Способ определения присутствия или отсутствия активности в ингибировании агрегации тромбоцитов (ра1), очищенный и выделенный ингибитор активности тромбоцитов (ра1) и/или укороченная его форма, способ очистки ра1 из змеиного яда, фармацевтическая композиция для предотвращения образования тромба, способ ингибирования образования тромба

Способ определения присутствия или отсутствия активности в ингибировании агрегации тромбоцитов (ра1), очищенный и выделенный ингибитор активности тромбоцитов (ра1) и/или укороченная его форма, способ очистки ра1 из змеиного яда, фармацевтическая композиция для предотвращения образования тромба, способ ингибирования образования тромба

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается способа оценки змеиного яда на присутствие или отсутствие агрегации тромбоцитов (PA1), основанного на специфическом связывании с рецептором очищенного и выделенного из змеиного яда РА1 и его укороченной нормы, способа выделения РА1 из змеиного яда и фармацевтической композиции на его основе. Сущность: изобретение включает способ определения в змеином яде способности ингибировать агрегацию тромбоцитов, способ очистки ингибитора активности тромбоцитов из различных образцов змеиного яда, его характеристику и усеченную форму, содержащую модифицированный остаток лизина, которая специфически ингибирует связывание фибриногена или фактора фон Виллебранда с GPIIb-IIIа. Преимущество изобретения заключается в получении терапевтических агентов, способных к блокированию или ингибированию образования тромбов без опасности гемостаза. 13 с. и 32 з.п.ф-лы, 4 табл., 43 ил.

Изобретение относится к группе пептидов, которые представляют собой или являются родственными ингибиторам агрегации тромбоцитов, выделенных и очищенных из различных змеиных ядов. Эти пептиды полезны как терапевтические агенты для лечения и предупреждения связанных с тромбоцитами ишемических заболеваний. Точнее, изобретение касается пептидов, которые блокируют специфические рецепторы для адгезивных протеинов, включаемых в адсорбцию и агрегацию тромбоцитов. Кроме того, это изобретение описывает способы обнаружения и очистки вышеупомянутых пептидов из змеиных ядов до значительной гомогенности, а также способы использования первичных аминокислотных последовательностей этих полипептидов для получения активных пептидов как синтетических, так и с использованием методик рекомбинантной ДНК.

Основание изобретения Сердечные заболевания являются главной причиной смерти в большинстве западных стран. Смерть от сердечных заболеваний часто вызываются тромбоцитозависимыми ишемическими синдромами, которые инициируются атеросклерозом и артериосклерозом и включают, но не ограничиваются, острый инфаркт миокарда, хроническую изменчивую ангину, транзиторные ишемические атаки и приступы, периферические сосудистые нарушения, артериальные тромбозы, преэклампсия, эмболия и/или тромбоз после ангиоплатики, каротидной эндартеректомии, анастомоза сосудистых трансплантантов и застарелых сердечно-сосудистых аппаратов /например, "in dwelling" катетеры или шунты "аппаратов эктракорпорального циркулирования"/. Эти синдромы представляют разнообразие стенозированных и обтурирующих сосудистых нарушений, которые, как полагали, инициируются активацией тромбоцитов либо на стенках сосуда, либо внутри просвета при помощи "blood-borne" медиаторов, но проявляются путем агрегатов тромбоцитов, которые образуют тромб, ограничивающий кровяной поток.

Были проведены многочисленные исследования для понимания механизма образования агрегатов тромбоцитов и тромбов. Тромбоциты реагируют на различные повреждения кровяных сосудов, такие как сужения просвета, образование бляшек и присутствие инородных тел /например, катетеров/ и тому подобное. Реакцией тромбоцитов на эти повреждения является последовательность событий, включающих адгезию и активацию, и выделение тромбоцитных гранулярных компонентов, включая возможные клеточные митогенные факторы. Активированные агрегаты тромбоцитов вызывают образование фибрина, который далее стабилизирует тромб.

В настоящее время многое известно о механизмах, регулирующих эти реакции. Хотя нестимулированные тромбоциты содержат рецепторы для нескольких адгезивных протеинов, включая ламинин /VLA2, VLA6/ и коллаген /VLA2, GPIV и другие/, первоначальное присоединение тромбоцитов к субэндотелиальному слою, как полагали, является промежуточным звеном при связывании гликопротеина мембраны тромбоцита /GP/ Ib с иммобилизованнным фактором фон Виллебранда. Последующая активация тромбоцита может быть инициирована при помощи одного или более известных физиологических веществ, обладающих сродством к рецептору, включая: ADP, адреналин, тромбин, коллаген и тромбоксан A2.

Агрегация тромбоцитов медиируется GP IIb-IIIa комплексом на поверхности мембраны тромбоцита. GP IIb-IIIa существует на поверхности нестимулированных тромбоцитов в неактивной форме. Когда тромбоциты активируются путем адгезии и физиологических агонистов, GP IIb-IIIa также становится активированным, таким, что он становится рецептором для фибриногена /Fg/, фактора фон Виллебранда /VWF/ и фибронектина /Fn/ /смотри Phillips et al., Blood /1988/ 71, 831-843/, однако это представляет собой связывание фибриногена и/или фактора фон Виллебранда, что, как предполагают, в основном является ответственным за агрегацию тромбоцитов и образование тромба in vivo. Поэтому вещества, которые специфически ингибируют связывание фибриногена или фактора фон Виллибранда с GP IIb-IIIa, ингибируют агрегацию тромбоцитов и могли бы быть кандидатами для ингибирования образования тромба in vivo.

В настоящее время известно, что GP IIb-IIIa тромбоцитов является членом суперсемьи структурно связанных рецепторов адгезии протеинов, известных в совокупности как "интегрины". Как до сих пор известно, все интегрины, аналогично GP IIb-IIIa, представляют собой две субъединичные молекулы с большей альфа-субъединицей /например, GP IIb/ и меньшей бэта-субъединицей /например, GP IIIa/. Имеется высокая степень гомологии между известными последовательностями субъединиц интегрина, показывающая, что интегрины эволюционировали из обычных предшественников. Интегрины функционируют в целом ряде клеточных адсорбций и были найдены в лейкоцитах, эндотелиальных клетках, гладких мышечных клетках и других клетках в сосудистой сети. Поскольку интегрины широко распределяются, в то время как GP IIb-IIIa ограничиваются тромбоцитами, предпочтительный антиагрегирующий агент ингибировал бы селективно GP IIb-IIIa в противоположность другим интегринам.

Было описано несколько классов пептидов, которые блокируют связывание адгезивных протеинов с активированными тромбоцитами и ингибируют агрегацию тромбоцитов /смотри Hawiger et al., патент США 4661471 и Rouslahti et al., патенты США 4614517, 4578079, 4792525 и заявка Великобритании GB 2207922 A/. В одном классе пептидов последовательность RGD является решающей тетрапептидные последовательности RGDS, RGDT, RGDC, в частности, были использованы. Аминокислотная последовательность RGDK найдена в целом ряде адгезивных протеинов, включая Fg, Vn, vWF и Fn. Было показано, что эта последовательность играет важную роль в взаимодействии адгезивных протеинов с рецепторами адгезивного протеина, так как пептиды, содержащие эту последовательность, блокируют связывание адгезивных протеинов. Смотри, например, Pierschbacher M.D., et al., J. Biol. Chem. /1987/, 262, 17294-17298, Ruggeri et al., Proc. Natt. Acad. Sci (USA) /1986/ 83: 5708-5712, и Rouslanti et al., Cell /1986/ 44: 517-518. Тетрапептиды, содержащие эту последовательность, описываются в заявке на Европейский патент 319506, опубликованной 7 июня 1989. Короткие пептиды, содержащие гомоаргинин вместо аргинина в RGD-последовательностях, раскрываются в PCT заявке W089/07609, опубликованной 24 августа 1989 года.

Структурные изменения, разрешенные в RGD-содержащих пептидах, были изучены Pierschbacher M.D. et al., J. Biol. Chem. /супра/. В этих работах было найдено, что манипулирование RGD-содержащей последовательностью не только влияла на активность, связанную с ингибированием связывания фибронектина или витронектина с субстратом, но могла осуществлять дифференциацию между связыванием двух лигандов. Пептидная последовательность GRGDSPC, которая была взята из клеточного домена фибронектина, использовалась в качестве модельного пептида. Оказывается, что некоторые замещения, такие как замена L-Arg на D-Arg, не оказывает воздействия на связывание любого лиганда, но замещение D-Ala на Gly или D-Asp на Z-Asp уничтожает ингибирующую активность. В то время как замещение D-Ser на Z-Ser понижало ингибирование взаимодействия витронектина с рецептором витронектина, наблюдалось незначительное влияние на взаимодействие фибронектина c рецептором фибронектина, замещение Asn на Ser приводило к пептиду, который имел усиленное ингибирование связывания фибронектина и пониженный эффект на связывание витронектина. Иные замещения на Ser имели другие эффекты. Треонин, замещенный на Ser, давал пептид с повышенным ингибированием связывания с рецептором витронектина, замещение L-Pro приводило к неактивному пептиду. Циклический пептид был также получен из последовательности Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys-Ala, где "Pen" представляет собой пеницилламин и дисульфидный мостик был образован между Pen и Cys. По мнению авторов, пеницилламин имел функцию повышения конформационных ограничений на цикл, тогда как N-терминальный Gly и карбокси-терминальный Ala были добавлены к расстоянию свободной амино и карбоксильной групп от цикла. Этот циклический пептид был способен ингибировать связывание витронектина более сильно, чем тот же самый пептид до циклизации, но был неэффективным в ингибировании связывания фибронектина.

Недавно в Samanen J. , et al., J. Cell Biochem. /1990/ Suppl. 14:А229 было сообщено об антимикробном пептиде с модификацией RGD-последовательности, имеющей "R" алкилированный остаток. Обзор, посвященный соотношению структура - активность в RGD-содержащих пептидах, был опубликован Azi F.E. et al. , в Proc. 11-th Am. Peptide Symp., Marshall et al., ed ESCOM, Zeiden 1990.

Публикация заявки на Европейский патент N 341915, опубликованная 15 ноября 1989 года, раскрывает две группы пептидов, одного линейного и другого циклического, которые, как указывается выше, связывают GP IIb-IIIa рецепторы тромбоцитов и таким образом ингибируют его способность связывать vWF, фибронектин и фибриноген-фибрин. Не имеется данных, которые относятся к специфичности связывания этих пептидов. Группа циклических пептидов включает модификации RGD-последовательности, в которой R замещается на D или Z гомоаргинин, диметил или диэтиларгинин, лизин или альфа-алкилированное производное этих остатков. Минимальные циклические структуры включают в себя просто "R" GD последовательность, заключенную между двумя остатками, которые образуют дисульфидный мостик.

Отдельный класс ингибиторных пептидов использует пептидные последовательности, смоделированные на карбоксильной терминальной последовательности, полученной из гамма цепи фибриногена, додекапептид HHL GGAQKAGDV (Kloczewiak et al., Biochemistry /1989/ 28: 2915-2919; Timmons et al. (ibid), 2919-2923; патент США 4661471 /супра/; заявка на Европейский патент 298820). Хотя эта последовательность ингибирует связывание Fg и vWF с GP IIb-IIIa и последующую агрегацию тромбоцитов, полезность этого пептида ограничена из-за его низкой афинности взаимодействия с рецепторами тромбоцита /IC₅₀ = 10 - 100 мкМ/.

Недавно несколько групп выделили и охарактеризовали новый класс полипептидного действующего начала с низким молекулярным весом, которое имеет чрезвычайно высокую афинность для GP IIb-IIIa комплекса. Huang T-F. et al., J. Biol. Chem. /1987/ 262: 16157-16163, Huang T-F. et al., Biochemistry /1989/ 28: 661-666 сообщают первичную структуру триграмина, 72-аминокислотный пептид, содержащий RGD и 6 дисульфидных мостиков, выделенный из Frimeresurus gramineus. Gan Z-R. et al., J. Biol. Chem. /1989/ 263: 19827-19832, сообщают свойства и структуру эхистатина, 49-аминокислотного пептида, также содержащего RGD, и 4 предполагаемых дисульфидных мостика, который выделяется из Echis carenatus willianes, J. A. et al., FASEB Journal /1989/ 3: А310 Abstr 1487 m, сообщают последовательность и свойства родственных пептидов элегантина, алболабрина и флавовиридина. Кроме того, характеристика битистатина была сообщена Shebuski R. J. et al., J. Biol. Chem. /1989/ 264: 21550-21556 и PAI из Agkistrodon piscivorus piscivorus было сообщено Chao B. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA /1989/ 86: 8050-8054. Соотношение между различными IIb-IIIa антагонистами из змеиных ядов обсуждалось Dennis, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA /1989/ 87: 2471-2475.

Включенные в эту группу ингибиторов пептиды из змеиных ядов представляют собой "албоабран", выделенный из Trimeresurus albolabris, элегантин, выделенный из T. elegans, флавовиридин, выделенный из T. flavoviridis, батроксоет статин, выделенный из Bothrops atrok, битистатин, выделенный из Bitis arietans, описанный Niewiarowski S., et al., Fhroneb Haemostas /1989/ 62:319 /Abstr SY-XIY-5/. Кроме того, апплаггин был выделен из Agkistrodon p. piscivorus и описан Chao B. et al., Throneb. Haemostas /1989/ 02:50 /Abstr 120/, и гализин, выделенный из Agkistrodon halys, который был описан Huang, T.F., et al., Fhrombhaemostas /1989/ 62:48 /Abstr 112/. Все эти пептиды показывают высокую степень гомологии последовательности. Кроме того, все пептиды из змеиных ядов, описанных к настоящему времени, которые ингибируют связывание адгезивных протеинов с рецепторами интегрина содержат PGD-последовательность.

Хотя эти описанные действующие начала змеиного яда являются потенциальными ингибиторами агрегации тромбоцитов in vivo, эти пептиды также связываются с высокой афинностью с другими элементами рецепторов адгезивных протеинов, такими как рецепторы витронектина и фибронектина /Knudsen K.A., et al. , Exp. Cell. Res. /1988/ 179: 42-49, Rucinski, B., et al., Troneb Haemostas /1989/ 62: 50 /Abstr. 120//. Этот недостаток специфичности факторов змеиного яда для GP IIb-IIIa является нежелательной особенностью их терапевтического использования в качестве ингибиторов образования тромбов, поскольку они обладают возможным влиянием на адгезивные свойства других клеток в сосудистой системе, особенно свойства адгезии посредством интегрина.

Другой подход, разработанный для генерации ингибиторов тромбоцитных тромбов, представлял собой использование "murine" анти-GP IIb-IIIa моноклональных антител, которые блокируют связывание адгезивных протеинов со стимулированными тромбоцитами. Эти моноклональные антитела были использованы для предотвращения коронарной артериальной реокклюзии после реперфузии тканевым плазминогенным активатором на собаках /Yaneda, T., et al., J. Clin Inwest /1988/ 81: 1284-1292/ и для предотвращения циклического снижения потока в травмированных коронарных артериях собак с высокой степенью стеноза у собак. Возможные побочные эффекты использования таких моноклональных антител у человека могут быть результатом их длительного воздействия и их возможной иммуногенности.

Ясно, что для предотвращения или по крайней мере уменьшения нежелательного тромбообразования необходимы дополнительные терапевтические лечебные схемы. В частности, терапевтические агенты, способные к блокированию или ингибированию образования тромбов при конкретном расположении без опасности гемостаза и без воздействия на другие клеточные адгезии, обеспечивали бы главные терапевтические результаты. В идеальном варианте эти агенты должны быть сильнодействующими, специфичными для IIb-IIIa и неиммуногенными для большинства пациентов, они также должны быть легкими для введения, стабильными и экономичными для производства. Далее, эти агенты должны действовать кратковременно и быть способными действовать при наиболее ранних стадиях тромбообразования без проявления длительного гемостаза. Настоящее изобретение удовлетворяет этим и другим аналогичным требованиям.

Описание изобретения Изобретение обеспечивает простую методику скрининга для идентификации факторов с низким молекулярным весом /< 10 кД/ в змеином яде или других биологических источниках, которые специфически ингибируют тромбообразование, посредством агрегации тромбоцитов. Эта методика использует представление, что агрегация тромбоцитов главным образом осуществляется благодаря связыванию фибриногена и/или vWF с GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов, если тромбоциты обрабатываются соответствующим стимулятором, таким как ADP. При использовании этих критериев, то есть ингибирование связывания фибриногена и/или vWF с отдельным рецептором и аналогичный критерий, связанный с ингибированием связывания фибронектина /Fn/ рецептором фибронектина /Fn/ FnR-связывание/ и витронектина с рецептором витронектина /Vn/ VnR-связывание/, а также связывание других факторов, таких как Fn и Vn GP IIb-IIIa, может быть быстро и удобно получен профиль специфичности для ингибитора агрегации тромбоцитов /PAI/. Этот подход был использован для скрининга и характеристики широкого списка змеиных ядов на присутствие или отсутствие PAI, для охарактеризования специфичности PAI, идентифированной из этого списка, по их специфичности в ингибировании связывания с GP IIb-IIIa в противоположность ингибированию другими интегринами, и для идентификации активных пептидов, которые являются производными этих PAI.

Таким образом, в одном аспекте изобретение направлено на способ быстрого отбора относительно присутствия или отсутствия PAI в биологической жидкости, который включает в себя контактирование жидкости с выделенным GP IIb-IIIa в тест-реакции в присутствии фибриногена и сравнение количества фибриногена, связанного с GP IIb-IIIa в этой тест-реакции, с количеством фибриногена, связанного с GP IIb-IIIa в контрольной реакции. Этот способ может далее включать реакции тестирования и контрольные реакции, которые предусматривают контактирование Fn с рецептором Fn, Vn с рецептором Vn, Fn с GP IIb-IIIa или vWF с GP IIb-IIIa для охарактеризования специфичности РА1.

В другом аспекте изобретение направлено на новый PAI в выделенном виде, который идентифицирован в, и может быть выделен из Echis colorata, Eristicophis macmahonii, A. hypnali, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorous conanti; Bothrops asper, Bothrops cotiara, B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuvudi, B. pradoi, B. schlegli, Crotalus atrox; C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus V. helleri, Crotalus V. lutosus, Crotalus V. oreganus, Crotalus V. viridis; Zachesis mutas, Sistrures catenatus tergeminus, and Sistrurus nularus barbouri.

Предпочтительными являются PAI в выделенном виде, полученные из, или имеющие аминокислотные последовательности из PAI, полученных из Eristicophis macmahonii /эристикофин/, Bothrops cotiara /котиарин/, B. jararacussu; Crotalus atrox /кротатроксин/, Crotalus basilicus /басилицин/, C. cerasles cerastes /серастин/, C. durissus totanatacus /дуриссин/, C. durissus durissus /дуриссин/, C. h. horridus /хорридин/, Crotalus m. niolossus /молоссин/, Crotalus ruber ruber /руберин/, Crotalus viridis lutosus /лутозин/, C.v. viridis /виридин/ Crotalus V. oreganus /ореганин/, Crotalus v. helleri, Lachesis muta /лахесин/, Sistrurus catenatas tergemunus /тергеминин/ и S. milarus barbouri /барбурин/.

Особенно предпочтительными являются эристикофин, котиарин, кротатроксин, серастин, дуриссан, хорридин, руберин, лахезин, басилицин, лутозин, молоссин, ореганин, виридин, тергеминин и барбурин.

Изобретение также включает пептиды из аминокислотных последовательностей, как описано выше, которые представляют собой сокращенные или/и модифицированные формы пептидов естественного происхождения и/или имеют одну или более пептидных сшивок, замененных альтернативными сшивками, такими как -CH₂NH- или -CH₂CH₂-.

В предпочтительном аспекте изобретение относится к PAI в выделенном виде, который может быть получен из активного змеиного яда, идентифицированного при помощи способа изобретения и проявляющего свойство специфически ингибировать связывание фибриногена /Fg/ и/или фактора Виллебранда /vWF/ с GP IIb-IIIa и их сокращенные и/или модифицированные виды.

В еще одном предпочтительном аспекте изобретение относится к PAI змеиного яда в выделенном виде, в котором последовательность, ответственная за связывание с рецептором адгезивного протеина, включает последовательность KGD.

В другом основном аспекте изобретение направлено на группу пептидов или родственных пептидам соединений, которые в общем являются ингибиторами агрегации тромбоцитов, которые способны ингибировать связывание Fg или vWF с GP IIb-IIIa при значительно более высокой эффективности, чем эффективность, с которой они ингибируют связывание витронектина с рецептором витронектина или фибронектина с рецептором фибронектина. Эти пептиды характеризуются наличием связывающей последовательности K^* CDX вместо RGDX связывающей последовательности, которая находится, как известно, в PAI протеинах, K^* представляет собой замещенный или незамещенный протеиновый дизельный остаток формулы R'₂N(CH₂)₄CHNHCO-, где R¹ представляет собой независимо H или заместитель, который является достаточно электронодонорным, с тем, чтобы не нарушить основность смежного азота, и в котором одна или две из метиденовых групп необязательно может быть замещена на О или S, как описано ниже. Барбуриновый PAI, выделенный из S.milarus barbouri, является одной из иллюстраций этой серии пептидов. Однако более короткие виды этого пептида также могут быть использованы так же, как аналогичные последовательности, которые также содержат модификации 1-10 аминокислотных остатков в другом месте пептидной цепи, и/или замена пептидных связей альтернативными связями. Другие иллюстративные воплощения включают выделенные PAI-пептиды, имеющие нативную RGDX последовательность, где эта последовательность заменяется на K^*CDX. Как в случае барбурина, эти выделенные PAI могут быть иначе в нативной форме, или могут быть сокращены, и/или могут содержать замещения 1-10 аминокислотных остатков или делеции, и/или могут иметь непептидные связи, замещающие пептидные сшивки.

Другая группа соединений, которые попадают в сферу изобретения, является группа, в которой находятся предшествующие соединения, как описано, за исключением того, что глицильный остаток в RGD или K^*GD последовательности замещается на саркозильный остаток. Этот класс соединений сохраняет активность и специфичность родственных RGD или K^*GD-содержащих пептидов.

Еще одна иллюстративная группа воплощений представляет собой пептиды или модифицированные пептиды, имеющие специфическую PAI активность, формулы где K^* представляет собой замещенный или незамещенный лизильный остаток формулы R'₂N(CH₂)₄CHNHCO, как описано выше, где каждая R¹ является независимо H, алкилом /1-6C/ или в лучшем случае один R¹ является R²-C= NR³, где R² представляет собой H, алкил /1-6C/ или замещенный или незамещенный фенильный или бензильный остаток, или является NR₂⁴, в котором каждая R⁴ является независимо H или алкил /1-6C/, и R³ - H, алкил/1-6C/, фенил или бензил, или R²-C=NR³ представляет собой радикал, выбранный из группы, состоящей из где m представляет собой целое число из 2-3, и каждый R⁵ является независимо H или алкилом /1-6С/, и где одна или две (CH₂) может(гут) быть замещена(ы) на О или S при условии, что названный O (или S) не является смежным с другим гетероатомом, AA₁ представляет собой небольшую нейтральную /полярную или неполярную/ аминокислоту и n1 - целое число из 0-3, AA₂ представляет собой нейтральную, неполярную большую /ароматическую или неароматическую/ или полярную ароматическую аминокислоту и n2 - целое число из 0-3, AA₃ представляет собой пролиновый остаток или модифицированный пролиновый остаток /как определено ниже/ и n3 - целое число из 0-1, AA₄ является нейтральной, небольшой аминокислотой или N-алкилированной формой ее и n4 - целое число из 0-3, каждый из X₁ и X₂ является независимо остатком, способным к образованию связи между X₁ и X₂ для получения циклического соединения, как показано, и каждый из Y₁ и Y₂ представляет собой независимо не мешающий заместитель или может отсутствовать, где одна или более пептидных связей может необязательно быть заменена связью, выбранной из группы, состоящей из: -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH= CH- /цис и транс/, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- и -CH₂SO-; с условием, что если n3 есть 0, или 1) сумма n2 и n4 должна быть по крайней мере 2, или 2) K^* должно быть другим, чем Har или K, или 3) по крайней море один из X₁ и X₂ должен быть другим, чем Cys /C/, пеницилламин /Pen/, или 2-амино-3,3-циклопенианметилен -3-меркаптопропионовая кислота /APmP/ или 4) Y₁ или Y₂ должны включать в себя по крайней мере один аминокислотный остаток, или 5) одна или более пептидных связей заменяется на вышеупомянутую альтернативную связь.

Другие аспекты изобретения касаются рекомбинантных методов и материалов, связанных с синтезом этих и других родственных пептидов, с методами их синтеза in vitro с фармацевтическими композициями, содержащими эти соединения, и со способами ингибирования агрегации тромбоцитов и тромбообразования при использовании этих соединений и композиций.

Описание чертежей Фиг. 1 показывает ингибирование связывания фибриногена с GP IIb-IIIa при помощи частично очищенных змеиных ядов.

Фиг. 2 показывает зависимость ингибирования адгезии от дозы Centricon-10 ультрафильтратов, сырых змеиных ядов в анализах как фибриноген /GP IIb-IIIa, так и витронектин /рецептор витронектина.

Фиг. 3 показывает хроматограмму HPLC сырого PAI из Eristicophis macmahoni яда. Заштрихованная область содержит биологически активные фракции.

Фиг. 4 показывает хроматограмму HPLC PAI фракций из фиг. 3. Заштрихованная область содержит биоактивные фракции.

Фиг. 5 показывает вид аналитической хроматографии HPLC PAI-фракций из фиг. 4.

Фиг. 6 показывает полную аминокислотную последовательность эристикофена, барбурина, тергеминина, серастина, руберина, лачезина, котиарина, кротактроксина, хорридина, лутозина, виридина, молоссина, бэсилицина, дуриссина, фирарцина, серебрина и фуганина и фрагментов пищеварительных энзимов при помощи автоматизированного распада Эдмана.

Фиг. 7 изображает HPLC хроматограмму PAI, полученного из G-50 фракций сырого Sistrurus C. tergeminus яда.

Фиг. 8 изображает хроматограмму HPLC PAI фракций с фиг. 7.

Фиг. 9 показывает активность очищенного PAI фиг. 8 в ингибировании связывания в анализах с несколькими рецепторами.

Фиг. 10 изображает хроматограмму HPLC ингибитора агрегации тромбоцитов, полученного из G-50 фракций сырого Sistrurus c. tergeminus яда. Заштрихованная область содержит биоактивные фракции.

Фиг. 11 изображает хроматограмму HPLC активных фракций PAI фиг. 10.

Фиг. 12 сравнивает аминокислотные последовательности ряда PAI с аминокислотными последовательностями барбурина.

Фиг. 13 изображает хроматограмму HPLC необработанного PAI из Lachesia mutas яда. Заштрихованные области содержат биологически активные фракции.

Фиг. 14 изображает хроматограмму HPLC фракций активных PAI из фиг. 13. Заштрихованная область содержит биологически активные фракции.

Фиг. 15 изображает аналитическую хроматограмму HPLC PAI фракций фиг. 14 из Lachesia mutas.

Фиг. 16 изображает хроматограмму HPLC сырого PAI из Crotalus viridis viridis яда. Заштрихованная область содержит биологически активные фракции.

Фиг. 17 изображает хроматограмму HPLC PAI фракций фиг. 16.

Фиг. 18 показывает влияние дозы очищенных пептидов змеиных ядов на ингибирование связывания фибриноген/GP IIb-IIIa по сравнению с эхистатином.

Фиг. 19 показывает влияние дозы очищенных пептидов змеиного яда на ингибирование ADP /4 мкМ/, вызвано агрегацией тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме /PRP/ по сравнению с эхистатином.

Фиг. 20 показывает область активности из хроматограммы HPLC фракционирования C. c. cerastes яда.

Фиг. 21 показывает результаты хроматографического анализа HPLC активных фракций фиг. 20.

Фиг. 22 показывает область активности HPLC фракционирования PAI из C. ruber ruber.

Фиг. 23 показывает область активности на аналитической колонке C-18 гомогенного пептида, полученного из C. atrox.

Фиг. 24 показывает аналитическую хроматограмму HPLC-гомогенного пептида, выделенного из Bothrops cotiara.

Фиг. 25 показывает влияние дозы очищенного котиарина на ингибирование связывания фибриногена с GP IIb-IIIa и ингибирование связывания витронектина с рецептором витронектина.

Фиг. 26 показывает влияние очищенных пептидов змеиных ядов на связывание фибриногена с GP IIb-IIIa и витронектина с рецептором витронектина.

Фиг. 27 показывает результаты активности связывания для аналога #1, [E²⁸L⁴¹C⁶⁴] barbourin (28-73) относительно GP IIb-IIIa и рецептора витронектина.

Фиг. 28 показывает способность синтетического аналога эристикофина ингибировать связывание фибриногена с GP IIIb-IIIa и неспособность ингибировать связывание витронектина с рецептором витронектина.

Фиг. 29 показывает способность линейных и циклических KGDW соединений ингибировать связывание фибриногена с GP IIb-IIIa.

Фиг. 30 показывает способность различных KGDW аналоги ингибировать связывание фибриногена с GP IIb-IIIa и ингибировать связывание витронектина с рецептором витронектина.

Фиг. 31 показывает способность различных нативных и синтетических ингибиторов агрегации тромбоцитов ингибировать присоединение клеток М21 меланомы к витронектину.

Фиг. 32 показывает способность RGDS и циклического RGD соединения ингибировать присоединение клеток М21 меланому к витронектину и отсутствие способности циклического KGDW аналога ингибировать присоединение клеток М21 меланомы к витронектину.

Фиг. 33 показывает активность аналога 60, Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂ в ингибировании агрегации тромбоцитов и клеточной адгезии к витронектину.

Фиг. 34 показывает активности из фиг. 33 дли аналога 19, Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂.

Фиг. 35 показывает возникновение снижений циклического потока (CFR_s) в открытой грудной модели тромбоза собаки /Fotts Model/.

Фиг. 36 показывает влияние дозы введения 10 мг пилюли на CFR_s, инициированные в открытой грудной модели тромбоза собак /Folds Model/.

Фиг. 37 показывает влияние введения дозы 40 мг пилюли на CFR_s, инициированные в открытой грудной модели тромбоза собак /Folts Model/.

Фиг. 38 показывает последовательность ДНК полной длины, кодирующей аминокислотную последовательность барбурина /1-73/.

Фиг. 39 показывает ДНК-последовательность, кодирующей [М-1 L41] барбурин /1-73/, пришиваемая к PhoA ведущей последовательности.

Фиг. 40 показывает последовательность ДНК, кодирующей аналог #1, сшитый с ведущей последовательностью для экспрессии в бактерии.

Фиг. 41 показывает олигонуклеотиды, используемые в PCR реакции для получения ДНК, кодирующую аналог #1. Аминокислоты, включенные в аналог сами по себе показаны жирным шрифтом.

Фиг. 42 показывает соединение последовательности тандемных повторений ДНК, кодирующей аналог #1.

Фиг. 43 показывает диаграмму укороченного гена барбурина как тандемные репликации.

Способы выполнения изобретения Изобретение обеспечивает ингибиторы агрегации тромбоцитов /PAI/, которые могут быть выделены из змеиного яда, который был идентифицирован как активный аналитическими методами изобретения и соединений, которые имеют аналогичные структуры и синтезируются с использованием стандартных методик in vitro, таких как твердофазный пептидный синтез, или использование рекомбинантных методов или комбинация этих методов. Некоторые из этих ингибиторов являются чрезвычайно специфичными для ингибирования агрегации тромбоцитов и не ингибируют иное связывание в пределах семейства интегринов. Другие ингибиторы имеют другие области специфичности. Разделы ниже описывают выделение PAI природного происхождения из змеиного яда, конструирование ингибиторов, которые обладают значительно более высокой активностью в ингибировании агрегации тромбоцитов, например взаимодействие витронектин/рецептор витронектина путем введения последовательности K^*GD предпочтительнее, чем RGD, способы синтеза этих пептидов, методы рекомбинантного получения, антитела, наработанные против пептидов изобретения, методы анализа, которые позволяют идентифицировать змеиные яды, которые содержат PAI, введение и применение PAI изобретения.

PAI предназначается как фактор, который способен предотвращать агрегацию стимулированных тромбоцитов в стандартных анализах, например анализах, описанных Gan, Z., R. et al., and Huang., T-F. et al. (supra). В этих анализах отмытые тромбоциты комбинируются с фибриногеном, Ca⁺² и тестируемым материалом. Тромбоциты стимулируются ADP /или другими известными стимуляторами или их комбинациями/ и агрегация /или их отсутствие/ наблюдается при использовании, например, коммерчески доступного агрегометра.

Некоторые из PAI изобретения идентифицируются как специфические для ингибирования связывания фибриногена и/или vWF с GP IIIb-IIIa. Понятно, что специфичность является степенным вопросом, поэтому PAI, специфический для ингибирования связывания Fg или vWF с GP IIb-IIIa, ингибирует это связывание существенно более, чем он ингибирует связывание Fn с FnR или Vn с VnR. Под "существенно более" подразумевается, что или процент ингибирования по крайней мере в два раза больше при данной концентрации PAI, или что концентрация PAI, которая вызывает 50% ингибирование, по крайней мере в два раза меньше для ингибирования связывания Fg или vWF/GP IIb-IIIa, чем для иного связывания лиганд/рецептор.

Выделенные нативные PAI и методы очистки Ингибиторы агрегации тромбоцитов /PAI/ изобретения включают пептиды с низким молекулярным весом, которые могут быть получены в выделенном виде, как описано ниже, из змеиного яда, который был идентифицирован как "активный", то есть найдено, что содержит PAI, используя способ изобретения, который описывается ниже.

Способ изобретения позволяет быстро идентифицировать и охарактеризовать присутствие эффективного PAI в змеином яде, который селективно ингибирует связывание с GP IIb-IIIa в противоположность другим интегринам, как например витронектиновый рецептор и рецептор фибронектина. При такой идентификации и, необязательно и оптимально, охарактеризовании PAI могут быть выделены и очищены с использованием различных стандартных методик, проиллюстрированных здесь и известных специалистам. Например, может быть использовано сочетание разделения, основанного на молекулярном весе /обычно извлечение веществ < 10 кД/, ионообменной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии с реверсивной фазой. Другие методики также могут применяться, но рабочая процедура, подходящая для PAI из любого активного змеиного яда, представляет собой следующее.

Примерно 10-1000 мг яда растворяется в разбавленной уксусной кислоте и пропускается через маркированную по размерам фазы колонку, такую как Сефадекс-50, и элюируется тем же растворителем. Фракции анализируются на активность, используя анализ связывания /Fg/ GP IIb-IIIa изобретения, стандартный анализ агрегации тромбоцитов /PAA/ или любой аналогичный анализ, полагающийся на активность связывания адгезивного протеина GP IIb-IIIa. Иначе, фракция < 10 кД из фракции яда может быть извлечена с использованием ультрафильтрации и подобным образом проанализирована.

Фракции с низким молекулярным весом, выделенные при помощи любой процедуры, пропускается затем через препаративную C-18 HPLC колонку, такую как колонка HPLC C-18 Delta Pak с реверсивной фазой, выпускаемую Waters, предварительно уравновешенную 0,1% трифторуксусной кислотой /TFA/ 8% ацетонитрила. Абсорбированный PAI затем элюировали с использованием градиента 8-60% ацетонитрила в 0,1% TFA. Петля градиента и скорость потока оптимизируется, используя рутинные процедуры. Активные фракции определяются при помощи PAA или метода связывания рецептора изобретения. Активные фракции затем собираются, концентрируются и испытываются на гомогенность, используя аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографию или SDS - PACE. Далее применяется градиентная очистка обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии до тех пор, пока PAI не станет гомогенным.

PAI изобретения, получаемые путем описанных выше или других методов очистки, включают PAI из ядов, выбранные из группы, состоящей из Echis colorata, Eristicophis macmahonii, A. hypnale, A. acutus, A. piscivorous leucostoma, A. piscivorous conanti; Bothrops asper, Bothrops cotiara, B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. schlegli, Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C. durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis, Lachesis mutas, Sistrurus catenatus terdeminus и Sistrurus milarus barbouri.

Предпочтительными являются PAI, в чистом виде полученные из, или имеющие аминокислотные последовательности из PAI, полученных из Eristicophis macmahonii /эристикофин/, Bothrops cotiara /котиарин/, B. jararacussu, Crotalus atrox /кротатроксин/, Crotalus basilicus /базицилин/, C. cerastes cerastes /серастин/, C. durissus totonatacus /дуриссин/, C. durissus durissus /дуриссин/, C.h. horridus /норридин/, Crotalus m. molossus /молоссин/, Crotalus ruber ruber /руберин/, Crotalus viridis lutosus /лутозин/, C. v. viridis /виридин/, Crotalus v. oreganus /ореганин/, Crotalus v. helleri, Lachesis mutas /лахезин/, Sistrurus catenatus tergeminus /тергеминин/ и S. milarus barbouri /барбурин/. Особенно предпочтительными являются PAI, специфические для ингибирования Fg или vWF/GP IIb-IIIa связывания, например PAI из Sistrurus m. barbouri.

Особенно предпочтительными являются эристикофин, котиарин, кротатроксин, серастин, дуриссин, хорридин, руберин, лахезин, басидицин, лутозин, молоссин, ореганин, виридин, тергеминин и барбурин.

В очищенных PAI могут быть результатом использования стандартных методик, тем самым позволяя синтез с использованием стандартных твердофазных методик /особенно для более коротких видов PAI/ или рекомбинантного получения. Например, Applied Biosystems Sequentor может быть использован после карбоксиаминомет