Способ скрининга невропатологии

Способ скрининга невропатологии

Реферат

 

Изобретение предназначено для диагностики невропатологических состояний, например церебральной ишемии, эпилепсии. Способ скрининга для невропатологии включает в себя несколько стадий. Получают образец жидкости от первого индивидуума. Соединяют его с антителом, специфически иммунореактивным с IСАМ-4. Проводят количественный анализ связывания IСАМ-4/антитело в образце. Сравнивают связывание IСАМ/антитело в указанном образце с таким же связыванием в образце от второго индивидуума, не имеющего неврологических заболеваний. Очищенная и выделенная ДНК содержит промотор для IСАМ-4 млекопитающих. Химерный полинуклеотид содержит промотор для гена человеческого IСАМ-4. Вектор экспрессии содержит указанную ДНК. Клетка-хозяин трансформирована указанным вектором экспрессии. Полипептид, обозначенный как "IСАМ-4", относится к факторам клеточной адгезии. Он обладает структурным родством с факторами межклеточной адгезии IСАМ-1, IСАМ-2 и IСАМ-R. Изобретение позволит определить уровни растворимого IСАМ-4 в жидкостях человека в здоровом и больном состоянии. 4 з.п. ф-лы, 5 табл.

Эта заявка частично продолжает патентную заявку США N 08/481130, поданную 7 июня 1995 г., которая частично продолжает заявку США N 08/245295, поданную 18 мая 1994 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки США N 08/102852, поданной 5 августа 1993 г. как частичное продолжение заявки США N 08/009266, поданной 22 января 1993 г. как частичное продолжение заявки США N 07/894061, поданной 5 июня 1992 г. как частичное продолжение заявки США N 07/889724, поданной 26 мая 1992 г. как частичное продолжение одновременно рассматриваемой заявки США N 07/827689, поданной 27 января 1992 г.

Настоящее изобретение относится, в основном, к факторам клеточной адгезии, а более конкретно к клонированию и экспрессии ДНК, кодирующей ранее неизвестный полипептид, обозначенный как "ICAM-4", который обладает структурным родством с факторами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R.

Исследования последнего десятилетия в значительной степени пролили свет на молекулярные явления, сопутствующие межклеточным взаимодействиям в теле, в особенности на явления, имеющие место при перемещении и активации клеток в иммунной системе, и на явления, сопутствующие развитию и нормальной физиологической функции клеток в нервной системе. См., в основном, Springer, Nature, 346: 425-434(1990) - относительно клеток иммунной системы; Yochihara et al., Neurosci. Res., 10: 83-105 (1991), а также Sonderegger and Rathjen, J. Cell Biol., 119: 1387-1394 (1992) - относительно клеток нервной системы. Белки поверхности клеток и, особенно, так называемые факторы клеточной адгезии (CAM) соответственно были предметом фармацевтических исследований и разработок, имеющих своей целью вмешательство в процессы проникновения лейкоцитов в области воспаления и перемещения лейкоцитов в точно определенные ткани, а также дифференциация и образование сложных нейронных цепей. Выделение и исследование факторов клеточной адгезии, клонирование и экспрессия последовательностей ДНК, кодирующих такие факторы, и получение терапевтических и диагностических средств для воспалительных процессов, а также развития и деятельности нервной системы также было предметом изобретения многочисленных американских и зарубежных патентных заявок. См. Edwards, Current, Opinion in Therapeutic Patents, 1(11): 1617-1630 (1991) и особенно приведенные здесь "ссылки на патентную литературу".

Основной интерес с точки зрения предпосылок настоящего изобретения представляет известная идентификация и исследование некоторых медиаторов явлений клеточной адгезии, "лейкоинтегринов", LFA-1, MAC-1 и gp 150.95 (известных в номенклатуре ВОЗ как CD18/CD11a, CD18/CD11b и CD18/CD11c соответственно), которые образуют подсемейство белков поверхности клеток гетеродимерных "интегринов", присутствующих на B-лимфоцитах, T-лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах. См., например, Springer, табл. 1 на стр. 429. Также представляют интерес другие адгезивные молекулы простой цепи (CAM), которые участвовали в активации лейкоцитов, адгезии, подвижности и т.п., то-есть явлениях, присущих воспалительному процессу. Например, в настоящее время считается, что перед выделением лейкоцитов, что характерно для воспалительных процессов, происходит активация интегринов, существенно выраженных на лейкоцитах, за которой следует тесное лиганд/рецепторное взаимодействие между интегринами (например, LFA-1) и одним из двух или обоими отдельными факторами межклеточной адгезии (ICAM), обозначенными ICAM-1 и ICAM-2, которые выражены на поверхностях эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и на других лейкоцитах.

Как другие CAM, исследованные в настоящее время [например, васкулярная адгезивная молекула (VCAM-1), описанная в заявке PCT WO 90/13300, опубликованной 15 ноября 1990 г., и адгезивная молекула эндотелиальных клеток тромбоцита (PECAM-1), как описано в работе Newman et al., Science, 247: 1219-1222 (1990) и заявке PCT WO 91/10683, опубликованной 25 июля 1991 г.], ICAM-1 и ICAM-2 являются структурно гомологическими по отношению к другим элементам суперсемейства генов иммуноглобулина в том, что внеклеточная часть каждой из них содержит ряд доменов, разделяющих подобный карбоксиконцевой рисунок. "Типичный" иммуноглобулинподобный домен содержит петельную структуру, обычно прикрепленную посредством дисульфидной связи между двумя цистеинами на конце каждой петли. ICAM-1 включает пять иммуноглобулинподобных доменов; ICAM-2, который отличается от ICAM-1 распределением клеток, включает два таких домена; PECAM-1 - шесть; VCAM - шесть или семь, в зависимости от вариантов соединения, и т. д. Более того, CAM обычно включают гидрофобную "трансмембранную" область, которая, как считают, участвует в ориентации молекулы у поверхности клетки, и карбоксиконцевую "цитоплазматическую" область. Графические модели расположения CAM в действии обычно показывают молекулу, прикрепленную в клеточной мембране у трансмембранной области к цитоплазматическому концевому сегменту, проходящему в клеточную цитоплазму, и одной или более иммуноглобулиноподобных петель, выходящих за пределы поверхности клетки.

Количество нейронных клеток выражает поверхностные рецепторы с внеклеточными Ig-подобными доменами, структурно схожими с ICAM. См., например, Yoshihara et al. В дополнение к Ig-подобным доменам многие адгезивные молекулы нервной системы также содержат тандемно повторяющиеся фибронектинподобные последовательности во внеклеточном домене.

Использование в терапевтических целях факторов межклеточной адгезии было расширено вследствие способности ICAM-1 связывать "H"-риновирусы. Например, в европейской патентной заявке N 468257 A, опубликованной 29 января 1992 г., описывается развитие многочисленных конфигураций и форм ICAM-1 (включая полномерные и процессированные формы молекул), предложенных для достижения улучшенной лиганд/рецепторной связывающей активности, особенно при связывании с вирусами, лимфоцит-ассоциированными антигенами и патогенами, такими как Plasmodium falciparum.

Подобным образом было расширено использование протеинов, иммунологически связанных с факторами межклеточной адгезии. Например, в заявке WO 91/16928, опубликованной 14 ноября 1991 г., описаны гуманизированные химерные антитела анти-ICAM-1 и их использование при лечении специфического и неспецифического воспаления, вирусной инфекции и астмы. Антитела анти-ICAM-1 и их фрагменты описаны как полезные при лечении эндотоксинового бактериально-токсического шока в заявке WO 92/04034, опубликованной 19 марта 1992 г. Ингибирование ICAM-1-эависимых воспалительных реакций антиидиотипическими антителами анти-ICAM-1 и фрагментами антител описано в заявке WO 92/06119, опубликованной 16 апреля 1992 г.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые при проникновении в сущность явлений клеточной адгезии в результате идентификации и исследования белков межклеточной адгезии, таких как ICAM-1, и взаимодействующих с лимфоцитами интегринов, таких как LFA-1, общая картина далека от завершенности. Обычно считают, что множество других белков участвует в воспалительных процессах и в направленном движении лимфоцитов в теле. Например, в патентных заявках США NN 07/827689, 07/889724, 07/894061 и 08/009266 и соответствующей опубликованной заявке PCT WO 93/14776 (опубликованной 5 августа 1993 г.) описано клонирование и экспрессия ICAM-ассоциированного белка, ICAM-R. Описания изобретений этих заявок частично включены как ссылочный материал в данную заявку, и ДНК и аминокислотные последовательности ICAM-R представлены в ней в SEQ ID N 4. Было обнаружено, что этот новый лиганд был выражен на человеческих лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах.

Особый интерес для настоящей заявки представляет другой идентифицированный ICAM-подобный поверхностный фактор, тканевая специфическая экспрессия которого отличает его от других известных факторов ICAM. В работе Mori et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84: 3921-3925 (1987)] приводится идентификация антигена конечного мозга кролика, обладающего специфической иммунореактивностью с моноклональным антителом 271A6. Этот поверхностный антиген получил название теленцефалин. В работе Imamura et al. [Neurosci. Letts., 119: 118-121 (1990)] при использовании поликлонального антитела для определения локализованной экспрессии утверждалось, что экспрессия теленцефалина в зрительной зоне коры головного мозга кошек показывает изменение в слоях ткани, а также сообщалось, что экспрессия теленцефалина изменяется как функция развития. Затем в работе Oka et al. [Neuroscience, 35: 93-103 (1990)] сообщалось о выделении теленцефалина при использовании моноклонального антитела 271A6. В публикации сообщается, что молекулярная масса поверхностной молекулы около 500 kD и что молекула состоит из четырех субъединиц, каждая с нативной молекулярной массой 130 kD, и примерно 100 kD - последующая обработка N-глюканазой. В работе Yoshihiro et al. [Neuroscience, Research Supplement, 18, p. S83 (1994)] сообщается о кДНК и аминокислотных последовательностях для теленцефалина кролика на 17-й ежегодной встрече Японского неврологического общества в Нагойе, Япония, 7-9 декабря 1993 г., и на 23-й ежегодной встрече неврологического общества в Вашингтоне, 9 ноября 1993 г. [Society for Neuroscience Abstracts 19 (1-3), p.646 (1993)]. Установленная аминокислотная последовательность позволяла предположить, что теленцефалин с молекулярной массой 130 kD является интегральным белком мембраны с девятью внеклеточными иммуноглобулин(Ig)подобными доменами. Из них восемь периферических доменов показали гомологию к другим Ig-подобным доменам ICAM. Такие же данные содержатся в работе Yoshihara et al., Neuron 12: 543-553 (1994).

Таким образом, возникла необходимость в выявлении дополнительных белков, участвующих в межклеточных взаимодействиях человеческого организма, и, в особенности, необходимость в информации, служащей для специфической идентификации и исследования таких белков в том, что касается их аминокислотной последовательности. Более того, исходя из факта, что такие молекулы могут образовать основу для развития терапевтических и диагностических средств, важно, чтобы получила разъяснение кодирующая их ДНК. Такая конструктивная информация обеспечила бы, между прочим, крупномасштабное производство белков, позволила бы идентифицировать клетки, продуцирующие их естественным путем, и подготовить антитела или другие новые связывающие белки, специфически реактивные с ними и/или тормозящие лиганд/рецепторные связывающие реакции, в которых они задействованы.

В одном из этих аспектов настоящее изобретение направлено на получение очищенных и выделенных полинуклеотидов (например, последовательностей ДНК, транскриптов РНК и их десенсибилизирующих олигонуклеотидов), кодирующих новый полипептид, ICAM-4, а также его полипептидные варианты (включая фрагменты и аналоги делеции, замены и присоединения), которые воспроизводят одну или более лиганд/рецепторные связывающие биологические активности и/или иммунологические свойства, характерные для ICAM-4. Присущие ICAM-4 лиганд/рецепторные связывающие биологические активности включают в себя взаимодействия как внеклеточных, так и цитоплазматических доменов ICAM-4 с другими молекулами (например, в процессе межклеточной адгезии и/или сигнальной трансдукции). Предпочтительные последовательности ДНК по настоящему изобретению включают геномные и кДНК-последовательности, а также последовательности полностью или частично химически синтезированных ДНК. Предпочтительный в настоящее время полинуклеотид представлен в SEQ ID N 1 и кодирует крысиный видовой ICAM-4. Рассматриваются биологические реплики (т.е. копии выделенных последовательностей ДНК, осуществленных in vivo или in vitro) последовательностей ДНК по данному изобретению. Также рассматриваются автономно реплицирующиеся рекомбинантные конструкции, такие как векторы плазмиды и вирусной ДНК, включающие последовательности ICAM-4 и, особенно, векторы, в которых ДНК, кодирующая ICAM-4 или вариант ICAM-4, соединена в действии с ДНК-последовательностью контроля эндогенной или экзогенной экспрессии.

В соответствии с другим аспектом изобретения клетки-хозяева, особенно одноклеточные клетки-хозяева, такие как прокариотические или эукариотические клетки, устойчиво трансформируются последовательностями ДНК по данному изобретению таким образом, чтобы в них были выражены нужные полипептиды. Клетки-хозяева, выражающие такие продукты ICAM-4 и вариантов ICAM-4, могут использоваться в самых различных целях. В той степени, в какой выраженные продукты "отображены" на поверхностях клеток, клетки могут образовывать полезный иммуноген для развития антител, специфически иммунореактивных с ICAM-4 и вариантами ICAM-4. Клетки-хозяева по данному изобретению очень полезны в способах крупномасштабного получения ICAM-4 и вариантов ICAM-4, где клетки выращиваются в соответствующей культурной среде и нужные продукты полипептида выделяются из клеток или из среды, в которой выращиваются клетки.

Новые ICAM-4 по данному изобретению могут быть получены как изоляты из источников естественных клеток, но, наряду с продуктами вариантов ICAM-4, их предпочтительно получают посредством рекомбинантных методов с участием клеток-хозяев по данному изобретению. Предпочтительная в настоящее время аминокислотная последовательность для полипептида IСAM-4 представлена в SEQ ID N 2. Продукты могут быть получены в полностью или частично гликозилированной, частично или полностью дегликозилированной или негликозилированной форме, в зависимости от клетки-хозяина, выбранной для рекомбинантного получения и/или процессирования после выделения. Варианты ICAM-4 по данному изобретению могут содержать водорастворимые или нерастворимые мономерные, мультимерные или циклические фрагменты ICAM-4, которые включают все или часть одной или более областей доменов, описанных выше и имеющих биологическое или иммунологическое свойство ICAM-4, включая, например, способность связываться со связывающим партнером ICAM-4 и/или ингибировать связывание ICAM-4 с естественным связывающим партнером. Варианты ICAM-4 по данному изобретению могут также содержать аналоги полипептида, в которых одна или более определенных аминокислот исключается или заменяется: (1) без утраты и преимущественно с улучшением одной или более биологических активностей или иммунологических характеристик, специфических для ICAM-4, или (2) с конкретной утратой определенной функции лиганд/рецепторного связывания. Рассматриваются аналогичные полипептиды, включая дополнительные аминокислотные (например, лизина или цистеина) остатки, которые облегчают мультимерное образование.

В настоящем изобретении рассматриваются также антитела (например, моноклональные и поликлональные антитела, фрагменты антител, антитела простой цепи, химерные антитела, антитела с транслантированным CDR и т.п.) и другие связывающие белки (например, полипептиды и пептиды), которые являются специфическими (т.е. нереактивными с факторами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R, которым ICAM-4 структурно близок) для ICAM-4 или вариантов ICAM-4. Изобретение затрагивает также клеточные линии гибридомы, которые выделяют моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением. Предпочтительными гибридомами по данному изобретению являются 127A, 127H, 173E, 179I и 179H. Антитела могут быть развиты при использовании выделенных естественных или рекомбинантных ICAM-4 или вариантов ICAM-4, или клеток, выражающих такие продукты на их поверхностях. Связывающие белки по данному изобретению дополнительно используются для исследования структур(ы) связывающего сайта (например, эпитопов и/или восприимчивости связывающих свойств к модификациям в аминокислотной последовательности ICAM-4).

Связывающие белки используются, в свою очередь, в составах для иммунизации, а также для очистки полипептидов по данному изобретению и идентификации клеток, воспроизводящих полипептиды на их поверхностях. Они также используются при модулировании (в т.ч. блокировании, торможении или стимулировании) лиганд/рецепторных связывающих биологических активностей с участием ICAM-4, в особенности тех эффекторных функций ICAM-4, которые связаны со специфическими и неспецифическими ответами иммунной системы. Рассматриваются также антиидиотипические антитела, специфические для антител анти-ICAM-4, и применение таких антиидиотипических антител в модулировании иммунных ответов. При анализе для обнаружения и количественного определения ICAM-4 на поверхностях клеток и в жидкостях организма, например в серозной или цереброспинальной жидкостях, может быть использовано, например, единственное антитело или множество антител в форме многослойного иммуносэндвича. При обнаружении ICAM-4 в жидкости организма антитела по данному изобретению также используются для анализа проявления невропатологий, которые могут соотноситься с повышенными уровнями циркулирующего ICAM-4. Такие нейропатологии включают (но не ограничиваются) церебральную ишемию (т.е. приступ), являющуюся результатом различных нарушений, включающих, например, тромбоз, эмболию и т.п.

Очевидна научная ценность информации, полученной при раскрытии сущности ДНК- и аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению. Как показано на ряде примеров, знание последовательности кДНК для ICAM-4 делает возможным выделение, посредством гибридизации ДНК/ДНК, последовательностей геномных ДНК, кодирующих ICAM-4, и определение регуляторных последовательностей контроля экспрессии ICAM-4, таких как промоторы, операторы и т.п. Ожидается, что методы гибридизации ДНК/ДНК, осуществляемые при помощи последовательностей ДНК по данному изобретению и при соблюдении жестких условий, позволят выделять ДНК, кодирующие аллельные варианты ICAM-4, другие структурно родственные белки, обладающие одним или более биологическими и/или иммунологическими свойствами, специфическими для ICAM-4, и белки, гомологичные ICAM-4, из других видов. ДНК по данному изобретению используются при анализе гибридизации ДНК/РНК для определения способности клеток к синтезированию ICAM-4. Данным изобретением обеспечивается также наличие десенсибилизирующих полинуклеотидов, релевантных регулированию экспрессии ICAM-4 такими клетками, которые первоначально выражали то же самое. Как видно из другого ряда примеров, знание ДНК- и аминокислотных последовательностей ICAM-4 делает возможным образование посредством рекомбинантных средств вариантов ICAM-4, таких как гибридные слитые белки (которые иногда относят к "иммуноадгезивам"), характеризующиеся наличием последовательностей белков ICAM-4 и константных областей тяжелых цепей иммуноглобулина и/или шарнирных областей. [См. Capon tn al. , Nature, 337: 525-531 (1989); Ashkenazi et al., P.N.A.S.(USA), 88: 10535-10539 (1991) и заявка PCT WO 89/02922, опубликованная 6 апреля 1989 г. ] Слитые белки могут также включать, например, выбранные внеклеточные домены ICAM-4 и части других факторов клеточной адгезии.

ДНК по настоящему изобретению также позволяет осуществлять идентификацию нетранслированных последовательностей ДНК, которые специфически стимулируют экспрессию полинуклеотидов, соединенных в действии с промоторными областями. Идентификация и использование таких промоторных последовательностей особенно желательны в случаях, например, переноса генов, который может требовать конкретно гетерогенной экспрессии в ограниченной нейронной среде. В изобретении также рассматриваются векторы, содержащие промоторы по данному изобретению, а также конструкции рекомбинантных генов, в которых промотор по данному изобретению связан в действии с гетерогенной полинуклеотидной последовательностью и сигналом терминации транскрипции.

Информация о ДНК- и аминокислотных последовательностях, полученная в соответствии с данным изобретением, также дает возможность систематического анализа структуры и функции ICAM-4 и определения тех молекул, с которыми он будет взаимодействовать на внеклеточном и внутриклеточном уровнях. Идиотипы моноклональных антител ICAM-4 по настоящему изобретению характерны для таких молекул и могут имитировать естественные связывающие белки (пептиды и полипептиды), посредством которых модулируются межклеточные и внутриклеточные активности ICAM-4, или при помощи которых ICAM-4 модулирует межклеточные и внутриклеточные явления. В альтернативном варианте они могут представлять новые классы модуляторов активностей ICAM-4. Антиидиотипические антитела, в свою очередь, могут представлять новые классы биологически активных эквивалентов ICAM-4. Анализ in vivo для идентификации антител или других соединений, которые модулируют активность ICAM-4, может включать, например, иммобилизацию ICAM-4 или естественного лиганда, с которым связан ICAM-4, маркирование при выявлении неиммобилизированного связывающего партнера, совместное инкубирование связывающих партнеров и определение влияния соединения, полученного при исследовании, на величину границы метки, когда уменьшение границы метки в присутствии полученного соединения, по сравнению с величиной границы метки в отсутствие полученного соединения, указывает на то, что испытываемое вещество является ингибитором связывания ICAM-4.

Информация о последовательностях ДНК, полученная в соответствии с данным изобретением, делает также возможным развитие посредством гомологической рекомбинации или принципа ударной сепарации частиц [см. Kapecchi, Science, 244: 1288-1292 (1989)] родентов, которые не могут выражать белок функционального ICAM-4 или которые выражают белок вариантного ICAM-4. Такие роденты используются как модели для изучения активностей ICAM-4 или модуляторов ICAM-4 in vivo.

В описание включены ссылки на родовую патентную заявку США N 08/102852, поданную 5 августа 1993 г. Примеры этой заявки касаются, в числе прочего, следующего: разработка и конструкция олигонуклеотидных зондов для PCR-амплификации ICAM-ассоциированных ДНК; использование зондов для амплификации геномного фрагмента человека, гомологичного, но отличающегося от ДНК, кодирующих ICAM-1 и ICAM-2; скрининг библиотек кДНК с геномными фрагментами для выделения дополнительных кодирующих ICAM-R последовательностей; скрининг библиотек кДНК для выделения полномерной последовательности человеческой кДНК, кодирующей ICAM-R; исследование информации о ДНК- и аминокислотных последовательностях для ICAM-R, особенно в отношении ICAM-1 и ICAM-2; развитие клеток-хозяев млекопитающего, выражающих ICAM-R; оценка указаний об участии ICAM-R в явлениях адгезии с участием CD18-зависимых и CD18-независимых путей; подавление клеточной адгезии с ICAM-R посредством извлеченных из ICAM-R пептидов; экспрессия вариантов ICAM-R; подготовка и исследование антител анти-ICAM-R и их фрагментов; картирование эпитопов ICAM-R, распознанных моноклональными антителами анти-ICAM-R; оценка распределения и биологическое исследование ICAM-R и РНК, кодирующих одно и то же; оценка ICAM-R в гомотипической межклеточной адгезии и иммунной клеточной активации/пролиферации; исследование моноклональных антител ICAM-R; оценка различных фосфориляционных и цитоскелетных ассоциаций цитоплазматического домена ICAM-R. Также была описана идентификация кодирующей родентный ICAM ДНК, которая оказалась на этот раз крысиным гомологом человеческого ICAM-R, и использование этой ДНК для конструирования и выражения ДНК, кодирующих слитые белки глутатион-S-трансферазы. Подробное описание идентификации этой родентной ДНК можно найти в родовой заявке (U. S.S. N 08/102852) в примере 6, и оно воспроизводится здесь в примере 1. Когда были идентифицированы другие последовательности, кодирующие родентный ICAM, стало очевидно, что ДНК родентного ICAM не кодирует крысиный гомолог человеческого ICAM-R, но, фактически, кодирует новый полипептид ICAM, названный ICAM-4. Чтобы оценить явления, которые привели к идентификации ICAM-4, соблюдается хронология, сопровождаемая детальным описанием изобретения.

Была идентифицирована первая последовательность родентного геномного ICAM-4, которая кодировала область, гомологичную домену 2 (здесь SEQ ID N 3 и SEQ ID N 23 в U.S.S. N 08/102852) человеческого ICAM-R (здесь SEQ ID N 4). Была также идентифицирована вторая, перекрывающая геномная ДНК (здесь SEQ ID N 5 и SEQ ID N 26 в U.S.S. N 08/102852), которая кодировала как область домена 2 в соответствии с SEQ ID N 3, так и последовательности для ICAM-1. Используя SEQ ID N 3 как зонд, была идентифицирована родентная кДНК селезенки (здесь SEQ ID N 6, SEQ ID N 25 U.S.S. N 08/102852), которая кодировала домены 2-5, а также пятый домен, ранее не наблюдавшийся как домен ICAM. На этот раз вновь идентифицированные родентные ДНК кодировали родентный гомолог человеческого ICAM-R, однако сравнительный анализ 3' областей этих ДНК с другими ICAM оказался затруднительным.

Последующее выделение клона ДНК в 1 kb из библиотеки крысиной селезенки и амплификация фрагмента RT-PCR показали, что часть как клонов кДНК, так и геномных клонов не были секвенированы. Другой продукт амплификации RT-PCR (SEQ ID N 7) подтвердил это. Было установлено, что фрагмент из 177 bp был удален из геномных клонов и клонов кДНК посредством EcoRI-гидролиза клонов, чтобы выделить эти последовательности из - фага для изучения секвенирования ДНК. Повторный анализ SEQ ID N 5 и 6 в свете этих других последовательностей позволил идентифицировать более точные и полные последовательности для первоначально выделенных геномных клонов и клонов кДНК, представленных здесь в исправленном виде в SEQ ID N 8 и 9.

Чтобы идентифицировать полную кодирующую последовательность для ICAM-4, была выделена кДНК головного мозга крысы (SEQ ID N 10) и определена 5' концевая последовательность посредством 5' быстрой амплификации концов кДНК (5' RACE); продукт амплификации представлен в SEQ ID N 11. Объединение информации клона RT-PCR (SEQ ID N 7), кДНК головного мозга (SEQ ID N 10) и продукта амплификации RACE (SEQ ID N 11) позволило идентифицировать полную кодирующую последовательность для ICAM-4 (SEQ ID N 1).

Таким образом, настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами. Более конкретно. Пример 1 относится к клонированию ДНК частично родентного ICAM-4. В примере 2 представлен анализ методом назерн-блоттинга транскрипции родентного ICAM-4. В примере 3 показано выделение кДНК полномерного родентного ICAM-4. Пример 4 относится к гибридизации in situ родентного ICAM-4 в мозговой ткани. Пример 5 относится к образованию слитых белков ICAM-4 в прокариотах. В примере 6 описано получение моноклональных антител, специфических для крысиных слитых белков ICAM-4/GST. В примере 7 описана экспрессия растворимых крысиных белков ICAM-4 методом бакуловирусной экспрессии. Пример 8 относится к получению моноклональных антител, специфических для крысиных ICAM-4, выраженных бакуловирусным методом. В примере 9 описан иммуноцитохимический анализ экспрессии крысиного ICAM-4. Пример 10 относится к клонированию человеческой геномной ДНК, кодирующей ICAM-4. Пример 11 относится к клонированию человеческой кДНК, клонирующей ICAM-4. В примере 12 описан назерн-анализ экспрессии человеческого ICAM-4. В примере 13 описано образование человеческих слитых белков ICAM-4/GST. Пример 14 относится к получению моноклональных антител, иммунологически специфических для человеческого ICAM-4. В примере 15 описано развитие анализа захватом для определения концентрации растворимого ICAM-4 в конкретной жидкости. В примере 16 показано применение метода анализа захватом для определения концентрации ICAM-4 в серозной жидкости больных припадками. Пример 17 относится к анализу транскрипции ICAM-4 в модели крысиной эпилепсии. Пример 18 относится к клонированию области промотора для человеческого ICAM-4.

ПРИМЕР 1. Клонирование крысиной ICAM-ассоциированной ДНК.

A. Выделение крысиной геномной ICAM-ассоциированной ДНК домена 2.

Крысиная геномная библиотека, сконструированная в EMBL3, была проверена при помощи [³²P]-меченого зонда, полученного посредством PCR из ДНК, кодирующей домен 2 человеческого ICAM-3. Последовательность зонда представлена в SEQ ID N 12. Пятна библиотеки были перенесены на Hybond N+ найлоновые мембраны (Amercham, Arlington Heights, IL). Скрининг всех кДНК и геномных библиотек был проведен в соответствии со стандартными протоколами. Предгибридизация и гибридизации были проведены в растворе 40-50% формамида, 5X Denhardt's, 5X SSPE и 1,0% SDS при 42^oC. Зонды ([³²P] -меченые) были добавлены при концентрации раствора гибридизации 10⁵-10⁶ cpm/ml. После этого в течение 16-18 часов гибридизации найлоновые мембраны подвергались экстенсивному промыванию при комнатной температуре в растворе 2X SSPE с 0,1% SDS, а затем подвергнуты воздействию рентгеновской пленки при -80^oC в течение ночи. Положительные пятна были подвергнуты одному или более циклам гибридизации, чтобы получить клональный фаг. ДНК, приготовленная из лизата позитивных клонов, была субклонирована в pBS+ и секвенирована.

Был идентифицирован первый геномный клон, кодирующий крысиный ICAM-ассоциированный домен 2, который был определен как гомологичный областям домена 2 в других членах семейства ICAM (см., например, табл. 1 патентной заявки США N 08/102852), но отличался от ранее известных нуклеотидных последовательностей для крысиного ICAМ-1 [Kita et al., Biochem. Biophys. Acta, 1131: 108-110 (1992)] или мышиного ICAM-2 [Xu et al., J.Immunol., 149: 2560-2565 (1992)] . Нуклеиновокислотные и установленные аминокислотные зависимости для этого клона были описаны в одновременно поданных родовых заявках как вариантные формы крысиного ICAM-R и были представлены как SEQ ID N 23 и 24 соответственно в U. S.S. N 08/102852. В данной заявке эти же последовательности представлены в SEQ ID N 3 и 13 соответственно.

Второй, перекрывающий клон был также идентифицирован с теми же зондами и был определен как содержащий последовательность домена 2 ICAM (SEQ ID N 3) и 5' ДНК, кодирующую, по крайней мере, часть крысиного ICAM-1. Нуклеиновокислотная последовательность для этого клона была представлена в одновременно поданной родовой заявке как SEQ ID N 26, а в данной заявке - как SEQ ID N 5. Этот второй клон показал, что фрагмент ICAM-ассоциированного гена первого клона и ген, кодирующий крысиный ICAM-1, расположены на одной и той же хромосоме крысы в пределах 5 kb друг от друга.

B. Выделение крысиной, ICAM-ассоциированной кДНК.

Чтобы идентифицировать более полную, кодирующую белок последовательность для ICAM-ассоциированного полипептида, [³²P]-меченая ДНК, кодирующая последовательность домена 2 из крысиного геномного клона, идентифицированного в Секции A (SEQ ID N 3), как указано выше, была использована для скрининга части библиотек кДНК из различных типов клеток крыс и мышей, включая крысиный макрофаг (Clontech. Palo Alto, CA), лимфоцит периферической крови (PBL) (Clontech), T-клетку (сконструированную внутри) и B-клетку (сконструированную внутри).

Был идентифицирован единичный клон в библиотеке кДНК крысиной селезенки (Clontech), который содержал пять Ig-подобных доменов, четыре из которых были гомологичными доменам 2-5 как в ICAM-1, так и в ICAM-R. Более того, этот клон включал 3' ДНК, кодирующую явный пятый Ig-подобный домен, который не был ранее идентифицирован в каком-либо другом полипептиде ICAM. Кроме того, клон содержал необычную 3' последовательность, определенную впоследствии как частичный интрон (описан ниже), расположенный между доменами 4 и 5, что дает возможность предположить, что клон являлся продуктом неразвитого транскрипта или транскрипта, полученного при отклоняющемся от нормы сплайсинге. Присутствие уникального домена и определение того факта, что 3' область не сравнивалась должным образом с другими известными ICAM, дало возможность предположить, что ICAM-ассоциированная ДНК может кодировать новый крысиный полипептид ICAM. Нуклеиновокислотная последовательность для этого клона была представлена в родственной заявке как SEQ ID N 25; в данной заявке нуклеиновокислотная последовательность для этого клона кДНК селезенки представлена в SEQ ID N 6.

C. Повторный анализ крысиной кДНК и геномных ДНК.

После подачи 5 августа 1993 г. патентной заявки США N 08/102852 было определено, что в частичном клоне кДНК крысиной селезенки (SEQ ID N 25 в родовой заявке и SEQ ID N 6 в данной заявке) и геномном клоне крысиной печени (SEQ ID N 26 в родовой заявке и SEQ ID N 5 в данной заявке) был пропущен внутренний фрагмент EcoRI в 177 bp, который являлся частью каждого из этих клонов, но был потерян на стадии субклонирования, когда вставки библиотеки были удалены из -вектора гидролизом EcoRI и лигированы в секвенирующий вектор. Предположение о том, что в клоне ДНК и геномном клоне мог быть пропущен кодирующий фрагмент, стало очевидно при сравнении крысиных геномной и ДНК-последовательностей с различными продуктами амплификации RT-PCR, включая SEQ ID N 7, которая обнаружила разрыв в крысиной последовательности.

Последующее выделение и сравнительный анализ последовательностей кДНК из библиотеки селезенки с использованием клона кДНК селезенки (SEQ ID N 6) как зонда дали возможность впервые определить, что часть клонов кДНК селезенки и геномного не была секвенирована. Дальнейшее подтверждение этого предположения стало очевидным при амплификации фрагмента RT-PCR, охватывающего домены 3-5, с использованием 5' праймера (RRD3 5' Xho, содержащего 5' XhoI сайт рестрикции для облегчения клонирования), представленного в SEQ ID N 14, и 3' праймера (RRD5 3' Hind, включающего сайт HindIII для облегчения клонирования), представленного в SEQ ID N 15.

GAACTCGAGGCCATGCCTCCACTTCC (SEQ ID N 14) CCATAAGCTTTATTCCACCGTGACAGCCAC (SEQ ID N 15) Сравнительный анализ этих двух ДНК ясно показал, что в клонах ДНК и геномном был утерян фрагмент перед секвенированием; это предположение нашло дальнейшее подтверждение в ходе секвенирования ДНК RT-PCR (описано ниже). Был сделан вывод, что гидролиз с EcoRI для удаления кДНК- и геномного фрагментов перед секвенированием имел своим результатом удаление фрагмента из 177 bp, который не был определен визуально при выделении клонов агарозным гелем из последовательностей - фага. Последующий анализ последовательностей подтвердил расположение двух сайтов EcoRI, примыкающих к фрагменту из 177 bp в обоих первоначальных клонах.

Фрагмент EcoRI из 177 bp расположен между нуклеотидами 719 и 896 в крысином частичном клоне кДНК, как представлено в SEQ ID N 9, и между нуклеотидами 2812 и 2989 в частичном геномном клоне, как представлено в SEQ ID N 8.

D. ДНК, выявленная клоном RT-PCR.

RT-PCR использовалась для получения более полной информации последовательности для крысиного, ICAM-ассоциированного гена. Информация последовательности из геномного клона (SEQ ID N 3) была использована для конструирования сенсибилизирующих праймеров, комплементарных 5' области из кодирующей белок области, как определено из клона кДНК, и десенсибилизирующих праймеров, комплементарных кодирующим последовательностям и 3' областям, к кодирующей последовательности в клоне кДНК (SEQ ID N 6).

кДНК темплаты для реакций PCR была приготовлена следующим образом. Приблизительно 2 мкг поли-A⁺ РНК, выделенной из клеток крысиной селезенки, было денатурировано нагреванием при 65^oC в объеме 10 мкл. После денатурации было добавлено 0,1 мкл RNasin (Invitrogen, San Diego, CA), 5 мкл 5X RTase Buffer (BRL, Bethesda, MD), 2 мкл произвольного гексамера pd(N)6 при 100 мкг/мл (Pharmacia, Piscataway, NJ), 6 мкл dNTPs (каждого по 2 мМ) и 2 мкл AМV RTase (BRL), и реакция была инкубирована при 42^oC в течение 60-90 минут. Реакции хранились при 20^oC до нужного времени.

Первоначальная серия экспериментов проводилась для идентификации пар праймеров олигонуклеотидов, которые вырабатывали продукт амплификации в реакциях PCR с использовавшем кДНК крысиной селезенки как темплаты. Различные 5' сенсибилизирующие праймеры подбирались в PCR в пару с 3' праймером, который был сконструирован комплементарным внутренней, кодирующей последовательности; 3' праймер был обозначен RRD2 3-1 и представлен в SEQ ID N 16.

AACGTGCGGAGCTGTCTG (SEQ ID N 16) (В полностью выделенном продукте RT-PCR (SEQ ID N 7, приведенная ниже) праймер RRD2 3-1 соответствовал нуклеотидам 719-736). Подобным образом, различ