Способ определения жизнеспособности эмбрионов

Реферат

 

Способ определения жизнеспособности эмбрионов относится к сельскому хозяйству и может быть использован при трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения заключается в том, что качество эмбриона оценивают дважды: до замораживания, затем после замораживания и оттаивания и по результатам сравнения этих оценок определяют жизнеспособность эмбриона. К жизнеспособным относят эмбрионы, которые не изменили своей оценки в процессе криоконсервации. Способ позволяет повысить точность определения жизнеспособности эмбрионов при замораживании и по степени изменения их качества прогнозировать результаты приживляемости после нехирургической трансплантации. Способ также дает возможность использовать эмбрионы с оценкой 3 балла для замораживания. 2 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано при трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных.

Для обеспечения высокой эффективности метода трансплантации эмбрионов в селекционных программах необходимо с высокой степенью точности прогнозировать приживляемость их после нехирургической трансплантации.

Однако до сих пор не существует объективных и вместе с тем простых методов определения качества эмбрионов и прогнозирования их выживаемости.

Существуют методы оценки качества эмбрионов in vitro, которые предполагают использование красителей, выявляющих ферментную активность (флуоресцин-диацетат) (2) или специальной метки, определяющей повреждение мембран при дефектных состояниях эмбриональных клеток (3). Однако эти методы не лишены недостатков, так как дополнительные манипуляции с эмбрионами в процессе их оценки могут стать причиной снижения или полной потери способности их к дальнейшему развитию, кроме того, они требуют дополнительных затрат на реактивы и усилий специалистов.

Более близким к предлагаемому является метод временного культивирования эмбрионов in vitro в лабораторных условиях для уточнения оценки качества по морфологическим критериям (1). Работу по оценке эмбриона проводят под стереомикроскопом с увеличением в 60-80 раз, учитывая стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяют морфологию зародышей и, исходя из этих критериев, оценивают качество зародыша и его пригодность для дальнейшего использования. Культивирование проводят в термостате при температуре 37oC в течение 24-48 часов. После этого проводят вторую оценку их жизнеспособности под микроскопом. Эмбрионы, развившиеся соответственно ожидаемой стадии считают пригодными для целей трансплантации. К недостатку приведенного способа относятся дополнительные затраты времени и длительное нахождение эмбриона вне организма, что может привести к повреждениям его структур и снижению жизнеспособности.

Целью изобретения является повышение точности определения жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота.

Поставленная цель достигается тем, что после морфологической оценки извлеченных эмбрионов их замораживают до температуры минус 196oC, затем оттаивают и проводят повторную морфологическую оценку их качества. При этом учитывают изменение балльной оценки после оттаивания по сравнению с оценкой до замораживания.

Сущность способа заключается в том, что к жизнеспособным относят те эмбрионы, которые в процессе замораживания и оттаивания не снизили своей оценки.

Предлагаемый способ повышает точность определения жизнеспособности эмбрионов при замораживании и позволяет по степени изменения их качества прогнозировать результаты приживляемости после нехирургической трансплантации.

Вместе с тем, данный способ позволяет повысить эффективность метода трансплантации эмбрионов при размножении животных выдающихся генотипов, поскольку дает возможность использовать все полученные эмбрионы, включая и зародыши с оценкой качества 3 балла (табл. 1). По ныне действующей инструкции эмбрионы с оценкой 3 балла считаются непригодными для замораживания и подлежат выбраковке.

В связи с тем, что повторную оценку качества эмбрионов проводят после оттаивания, жизнеспособность эмбрионов можно определять непосредственно перед пересадками в удобное для этого время, исключая длительный процесс культивирования вне организма (24-48 час.). Кроме того, эмбрион в замороженном состоянии может находится длительное время, не теряя своей жизнеспособности.

Так как определение жизнеспособности в заявленном способе не зависит от перехода одной стадии развития в другую и способ позволяет определить жизнеспособность эмбрионов на любой стадии, включая позднюю бластоцисту, точность предлагаемого способа значительно выше по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: эмбрионы крупного рогатого скота в возрасте 7-8 дней после нехирургического извлечения оценивают по стадии развития и морфологическим критериям по 4-х балльной шкале ("Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота", М., 1987). Затем их замораживают в среде Дюльбекко с 20% фетальной сыворотки теленка с использованием в качестве криопротектора 1,5М раствора глицерина в программируемом замораживателе ЭМБИ-К ("Методические рекомендации по замораживанию, хранению и оттаиванию эмбрионов крупного рогатого скота", М., 1991). Перед пересадками эмбрионы оттаивают, удаляют криопротектор и проводят повторную оценку по морфологическим критериям. На основании морфологического строения стадии развития и соответствия ее возрасту эмбрионы делят на категории (баллы): - отличный (5) эмбрион идеальный, сферический, симметричный, с клетками одного размера, цвета и плотности, стадия развития соответствует возрасту; - хороший (4) - эмбрион имеет незначительные изъяны, такие как несколько бластомеров, выделившихся из общей массы в перивителлиновое пространство, неправильную форму клеточной массы, несколько вакуолей, стадия соответствует возрасту; - удовлетворительный (3) - морфологическое строение имеет серьезные замечания: присутствие разрушенных бластомеров, сильная вакуолизация, неоднородное окрашивание, низкая плотность клеточной массы, наличие множества клеток в перивителлиновом пространстве, отставание развития до 24 часов; - плохой (2) - многочисленные вытесненные из общей массы бластомеры, нарушение межклеточных связей, дегенерированные клетки, клетки различного размера, много крупных вакуолей и гранул, отставание развития более 24 часов. Такие эмбрионы выбраковывают. В соответствии со степенью снижения качества эмбрионов после оттаивания по сравнению с качеством до замораживания определяют их дальнейшую жизнеспособность.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

В хозяйствах Московской области проведены пересадки эмбрионов нехирургическим методом животным-реципиентам. В реципиенты подбирали телок случного возраста (17-20 мес.) с живой массой 360-380 кг. Группы животных были сформированы по методу групп-аналогов. Все пересадки и манипуляции с эмбрионами проведены одними и теми же специалистами. Одной группе реципиентов пересажены эмбрионы, не изменившие своей качественной оценки после замораживания-оттаивания. Второй группе телок пересадили эмбрионы, которые после оттаивания снизили оценку на 1 балл, третьей группе животных пересадили зародыши со снижением качества более 1 балла (табл. 2). При неизменном качестве эмбрионов после криоконсервации их приживляемость составила 56,9%, тогда как при снижении качества на 1 балл стали стельными 43,1% реципиентов, а при снижении качества более 1 балла прижилось только 29,3% эмбрионов. То есть, при снижении балльной оценки после замораживания-оттаивания жизнеспособность эмбрионов также снизилась на 13,8% и 27,6% соответственно.

Из полученных данных следует, что жизнеспособность эмбрионов обратно пропорциональна степени снижения их качества после замораживания-оттаивания. Коэффициент корреляции составляет - 0,98 (p<0,001). При снижении балльной оценки приживляемость эмбрионов снизилась на статистически достоверную величину.

Формула изобретения

Способ определения жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота, включающий проведение двух оценок качества эмбриона, разделенных интервалом времени, и определение его жизнеспособности по результатам сравнения этих оценок, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, качество эмбриона оценивают повторно после замораживания и оттаивания, и к жизнеспособным относят эмбрионы, которые не изменили своей оценки в процессе криоконсервации.

РИСУНКИ

Рисунок 1