композиции, содержащей ингибитор стволовых клеток. Защищаемые таким образом стволовые клетки могут представлять собой гемопоэтические стволовые клетки, обычно присутствующие и делящиеся в костном мозге. Альтернативно, стволовые клетки могут быть эпителиальной природы, которые локализованы, например, в кишечнике или в скальпе, или на других участках тела, или это могут быть половые клетки, расположенные в репродуктивных органах. Способ настоящего изобретения может быть по желанию применен на человеке или на животном, поскольку способ лечения животных также входит в рамки настоящего изобретения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу защиты и восстановления гемопоэтической, иммунной или другой систем, включающих стволовые клетки, у пациента, подвергающегося химиотерапии, который включает введение упомянутому пациенту эффективного количества ИНПРОЛа.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к методу адъюнктивного лечения рака, включая твердые опухоли, посредством введения пациенту, имеющему рак, эффективного количества ИНПРОЛа для защиты стволовых клеток костного мозга, желудочно-кишечного тракта или других органов от токсического воздействия химиотерапии или лучевой терапии.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к лечению лейкоза, который включает обработку клеток костного мозга, несущих пролиферирующие лейкозные клетки, эффективным количеством ИНПРОЛа с целью ингибирования пролиферации нормальных стволовых клеток и, кроме того, обработку костного мозга цитотоксическим средством для разрушения лейкозных клеток. Этот метод может быть усилен за счет последующего введения в костный мозг других средств, которые стимулируют его пролиферацию, т.е. колониестимулирующих факторов. В другом своем варианте настоящий способ выполняется in vivo. Альтернативно, этот метод может также использоваться для очищения и роста ex vivo клеток костного мозга для трансплантации.

Еще в одном своем аспекте описываемый метод включает лечение пациента, имеющего какие-либо нарушения, вызванные пролиферацией стволовых клеток. Такие заболевания, как псориаз, миелодисплазия, некоторые аутоиммунные болезни, старческая иммунодепрессия, лечат посредством введения пациенту эффективного количества ИНПРОЛа для частичного ингибирования описываемых стволовых клеток.

Настоящее изобретение относится к способу обратимой защиты стволовых клеток от повреждения цитотоксическими средствами, которые могут либо убить, либо повредить стволовые клетки. Этот способ включает введение пациенту, которого планируется лечить такими средствами, эффективного количества ИНПРОЛа.

Настоящее изобретение включает также в свои рамки очистку ИНПРОЛа из свиньи, при этом ожидается, что после использования очищенного белка могут быть получены данные по его последовательности, нужные для клонирования кДНК или гена ИНПРОЛа.

Настоящее изобретение также относится к: Ингибитору пролиферации стволовых клеток, выделенному из костного мозга свиньи или другого источника с применением процедуры, включающей следующие стадии: а) экстракцию костного мозга и удаление частиц фильтрацией; б) тепловую обработку при 56^oC в течение 40 минут с последующим охлаждением в ледяной бане; в) удаление осадка с помощью центрифугирования при 10000g в течение 30 минут при 4^oC; г) кислотное осаждение при добавлении супернатанта к 10 объемам перемешиваемой смеси лед - холодный ацетон, содержащей 1 об.% концентрированной соляной кислоты с последующей инкубацией в течение 16 часов при 4^oC; д) отделение осадка при центрифугировании со скоростью 20000g в течение 30 минут при 4^oC, промывание холодным ацетоном и последующее высушивание; е) выделение хроматографированием с обращением фаз и мониторинг нужной активности по ингибированию колониеобразующей способности клеток костного мозга, обработанных предварительно 5-фторурацилом и инкубируемых в присутствии мышиного ИЛ-3, а также по измерению поглощения при 280 нм и с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (SDS-PAGE).

Настоящее изобретение также относится к: Способу очистки ингибитора пролиферации стволовых клеток, который по существу не содержит другого белковоподобного материала и который включает приведенные стадии, описанные ниже более подробно.

Настоящее изобретение относится также к: Способу лечения человека и животных, в ходе которого начинает функционировать ингибитор, который ослабляет иммуносупрессию, вызванную гиперпролиферацией стволовых клеток.

Настоящее изобретение также относится к: Способу лечения человека и животных, в ходе которого упомянутый ингибитор вводится после того, как в стволовых клетках воздействием либо цитотоксического средства, либо облучением индуцируется пролиферация. Покоящиеся в норме стволовые клетки после химиотерапии стимулируются и вступают в клеточный цикл. Это придает им большую чувствительность при проведении второго курса химиотерапии; настоящий метод защищает клетки от такой обработки, делая ее ненужной.

Настоящее изобретение также относится к: Способу лечения человека и животных, при котором упомянутый ингибитор пролиферации стволовых клеток вводится как адъювант перед вакцинацией или одновременно с ней с целью усиления иммунного ответа.

Настоящее изобретение также относится к: Способу лечения человека и животных, принимающих цитотоксические средства или лучевую терапию, который включает введение эффективного количества ингибитора пролиферации стволовых клеток с целью защиты их от повреждения.

В настоящем изобретении описывается ингибитор стволовых клеток, обозначенный как ИНПРОЛ, который отличается от других известных в технике ингибиторов, таких как МВП-1-альфа, ФРТ-бета, тетрапептид, выделенный Фринделем и сотр., или пентапептид Пауковитца и сотр. (Wright & Pragnell, 1992 (op cit)). ИНПРОЛ имеет молекулярную массу, превышающую 10000 дальтон при измерении методом ультрафильтрации, что отличает его как от тетрапептида, так и от пентапептида. В системах хроматографирования с обращением фаз он ведет себя как более гидрофобное соединение в сравнении с МВП-1-альфа или ФРТ-бета, что отличает его от цитокинов. Более того, способ его действия отличен от такового, известного для всех описанных ингибиторов, заключающийся в том, что он проявляет активность в системе in vitro при использовании уже только в периоде предварительной инкубации. МВП-1-альфа неэффективен, например, когда его используют только в периоде предварительной инкубации (пример 5). Далее, ИНПРОЛ проявляет активность в тесте по измерению уровня "потенциально высокопролиферирующих клеток" (HPP-PFC), в то время как МВП-1-альфа не обладает такой активностью (пример 6).

Краткое описание чертежей На фиг. 1-4 представлена картина разгона продукта на каждой стадии очистки в ДСН-полиакриламидном геле (SDS-PAGE).

На фиг. 5 представлена хроматограмма ВЭЖХ на конечной стадии очистки.

На фиг. 6 приведены данные по включению тритированного тимидина (cpm) в клетки линии FDCP-mix без ИНПРОЛа (контроль = 100%) и при наличии различных его концентраций. Приведенные данные нормализованы к контрольным значениям.

На фиг. 7 показан процент клеток, находящихся в S фазе клеточного цикла после обработки мышей тестостерона пропионатом (ТСП), ТСП плюс ИНПРОЛ или наполнителем (контроль). Каждая группа включает 25 животных (3-4 на каждую временную точку).

На фиг. 8 приведены данные по выживаемости мышей, обработанных двумя дозами 5-ФУ при наличии ИНПРОЛа или без такой обработки. Каждая группа содержит по 30 животных.

На фиг. 9 представлены данные по выживанию облученных мышей при обработке их ИНПРОЛом и без такой обработки. Каждая группа содержит 50 животных.

На фиг. 10A и 10B показана регенерация нормальной длительной культуры костного мозга, растущей в течение 1 недели (10A) и 3 недель (10B) после обработки Ара-Ц плюс ИНПРОЛ.

На фиг. 11 приведены данные по выживанию мышей (75 в каждой группе) после облучения их летальной дозой и проведения трансплантации 3 10⁴ клеток костного мозга после предварительной инкубации их в среде (контроль) или в ИНПРОЛе (25 нг/мл) в течение 4 часов. Уровень выживания отслеживали в течение 30 дней.

На фиг. 12 показаны количество ГМ-КОЕ, образованных через 14 дней в культуре клетками костного мозга, взятыми из мышей после облучения их летальной дозой, а также восстановление с помощью донорных клеток костного мозга, прошедших преинкубацию с ИНПРОЛом или в среде в течение 4 часов.

На фиг. 13 приведены данные по количеству клеток в суспензии из лимфоидной длительной культуры, которую отбирали каждую неделю, промывали и помещали на чашки с ИЛ-7 (10 нг/мл) после предварительной инкубации со средой или ИНПРОЛом в течение 4 часов.

На фиг. 14 показано улучшение способности лейкозных клеток периферической крови к росту после обработки их ИНПРОЛом. Количество инициирующих клеток в длительной культуре [ДК-ИК (LTC-IC)] определяли при помещении слипшихся и неслипшихся клеток из длительной культуры на чашку Петри вместе с ИНПРОЛом и без него, с подсчетом на 7 день числа ГМ-КОЕ. Данные нормализованы к контрольным величинам.

На фиг. 15A показана хроматограмма очищенного ИНПРОЛа на C4 с обращением фаз при элюции 53% ацетонитрилом. На фиг. 15B показана хроматограмма МВП-1-альфа на C4 с обращением фаз при элюции 43,9% ацетонитрилом. На фиг. 15C показана хроматограмма в ДСН-ПААГ неочищенного препарата ИНПРОЛа и очищенного препарата, полученного после хроматографирования с обращением фаз.

С целью лучшего понимания материала настоящего изобретения ниже представлено подробное его описание. Это описание, включающее примеры реализации настоящего изобретения, не следует никоим образом рассматривать как ограничивающее настоящее изобретение, а те вариации, которые, как очевидно каждому специалисту, имеющему средний уровень знаний в данной области, входят в компетенцию настоящего изобретения, должны рассматриваться в рамках предлагаемого изобретения.

Подробное описание предпочтительных вариантов ИНПРОЛ обратимо ингибирует деление стволовых клеток. Более конкретно, ИНПРОЛ эффективен с целью временного ингибирования клеточного деления гемопоэтических клеток. Так, метод настоящего изобретения может быть применен для смягчения нежелательного побочного действия химиотерапии на гемопоэтическую, миелоидную и иммунную системы посредством защиты стволовых клеток от повреждений, вызываемых химиотерапевтическими средствами или облучением, используемыми для разрушения раковых или инфицированных вирусом клеток. В одном из вариантов реализации изобретения ИНПРОЛ вводится пациенту в дозировке, достаточной для ингибирования деления стволовых клеток, возникающем при действии химиотерапевтического средства на больные клетки. После того, как химиотерапевтическое средство выполнит свою функцию, стволовые клетки, ингибированные ИНПРОЛом, в отсутствие дальнейшей обработки, снова станут делящимися клетками. При желании усилить регенерацию гемопоэза можно дополнительно использовать стимулирующие ростовые факторы или цитокины.

В типичной клинической ситуации ИНПРОЛ вводится пациенту посредством внутривенной инъекции или инфузии с использованием, например, для введения от 0,01 до 1 мг/кг очищенного рекомбинантного ИНПРОЛа за 4-60 часов до проведения стандартной химиотерапии или лучевой терапии. В другом варианте реализации настоящего изобретения предварительная обработка ИНПРОЛом позволяет применять более высокие дозы химиотерапевтического средства или облучения, чем те, которые обычно хорошо переносятся больными. Факультативно, после химиотерапии или радиотерапии могут использоваться стимулирующие ростовые факторы, такие как Г-КСФ, фактор стволовых клеток, для дальнейшего улучшения процесса восстановления гемопоэза.

В другом варианте изобретения ИНПРОЛ используют в методе приготовления аутологичного костного мозга для трансплантации. Костный мозг обрабатывают ex vivo эффективным количеством ИНПРОЛа для ингибирования деления стволовых клеток и затем очищают от раковых клеток введением в культуры костного мозга эффективного количества химиотерапевтического средства или облучением. Предпочтительны при этом химиотерапевтические средства, подходящие для использования на делящихся клетках. Обработанный таким образом костный мозг инъецируют вновь в аутологичный организм донора. Факультативно, пациента лечат с применением средств, которые стимулируют гемопоэз с целью улучшения восстановления гемопоэза пациента.

В другом варианте изобретения ИНПРОЛ применяется как средство адъюнктивной терапии при лечении лейкоза. Например, на тех стадиях заболевания, когда лейкозные клетки не отвечают на введение ИНПРОЛа, лейкозные клетки костного мозга обрабатывают ex vivo ИНПРОЛом. Пролиферацию нормальных стволовых клеток предотвращают введением ИНПРОЛа. Таким образом, в течение всего того времени, когда пролиферирующие лейкозные клетки обрабатывают цикло-специфичным цитотоксическим средством, популяцию нормальных стволовых клеток защищают от повреждения. Кроме того, факультативно может вводиться стимулирующий цитокин, такой, в частности, как ИЛ-3 или ГМ-КСФ, с целью индукции цикла деления в лейкозных клетках в ходе лекарственной или лучевой терапии, в то время как нормальные стволовые клетки защищают с помощью ИНПРОЛа. Пациентов лечат с применением химиотерапевтических средств или облучения для разрушения лейкозных клеток, а обработанный костный мозг трансплантируют затем вновь в организм пациента с целью восстановления гемопоэза.

Аналогично в другом варианте изобретения в случае пациентов с серьезными вирусными инфекциями, такими, в которые вовлечены клетки крови или лимфоциты, например ВИЧ инфекция, терапия включает обработку костного мозга ex vivo ИНПРОЛом и далее другими антивирусными средствами и лекарствами, которые разрушают инфицированные клетки или такие системы, которые функционируют на основе антител, с целью удаления инфицированных клеток. Затем после антивирусной или химиотерапевтической обработки костного мозга, направленной на удаление из пациента зараженных вирусом клеток, очищенный ИНПРОЛом костный мозг вновь возвращают пациенту.

В другом варианте изобретения ИНПРОЛ используют для лечения заболеваний, имеющих отношение к гиперпролиферации стволовых клеток. Например, псориаз представляет собой болезнь, вызванную гиперпролиферацией эпителиальных клеток кожи, которую иногда лечат цитотоксическими препаратами. Другие предраковые повреждения, в которые вовлекается пролиферация стволовых клеток, также поддаются воздействию эффективных количеств ИНПРОЛа, применяемого для полного или частичного ингибирования пролиферации стволовых клеток. Для целей такого использования в качестве альтернативы парентеральному введению, в зависимости от условий, могут также применяться композиции, содержащие ИНПРОЛ, для местного или чрескожного режимов введения. В большинстве случаев лейкоза лейкозные предшественники представляют собой дифференцированные клеточные популяции, на которые не воздействует ИНПРОЛ, и которые поэтому лечат с помощью методов, использующих ИНПРОЛ, таким образом, как было описано выше. В тех случаях, когда лейкозные предшественники представляют собой недифференцированные клетки, проявляющие направленную чувствительность к ингибированию ИНПРОЛом, пролиферацию лейкозных клеток ослабляют введением эффективных количеств ИНПРОЛа.

К полипептидным цепям ИНПРОЛа с помощью стандартной техники получают моноклональные или поликлональные антитела. Эти антитела к ИНПРОЛу метят какой-либо хорошо различаемой меткой любого известного в технике типа. Меченый ИНПРОЛ или антитела к ИНПРОЛу используют затем в качестве маркеров стволовых клеток с целью идентификации и выделения стволовых клеток при введении их непосредственно в организм пациента с диагностической целью. Альтернативно эти меченые полипептиды или антитела используют ex vivo для идентификации стволовых клеток в препарате костного мозга, что позволяет удалить их перед очищением костного мозга от раковых клеток. Аналогично такие меченые полипептиды или антитела используют для выделения и идентификации эпителиальных или других стволовых клеток. Кроме того, такие антитела, меченые или не меченные, находят применение в терапевтической практике для нейтрализации активности ИНПРОЛа или в диагностике для обнаружения циркулирующих в крови количеств ИНПРОЛа.

Выделенный из свиньи фактор используют по способу настоящего изобретения при том условии, что он не вызывает в значительных количествах образования вредных антител в иммунной системе хозяина. В рамки настоящего изобретения входит также аналогичный или гомологичный белок человека, имеющий активность, сходную с ИНПРОЛом. С использованием стандартных методик такой белок подвергают клонированию из человеческого гена или из библиотеки кДНК с целью достижения экспрессии рекомбинантного человеческого ИНПРОЛа. Например, с использованием информации, полученной на очищенном белке, могут быть сконструированы меченые олигонуклеотидные образцы, т.е. несущие фосфор 32, и далее использованы для скрининга подходящей библиотеки кДНК (из костного мозга). Альтернативно проводится скрининг по показателю экспрессии библиотеки из соответствующего источника (т.е. костного мозга) для определения кДНК, кодирующей ИНПРОЛ, при этом могут использоваться антитела или подходящие функциональные тесты (см. описание примера 2).

Гомологичные или аналогичные версии ИНПРОЛа из других видов используют для разного рода ветеринарных целей аналогично варианту терапевтического использования его для лечения человека, описанному выше.

Кроме того, ингибирующий стволовые клетки фактор действует на делящиеся стволовые клетки посредством обратимого превращения их в неделящееся состояние "покоя". При возникновении необходимости стимулировать покоящиеся стволовые клетки к делению, в частности, после лечения пациента химиотерапевтическими средствами или облучением данному индивидууму вводят колониестимулирующие факторы и другие стимуляторы гемопоэза. Примеры таких факторов включают, не ограничиваясь ими: М-КСФ, КСФ-1, ГМ-КСФ, Г-КСФ, Мегакариоцит-КСФ или другие цитокины, такие как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ- 13, ИЛ-14 или эритропоэтин.

Полипептиды ИНПРОЛа или его активные фрагменты, обладающие ингибирующей активностью в отношении стволовых клеток, очищают или синтезируют с применением традиционных химических методов в сочетании с подходящими тестами для отслеживания ингибирующей активности по отношению к стволовым клеткам, как это будет видно из примеров, приведенных в нижеследующих методиках.

В одном варианте изобретения терапевтически эффективное количество белка ИНПРОЛа или терапевтически эффективный фрагмент его используют в качестве добавки вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем. Такая композиция ИНПРОЛа вводится обычно путем парентеральной инъекции или инфузии. В соответствии с достигаемым в том или ином случае терапевтическим эффектом выбирается также подкожный, внутривенный или внутримышечный способы инъекций.

При использовании терапевтической композиции настоящего изобретения для систематического ввода ее применяют в форме пригодного для парентеральной инъекции водного раствора, свободного от пирогена. Раствор фармацевтически приемлемого носителя, имеющий соответствующее для придания изотоничности и стабильности значение pH, а также белковый наполнитель и др. соответствуют достигнутому уровню техники. Для введения композиции, содержащей ИНПРОЛ, в случае реализации способа лечения сверхпролиферирующих стволовых клеток используется местный способ доставки или применяют чрескожный пластырь с целью локализации введенной композиции и достижения оптимального эффекта на участке с гиперпролиферацией.

Режим дозировки, применяемый при лечении пациентов накануне введения цитотоксических средств или для лечения гиперпролиферативных состояний стволовых клеток, определяется в каждом конкретном случае лечащим врачом с учетом различных факторов, влияющих на действие лекарств, таких как вид заболевания пациента, вес тела, пол, режим питания, серьезность инфекции, время введения препарата и другие имеющие значение для клиники факторы. В целом, дневной режим приема колеблется в пределах 1-100 (мкг/кг) микрограммов белка ИНПРОЛа или его фрагмента на килограмм веса тела.

В соответствии со способом лечения по настоящему изобретению пациенту, после воздействия цитотоксического средства или облучения, могут быть факультативно введены один или более лимфокинов, колониестимулирующих факторов или других цитокинов, гемопоэтинов, интерлейкинов или ростовых факторов с целью общей стимуляции роста и деления стволовых клеток (и происходящих от них клеток), которые были ингибированы предшествующим применением ИНПРОЛа. Такие терапевтические средства, способные оживлять гемопоэз, включают ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, Мег-КСФ, М-КСФ, КСФ-1, ГМ-КСФ, Г-КСФ или эритропоэтин. Дозировка этих средств подбирается в соответствии с результатами, полученными при клиническом испытании их эффективности по стимулированию восстановления гемопоэза после химиотерапии или трансплантации костного мозга. Эти дозировки должны корректироваться с учетом различий в физическом состоянии пациентов с целью компенсации этих вариаций, а также с учетом количества и типа использованного химиотерапевтического средства или характеристик примененной лучевой терапии. Наличие прогресса в снижении ингибирования стволовых клеток, вызванного введением пациенту в ходе терапии ИНПРОЛа, отслеживается традиционными методами.

При лечении лейкоза наилучший результат достигается при комбинированном введении как ИНПРОЛа для ингибирования деления нормальных стволовых клеток, так и стимулятора роста лейкозных клеток, такого как ИЛ-3 или ГМ-КСФ, одновременно с применяемым для лечения цитотоксическим средством или в процессе облучения, в случае применения лучевой терапии. По применяемому протоколу удается добиться громадных различий между нормальными и лейкозными клетками по таким показателям, как стадия деления, в которой находится клетка в тот или иной момент времени, и чувствительность к лекарству.

Пример 1. Тест по ингибированию in vivo пролиферации стволовых клеток.

Для обнаружения пролиферации множества КОЕ в S-фазе клеточного цикла используется "суицидный" метод с применением меченого H³-тимидина (Becker et al., Blood 26:296-308, 1965).

Незрелые пр