Hcv геномные последовательности для диагностических и терапевтических целей

Hcv геномные последовательности для диагностических и терапевтических целей

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Фрагменты искусственной нуклеиновой кислоты (НК) содержат нуклеотидную последовательность из 18 или более нуклеотидов. Нуклеотиды соответствуют 5'UT-области генома вируса гепатита C. Последовательности выбирают из SEQ I D N 34-51. Искусственную НК помещают в условия, способствующие гибридизации в присутствии НК вируса гепатита С. Наличие продукта гибридизации является показателем наличия генотипа вируса гепатита С. Изобретение позволяет создать вакцины для профилактического лечения инфекций HCV и разработать препараты антител для создания пассивного иммунитета к HCV. 3 с. и 9 з.п.ф-лы, 4 табл., 5 ил.

Рассматриваемая заявка является частичным продолжением заявки США N 07/69726, озаглавленной "Полинуклеотидные зонды, пригодные для скрининга вируса гепатита C", поданной 8 мая 1991 г.

Область изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и способам выявления и борьбы с вирусом гепатита C (HCV) инфекцией, которую ранее называли как образующуюся в крови инфекцию вируса не-A и не-B гепатита (NANBV). Более конкретно, отличительной особенностью настоящего изобретения являются композиции и способы детектирования HCV, и разработка вакцин для профилактического лечения инфекций HCV, и разработка препаратов антител для создания пассивного иммунитета к HCV.

Предпосылки изобретения Прототип изолята HCV охарактеризован в патентной заявке США 122714 (см. также EPO публикацию N 318216). В том смысле, как здесь использован, термин "HCV" включает новые изоляты тех же видов вируса. Термин "HCV-I" относится к патентной заявке США N 122714.

HCV является передаваемым заболеванием, которое отличается от других форм заболеваний печени вирусного происхождения, включая те, которые вызываются известными вирусами гепатита, то есть вирусом гепатита A (HAV), вирусом гепатита B (HBV) и вирусом дельта-гепатита (HDV), а также гепатитов, вызываемых питомегаловирусом (CMV) или Epstein-Barr вирусом (EBV). Впервые вирус HCV был обнаружен у пациентов, которые перенесли переливание крови.

Весьма существенная необходимость в чувствительных специфических методах скрининга и идентификации носителей HCV и зараженной HCV крови и продуктов, полученных в крови. Гепатиты, возникающие после переливания крови, наблюдаются у приблизительно 10% пациентов, которым это переливание делали (PTH), и HCV составляет вплоть до 90% на этих случаях. Это заболевание часто прогрессирует, что приводит к хроническому повреждению печени (25 - 55%).

Лечение пациента, а также предотвращение передачи HCV с кровью или продуктами крови, или за счет тесного контакта персонала, требует надежных средств скрининга, диагностики и прогнозирования для определения нуклеиновых кислот, антигенов и антител, относящихся к HCV.

Информация, содержащаяся в рассматриваемой заявке, предполагает наличие нескольких генотипов HCV. То есть, генетическая информация относительно вирусов HCV может быть полностью идентичной для всех HCV, но охватывает группы с отличающейся генетической информацией.

Генетическая информация хранится в нитевидных молекулах ДНК и РНК. ДНК состоит из ковалентно связанных цепей рибонуклеотидов. Каждый нуклеотид характеризуется одним из четырех оснований: аденином (A), гуанином (G), тимином (T) и цитозином (C). Эти основания комплементарны в том смысле, что за счет ориентации функциональных групп, некоторые пары оснований притягиваются и связываются друг с другом водородными связями и - упаковывающими взаимодействиями. Аденин в одной нити ДНК составляет пару с тимином в противоположно комплементарной нити. Гуанин в одной нити ДНК составляет пару с цитозином в противоположно комплементарной нити. В РНК основание - тимин заменено на урацил (U), который составляет пару с аденином в противоположно комплементарной нити. Генетический код живого организма заключен в последовательности пар оснований. Живые клетки интерпретируют, транскрибируют и транслируют информацию о нуклеиновых кислотах для получения протеинов и пептидов.

HCV геном состоит из однонитевой положительной РНК. HCV геном обладает непрерывной трансляционной открытой считывающей рамкой (ORF), которая кодирует полипротеин из около 3000 аминокислот. В ORF структурный протеин (протеины), по-видимому, должен быть закодирован в приблизительно первой четверти N-терминального участка с большей частью полипротеина, ответственного за неструктурные протеины.

HCV полипротеин содержит в направлении от аминоконца и карбоксиконцу, нуклеокапсидный протеин (C), протеин оболочки (E) и неструктурные протеины (NS) 1, 2(b), 3, 4(b) и 5.

HCV отличающихся генотипов может кодировать протеины, которые изменяют реакцию иммунной системы хозяев. HCV отличающихся генотипов может быть трудно детектировать иммунодиагностическими методиками и методиками с использованием зондов нуклеиновых кислот, которые специфически не соответствуют такому генотипу.

Определения для выбранных терминов, которые использованы в заявке, представлены далее для облегчения понимания изобретения. Термин "соответствующий" означает гомологичный с или комплементарный конкретной последовательности нуклеиновых кислот. Если речь идет о нуклеиновых кислотах и пептидах, соответствующий относится к аминокислотам пептида в порядке, полученном из последовательности нуклеиновой кислоты или ее комплемента.

Термин "не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота" (не нативная) относится к части геномной нуклеиновой кислоты, кДНК, полусинтетической нуклеиновой кислоте или синтетической аминокислоте, которая в результате ее происхождения или каких-либо либо манипуляций: (1) не связана со всеми нуклеиновыми кислотами, с которыми она связана в природе; (2) связана с нуклеиновой кислотой или другим химическим агентом, отличающимся от того, с которым она связана в природе, или (3) не встречается в природе.

Аналогично, термин "не встречающийся в природе пептид" относится к части большого, встречающегося в природе пептида, или протеина, или полусинтетического или синтетического пептида, который в результате своего происхождения или каких-либо манипуляций (1) не связан со всем пептидом, с которым он связан в природе, (2) связан с пептидами, функциональными группами или химическими агентами, отличающимися от тех, с которыми он связан в природе, или (3) не встречается в природе.

Термин "праймер" относится к нуклеиновой кислоте, которая способна инициировать синтез большей нуклеиновой кислоты, если ее поместить в соответствующие условия. Праймер бывает полностью или в основном комплементарен участку нуклеиновой кислоты, подлежащей копированию. Таким образом, в условиях, приводящих к гибридизации, праймер будет отожжен с комплементарным участком более крупной нуклеиновой кислоты. После добавления подходящих реагентов прймер удлиняют полимеризующим агентом с образованием копии более крупной нуклеиновой кислоты.

Термин "связываемая пара" относится к любой паре молекул, которая демонстрирует общее сродство или способность связываться. Для целей настоящей заявки термин "лиганд" относится к одной из молекул связываемой пары, а термин "антилиганд", или "рецептор", или "мишень" относится к противоположной молекуле связываемой пары. Так, например, по отношению к нуклеиновым кислотам связываемая пара может содержать две комплементарные нуклеиновые кислоты. Одну из нуклеиновых кислот обозначают как лиганд, а другую нить обозначают как антилигандный рецептор или мишень. Обозначение лиганда или антилиганда это просто вопрос удобства. Другие связываемые пары содержат, например, антигены и антитела, лекарственные препараты и сайты рецепторов этих препаратов, энзимы и субстраты энзимов.

Термин "меченый" относится к молекулярному фрагменту, который можно детектировать, включая, например (но без ограничений) радиоактивными изотопами, энзимами, люминесцентными агентами, осаждающими агентами и красителями.

Термин "носитель" включает такие обычные носители, как фильтры и мембраны, а также восстанавливаемые носители, которые можно диспергировать в среде и удалить или выделить из среды за счет иммобилизации, фильтрования, разделения и т.д. Термин "носитель" относится к носителю, который способен связываться с нуклеиновыми кислотами, пептидами или антителами за счет связывания партнеров ковалентной или нековалентной связями.

Ряд HCV штаммов и изоляторов был идентифицирован. При сравнении с последовательностью исходного изолята, полученного из USA ("HCV-I" см. Q.-L. Choo et al. (1989) Science 244; 359 - 362, Q.- L. Choo et al. (1990) Brit. Med. Bull. 46, 423 - 441, Q.- L. Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 : 2451 - 2455 (1991), and E.P.O. Patent Publication N 318216, цитированный ранее), было обнаружено, что японский изолят ("HCV JI") значительно отличается как в нуклеотидной, так и в полипептидной последовательности в NS3 и NS4 участках. Этот вывод был позднее распространен на участки NS5 и оболочки [E1/S и E2/NSI] (см. Tareuchi et al. , J. Gen. Virol (1990) 71 : 3027 - 3033, Y. Kubo, Nucl. Acids. Res. (1989) 17 : 1367 - 1372) и K. Tareuchi et al., Gene (1990) 91 : 287 - 291). Первая группа изолятов, впервые идентифицированная в США, называется "Генотип I" в контексте изобретения, тогда как последняя группа изолятов, впервые идентифицированная в Японии, называется здесь "Генотипом II".

Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к композициям вещества, содержащего нуклеиновые кислоты и пептиды, соответствующие нуклеиновым кислотам и пептидам различных генотипов. В настоящем изобретении предложены такие способы использования композиций, соответствующих последовательностям HCV вирусного генома, которые определяют описанные здесь генотипы.

A. Композиции нуклеиновых кислот Нуклеиновая кислота настоящего изобретения, соответствующая HCV вирусному геному, который определяет различные генотипы, может использоваться в качестве зонда в гибридизированном анализе нуклеиновых кислот, в качестве праймера для реакций, включающих синтез нуклеиновых кислот, в качестве связывающих партнеров для выделения HCV вирусной нуклеиновой кислоты и других составляющих, которые могут присутствовать и в качестве антисмысловой нуклеиновой кислоты для предотвращения транскрипции или трансляции вирусной нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов отличительной чертой настоящего изобретения является композиция, содержащая не встречающуюся в природе нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновых кислот из, по крайней мере, восьми нуклеотидов, соответствующих не-HCV-I нуклеотидной последовательности гемона вируса гепатита C. Предпочтительно, нуклеотидную последовательность выбирать из последовательностей, присутствующих в, по крайней мере, одном участке, состоящем из участка NS5, участка I оболочки, 5' UT участка и участка ядра.

Предпочтительно, в отношении последовательностей, которые соответствуют NS5 участку, выбирать последовательность из последовательностей под номерами 2 - 22. Последовательность под номером 1 соответствует HCV-I. Последовательности 1 - 22 определены в описании последовательностей заявки.

Предпочтительно, в отношении последовательностей, соответствующих участку I оболочки, чтобы последовательность выбирали из последовательности, находящейся в ряду последовательностей 24 - 32. Последовательность N 23 соответствует HCV-I. Последовательности под номерами 23 - 32 приведены далее в описании последовательностей рассматриваемой заявки.

Предпочтительно, в отношении последовательностей, которые соответствуют 5' UT участкам, выбирать последовательность из последовательностей под номерами 34 - 51. Последовательность N 33 соответствует HCV-I. Последовательности N 33 - 51 представлены далее в описании последовательностей рассматриваемой заявки.

Предпочтительно, в отношении последовательностей, соответствующих участку ядра, выбирать последовательность из последовательностей под номерами 53 - 66. Последовательность N 52 соответствует HCV-I. Последовательности 52 - 65 представлены далее в описании последовательностей настоящей заявки.

Композиции настоящего изобретения образуют продукты гибридизации с нуклеиновыми кислотами, соответствующими различным генотипам HCV.

HCV имеет, по крайней мере, пять генотипов, которые далее в настоящем изобретении будут обозначать GI-GV. Первый генотип, представлен последовательностями под номерами 1 - 6, 23 - 25, 33 - 38 и 52 - 57. Второй генотип, G II, представлен последовательностями под номерами 7 - 12, 26 - 28, 39 - 45 и 58 - 64. Третий генотип, G III, представлен последовательностями под номерами 13 - 17, 32, 46 - 47 и 65 - 66. Четвертый генотип, G IV, представлен последовательностями под номерами 20 - 22 и 29 - 31 и 48 - 49. Пятый генотип GV, представлен последовательностями 18, 19, 50 и 51.

Отличительной чертой одного из вариантов настоящего изобретения являются композиции, содержащие нуклеиновые кислоты с последовательностями, соответствующими одной или более из последовательностей, которые представляют генотип HCV.

B. Способ получения продуктов гибридизации Отличительной чертой вариантов настоящего изобретения является способ получения продукта гибридизации с нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, соответствующую HCV нуклеиновой кислоте. Один из способов включает стадии помещения не-нативной нуклеиновой кислоты, имеющей не-HCV-I последовательность, соответствующую HCV нуклеиновой кислоте, в условия, в которых может происходить гибридизации. Не-нативная нуклеиновая кислота способна образовывать продукт гибридизации с HCV нуклеиновой кислотой в условиях гибридизации. Этот способ включает далее стадию создания условий гибридизации для образования продукта гибридизации в присутствии нуклеиновой кислоты, соответствующей участку генома HCV.

Образование продукта гибридизации можно использовать для детектирования наличия одного или более из генотипов HCV. Предпочтительно, не-нативная нуклеиновая кислота образует продукт гибридизации с нуклеиновой кислотой HCV в одном или более из участков, содержащих участок NS5, участок I оболочки, 5'UT участок и участок ядра. Для определения продукта гибридизации удобно снабдить меткой не-нативную нуклеиновую кислоту. Образование продукта гибридизации отслеживают, отделяя продукт гибридизации от меченой не-нативной нуклеиновой кислоты, которая не образовала продукта гибридизации.

Образование продукта гибридизации можно использовать как средство для отделения одного или более генотипов HCV нуклеиновой кислоты от других возможно присутствующих составляющих. Для такого применения удобно связывать не-нативную нуклеиновую кислоту с носителем для выделения полученного продукта гибридизации из других составляющих.

"Сэндвичевый анализ" нуклеиновых кислот использует одну нуклеиновую кислоту, связанную с меткой, и вторую нуклеиновую кислоту, связанную с носителем. Одним из вариантов настоящего изобретения является отличительный сэндвичевый анализ, включающий две нуклеиновые кислоты, причем обе имеют последовательности, соответствующие HCV нуклеиновым кислотам, однако, по крайней мере, одна не-нативная нуклеиновая кислота имеет последовательность, соответствующую не-HCV-I HCV нуклеиновой кислоте. По крайней мере, одна нуклеиновая кислота способна связываться с меткой, а другая способна связываться с носителем. Связанную с носителем не-нативную нуклеиновую кислоту используют для выделения продуктов гибридизации, которые включают HCV нуклеиновую кислоту и не-нативную нуклеиновую кислоту, содержащую не-HCV-I последовательность.

Отличительной особенностью одного из вариантов настоящего изобретения является способ детектирования одного или более из генотипов HCV. Этот способ включает стадии помещения не-нативной нуклеиновой кислоты в условия, в которых может происходить гибридизация. Не-нативная нуклеиновая кислота способна связываться с нуклеиновой кислотой одного или более из генотипов HCV. Первый генотип, GI, представлен последовательностями под номерами 1 - 6, 23 - 25, 33 - 38 и 52 - 57. Второй генотип, G II, представлен последовательностями под номерами 7 - 12, 26 - 28, 39 - 45 и 58 - 64. Третий генотип, G III, представлен последовательностями под номерами 13 - 17, 32, 46 - 47 и 65 - 66. Четвертый генотип, G IV, представлен последовательностями под номерами 20 - 22 и 29 - 31. Пятый генотип, G V, представлен последовательностями под номерами 18, 19, 50 и 51.

Продукт гибридизации HCV нуклеиновой кислоты с не-нативной нуклеиновой кислотой, содержащей не-HCV-I последовательность, соответствующую последовательности в HCV геноме, можно использовать для примирования реакции синтеза нуклеиновой кислоты.

Продукт гибридизации HCV нуклеиновой кислоты с не-нативной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, соответствующую HCV конкретного генотипа, можно использовать для примирования реакции синтеза нуклеиновой кислоты этого генотипа. В одном из вариантов синтезированная нуклеиновая кислота является показателем наличия одного или более из генотипов HCV.

Синтез нуклеиновых кислот может также облегчить клонирования нуклеиновых кислот в векторы экспрессии, которые синтезируют вирусные протеины.

Варианты настоящего изобретения имеют применение в качестве анти-смысловых агентов для предотвращения транскрипции или трансляции вирусной нуклеиновой кислоты. Образование продукта гибридизации не-нативной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, которая соответствует геномной последовательности определенного генотипа HCV, с HCV нуклеиновой кислотой может блокировать трансляцию или транскрипцию такого генотипа. Можно создать терапевтические агенты для включения всех пяти генотипов для целостности.

C. Композиция пептида и антитела Следующей отличительной чертой настоящего изобретения является вариант, в котором композиция содержит не-нативный пептид из трех или более аминокислот, соответствующих нуклеиновой кислоте, имеющей не-HCV-I последовательность. Предпочтительно, чтобы не-HCV-I последовательность соответствовала последовательности внутри одного или более из участков, состоящих из NS5 участка, участка I оболочки, 5'UT участка и участка ядра.

Предпочтительно, в отношении пептидов, соответствующих нуклеиновой кислоте, содержащей не-HCV-I последовательность NS5 участка, чтобы последовательность выбрали из последовательностей 2 - 22. Последовательность под номером 1 соответствует HCV-I. Последовательности под номерами 1 - 22 представлены далее в разделе описание последовательностей.

Предпочтительно, в отношении пептидов, соответствующих нуклеиновой кислоте с не-HCV-I последовательностью участка I оболочки, чтобы последовательность выбирали из последовательностей под номерами 24 - 32. Последовательность под номером 23 соответствует HCV-1. Последовательности под номерами 23 - 32 представлены далее в разделе последовательностей.

Предпочтительно, в отношении пептидов, содержащих нуклеиновую кислоту с не-HCV-I последовательностью, направленной на участок ядра, чтобы последовательность выбирали из последовательностей под номерами 53 - 66. Последовательность под номером 52 соответствует HCV-I. Последовательности под номерами 52 - 66 представлены далее в описании последовательностей.

Следующим отличительным вариантом настоящего изобретения является пептидная композиция, соответствующая последовательностям нуклеиновых кислот генотипа HCV. Первый генотип, G I, представлен последовательностями под номерами 1 - 6, 23 - 25, 33 - 38 и 52 - 57. Второй генотип, G II, представлен последовательностями под номерами 7 - 12, 26 - 28, 39 - 45 и 58 - 64. Третий генотип, G III, представлен последовательностями под номерами 13 - 17, 32, 46 - 47 и 65 - 66. Четвертый генотип, G IV, представлен последовательностями под номерами 18, 19, 50 и 51.

Не-нативные полипептиды настоящего изобретения можно использовать в качестве компонентов вакцин. Информация о последовательностях настоящего изобретения позволяет сконструировать вакцины, которые включают все или часть HCV различных генотипов. Направленность вакцины на конкретный генотип позволяет осуществить профилактическую обработку для сведения к максимуму защиты вовлеченных агентов. Направленность вакцины на более чем один генотип позволяет вакцине быть более универсальной.

Пептидные композиции можно также использовать для выработки специфических антител к HCV протеинам. Отличительной особенностью одного из вариантов настоящего изобретения являются композиции, в которых антитела к пептидам соответствуют не-HCV-I последовательности HCV генома. Предпочтительно, не-HCV-I последовательность выбирать из последовательности внутри участка, состоящего из участка NS5, участка I оболочки и участка ядра. Там нет пептидов, связанных с нетранслируемым 5'UT участком.

Предпочтительно, по отношению к антителам к пептидам NS5 участка, чтобы пептид соответствовал последовательности из числа последовательностей под номерами 2 - 22. Предпочтительно, по отношению к антителам к пептидам, соответствующим участку I оболочки, чтобы пептид, соответствующий последовательности, был из числа последовательностей под номерами 24 - 32. Предпочтительно, по отношению к антителам к пептидам, соответствующим участку ядра, чтобы пептид соответствовал последовательности из последовательностей под номерами 53 - 66.

Антитела к пептидам, которые отражают определенный генотип, используют для детектирования таких генотипов HCV и в качестве терапевтических агентов.

Один из вариантов настоящего изобретения отличается антителами к пептидам, соответствующим нуклеиновой кислоте, имеющей последовательности определенного генотипа. Первый генотип, G I, представлен последовательностями под номерами 1 - 6, 23 - 25, 33 - 38 и 52 - 57. Второй генотип, G II, представлен последовательностями под номерами 7 - 12, 26 - 28, 39 - 45 и 58 - 64. Третий генотип, G III, представлен последовательностями под номерами 13 - 17, 32, 46 - 47 и 65 - 66. Четвертый генотип, G IV, представлен последовательностями под номерами 20 - 22, 29 - 31, 48 и 49. Пятый генотип, GV, представлен последовательностями под номерами 18, 19, 50 и 51.

Специалисты легко поймут, что композиции настоящего изобретения могут быть упакованы с инструкциями для использования в виде набора для проведения гибридизации нуклеиновых кислот или иммунохимических реакций.

Далее настоящее изобретение описывается со ссылкой на следующие чертежи, которые иллюстрируют последовательности, демонстрирующие генотипы HCV. Эти последовательности обозначены номерами 1 - 145, в которых нумерация и последовательности соответствуют нумерации и последовательностям, представленным далее в описании последовательностей. Последовательности 146 и 147 облегчают обсуждение анализа, нумерации и последовательности, в которых соответствуют нумерации и последовательностям в разделе описания последовательностей.

Фиг. 1 схематически изображает генетическую организацию HCV; фиг. 2 изображает последовательности нуклеиновых кислот под номерами 1-22, причем эти последовательности получены из NS5 участка HCV вирусного генома; фиг. 3 изображает последовательности нуклеиновых кислот под номерами 23-32, причем эти последовательности получены из участка I оболочки HCV вирусного генома; фиг. 4 изображает последовательности нуклеиновых кислот под номерами 33-51, причем эти последовательности получены и 5'UT участка генома вируса HCV; фиг. 5 изображает последовательности нуклеиновых кислот под номерами 52-66, причем эти последовательности получены из участка ядра генома вируса HCV.

Описание последовательностей представляет далее последовательности под номерами 1-147 (см. в конце описания).

Далее настоящее изобретение будет описано подробно, как нуклеиновая кислота с последовательностью, которая соответствует HCV геному, и родственные пептиды, и связывающие партнеры, для диагностического и терапевтического применений.

В практике настоящего изобретения будут использованы, если нет других указаний, обычные методики химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие методики подробно описаны в литературе. См. Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; a Laborafory Manual (1982); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N.Glover ed 1985); Oligonucleatide Syntnesis (M.J.Gait ed 1984); Nucleic Acid Hybridijation (B.D.Hames and S.J.Higgins eds. 1984); серия Methods in Enjymology (Academic Press, Anc.), особенно Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, eds.).

кДНК библиотеки получены из последовательностей нуклеиновх кислот, которые присутствуют в плазме HCV- инфицированных шимпанзе. Конструирование одной из таких библиотек, "с" библиотеки (АТСС N 40394) раскрыто в РСТ публикации N 090/14436. Последовательности библиотеки, относящиеся к настоящему изобретению, представлены далее как последовательности под номерами 1, 23, 33 и 52.

Нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные в соответствии с отличительными особенностями настоящего изобретения, можно использовать, например (но не ограничиваясь этими применениями) в качестве зондов, праймеров, анти-смысловых генов, и для разработки систем экспрессии для синтеза пептидов, соответствующих таким последовательностям.

Описанные последовательности нуклеиновых кислот определяют генотипы HCV по отношению к четырем участкам вирусного генома. На фиг. 1 схематически изображена организация HCV. Представляющие интерес четыре участка являются NS5 участком, участком I оболочки, 5' UT участком и участком ядра.

Представленные далее последовательности в настоящем изобретении представлены под номерами 1-22, предполагают наличие, по крайней мере, пяти генотипов в NS5 участка. Последовательности под номерами 1-22 изображены на фиг. 2, а также перечислены в разделе описание последовательностей. Каждая из последовательностей 1-22 получена из нуклеиновой кислоты, содержащей 40 нуклеотидов из NS 5 участка.

Пять генотипов определяются группировками последовательностей, определенных последовательностями под номерами 1-22. Для удобства им далее будут присвоены латинские номера и буква "G".

Первый генотип (GI) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 1-6. Второй генотип (G11) представлен последовательностями в числе последовательностей под номерами 7-12. Третий генотип (GIII) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 13-17. Четвертый генотип (GIV) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 20-22. Пятый генотип (GV) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 18 и 19.

Представленные далее в настоящем изобретении последовательности под номерами 23-32 предполагают, по крайней мере, четыре генотипа в участке I оболочки HCV. Последовательности под номерами 23-32 изображены на фиг. 3, а также перечислены в описании последовательностей. Каждая из последовательностей 23-32 получена из нуклеиновой кислоты, содержащей 100 нуклеотидов из участка I оболочки.

Первая группа генотипа I оболочки (GI) представлена последовательностью из числа последовательностей 23-25. Второй участок генотипа I оболочки (GII) представлен последовательностью под номерами 26-28. Третий генотип I оболочки (GIII) представлен последовательностью из числа последовательностей под номерами 32. Четвертый генотип I оболочки (GIV) представлен последовательностью из числа последовательностей под номерами 29-31.

Представленные далее в рассматриваемой заявке последовательности под номерами 33-51 предполагают, по крайней мере, три генотипа в 5'UT участке HCV. Последовательности под номерами 33-51 изображены на фиг. 4, а также перечислены в описании последовательностей. Каждая из последовательностей под номерами 33-51 получена из нуклеиновой кислоты, содержащей 252 нуклеотида из 5'UT участка, хотя последовательности 50 и 51 несколько короче на приблизительно 180 нуклеотидов.

Первый из 5'UT генотип (GI) представлен последовательностью в числе последовательностей под номерами 33-38. Второй 5'UT генотип (GII) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 39-45. Третий 5'UT генотип (GIII) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 46-47. Четвертый 5'UT генотип (GIV) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 48 и 49. Пятый генотип 5'UT(GV) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 50 и 51.

Последовательности под номерами 48-62, предполагают, по крайней мере, три генотипа в участке ядра HCV. Последовательности под номерами 52-66 изображены на фиг. 5, а также перечислены в описании последовательностей.

Первый генотип участка ядра (GI) представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 52-57. Второй генотип (GII) участка ядра представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 58-64. Третий генотип (GIII) участка ядра представлен последовательностями из числа последовательностей под номерами 65-86. Последовательности под номерами 52-65 содержат 549 нуклеотидов. Последовательность под номером 66 содержит 510 нуклеотидов.

Различные генотипы, описанные по отношению к каждому из участков, совместимы. То есть, HCV, имеющий отличительные особенности первого генотипа по отношению к NS5 участку, будут существенно соответствовать особенностям первого генотипа участка I оболочки, 5'UT участка и участка ядра первого генотипа.

Нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные в соответствии с последовательностями под номерами 1-66, представленные далее, можно использовать в качестве зондов, праймеров, лигандов-ловушек и анти-смысловых агентов. В качестве зондов праймеров, лигандов-ловушек и анти-смысловых агентов нуклеиновые кислоты обычно содержат приблизительно восемь или более нуклеотидов для специфичности, а также для того, чтобы они были способны образовывать стабильные продукты гибридизации.

Зонды Нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные в соответствии с последовательностями, определяющими конкретный генотип участка HCV генома, можно использовать в качестве зонда для определения такого генотипа или использовать в сочетании с другими зондами нуклеиновых кислот для определения практически всех генотипов HCV.

Учитывая информацию о последовательностях, представленную далее в рассматриваемой заявке, последовательности из восьми или более нуклеотидов идентифицированы, что обеспечивает необходимую целостность и уникальность по отношению к различным генотипам HCV и последовательностям посторонних нуклеиновых кислот, которые могли быть вовлечены в гибридизацию в данных условиях.

Специалистам в данной области легко понять, что последовательности нуклеиновых кислот для использования в качестве зондов должны быть снабжены метками для облегчения детектирования продукта гибридизации.

Лиганд-ловушка Для использования в качестве лиганда-ловушки нуклеиновая кислота, выбранная описанным ранее способом по отношению к зонду, должна легко связываться с носителями. Способы, которыми нуклеиновые кислоты могут быть связаны с носителями, хорошо известны. Нуклеиновые кислоты, имеющие последовательности, соответствующие последовательностям из числа последовательностей 1-66, можно использовать для отделения вирусной нуклеиновой кислоты одного генотипа от нуклеиновых кислот HCV других генотипов. Нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные в соответствии с последовательностями из числа последовательностей под номерами 1-66, использованные в комбинациях, можно использовать для улавливания практически всех нуклеиновых кислот всех генотипов HCV.

Праймеры Нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные в соответствии с описанными далее последовательностями, можно использовать в качестве праймеров для амплификации HCV последовательностей. Что касается методик полимеразных цепных (PCR) реакций, последовательности нуклеиновых кислот из восьми или более нуклеотидов, соответствующих одной или более из последовательностей перечисленных под номерами 1-66, можно использовать в сочетании с подходящими энзимами и реагентами для создания копий вирусной нуклеиновой кислоты. Множество праймеров, имеющих последовательности, соответствующие более чем одному генотипу, можно использовать для создания копий вирусной нуклеиновой кислоты для таких генотипов.

Эти копии можно использовать в диагностическом анализе для детектирования HCV вируса. Эти копии можно также включить в векторы клонирования и экспрессии для создания полипептидов, соответствующих нуклеиновым кислотам, синтезированным с помощью PCR, что будет более подробно описано далее.

Анти-смысловые Нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные в соответствии с описанными здесь последовательностями, можно использовать в качестве анти-смысловых генов для предотвращения экспрессии HCV.

Нуклеиновую кислоту, соответствующую генотипу HCV, помещают в подходящий носитель, например в липосому, для введения в клетку инфицированную HCV. Нуклеиновая кислота, содержащая восемь или более из нуклеотидов, способна связывать вирусную нуклеиновую кислоту или вирусную мРНК. Предпочтительно, чтобы анти-смысловая нуклеиновая кислота состояла из 30 или более нуклеотидов для обеспечения необходимой стабильности продукта гибридизации вирусной нуклеиновой кислоты или вирусной мРНК. Способы введения анти-смысловой нуклеиновой кислоты известны специалистам, и примеры их представлены в патенте США 4241046, выданном 23 декабря 1980 г. Papahadjopoulos et al.

Синтез пептидов Нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные в соответствии с описанными здесь последовательностями, можно использовать для создания пептидов. Последовательности, представленные последовательностями под номерами 1-32 и 52-66, можно клонировать в соответствующие векторы или использовать для выделения нуклеиновой кислоты. Выделенные нуклеиновые кислоты объединяют с подходящими ДНК линкерами и клонируют в подходящий вектор. Такой вектор можно использовать для трансформации подходящего организма хозяина, например, E.coli, и выделить пептид, закодированный этой последовательностью.

Методика молекулярного клонирования описана в тексте: Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Maniatis et al., Coldspring Habor Laboratory (1982).

Выделенный пептид можно использовать в качестве антигенного вещества для выработки вакцин и антител к конкретному генотипу HCV.

Вакцины и антитела Пептидный материал настоящего изобретения можно использовать для выработки антител и вакцин.

Способность кДНК последовательностей или полученных из нее нуклеотидных последовательностей (включая сегменты и модификации последовательности) позволяют конструировать векторы экспрессии, кодирующие антигенно активные участки пептида, закодированного в каждой из нитей. Участки антигенно активные можно получить из NS5 участка, участков I оболочки и участка ядра.

Фрагменты, кодирующие целевые пептиды, получают из клонов кДНК, используя обычное рестрикционое переваривание или синтетическими способами, и лигируют в векторы, которые могут, например, содержать части слитых последовательностей, такие как бетагалактозидаза или супероксиддисмутаза (SOD), предпочтительно, SOD. Способ и векторы, которые пригодны для получения полипептидов, которые содержат слитые последовательности SOD, описаны в Европейской патентной открытой публикации 0196056, опубликованной 1 октября 1986 г.

Любую нужную часть HCV кДНК, содержащую открытую считывающую рамку, в любой смысловой нити, можно получить в виде рекомбинантного пептида, как например, зрелого или слитого протеина; в другом варианте, пептид, закодированный в кДНК, можно получить химическим синтезом.

ДНК, кодирующую целевой пептид, независимо от того, зрелый ли он или сплавленный, содержит ли он сигнальную последовательность, позволяющую секрецию или нет, можно лигировать в векторы экспрессии, подходящие для любого обычного хозяина. В настоящее время для образования рекомбинантных пептидов используют как эукариотные, так и прокариотные системы хозяев. Затем пептид выделяют из лигированных клеток или из культуральной среды и очищают до степени, необходимой для целевого использования. Очистку можно вести способами, известными специалистам, например дифференциальной экстракцией, солевым фракционированием, хроматографией на ионообменой смоле, афинной хроматографией, центрифугированием и т.п. См., например, "Способы в энзимологии для различных способов очистки протеинов". Такие пептиды можно использовать для диагностических целей, или те, которые являются источником нейтрализующих антител, можно приготовить в виде вакцин