Способ модификации, способ обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтические композиции, способ диагностики

Способ модификации, способ обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтические композиции, способ диагностики

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается способа модификации белка, такого как антитело, способа обеспечения связывания белка с антителом, фармацевтических композиций модифицированных белков для лечения человека. Сущность изобретения включает связанный с липидом белок, в котором одна или более ацильных групп связаны с белком посредством боковой углеводной цепи и различными ковалентными связями. Липидизированные антитела могут применяться в лечебных и диагностических целях. Преимущество изобретения заключается в усилении проникновения модифицированных белков в клетки. 7 с. и 13 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

Изобретение обеспечивает способы нацеливания белка, такого как антитело, во внутриклеточные компартменты эукариотической клетки, способы усиления поглощения органами белков, фармацевтические композиции модифицированных белков для лечения человека и способы приготовления модифицированных белков. Модифицированные белки настоящего изобретения включают связанный с липидом белок, в котором одна или более ацильных групп связаны с белком посредством боковой углеводной цепи и различными ковалентными связями.

Предпосылки к созданию изобретения Множество естественно встречающихся или модифицированных белков предлагается в качестве диагностических и/или терапевтических агентов для человека и домашних животных. Однако белки, в основном, очень плохо проходят через сосудистые эндотелиальные мембраны, если вообще проходят, и обычно не могут преодолеть клеточные мембраны, чтобы получить доступ к внутриклеточным компартментам. Так, например, можно получить антитела против очищенных внутриклеточных белков, таких как факторы транскрипции, внутриклеточные ферменты и структурные белки, но такие антитела, в основном, не способны проникать в интактную клетку и связываться с внутриклеточными антигенными мишенями, пока клеточная мембрана не повреждена.

Создание методики моноклональных антител в середине 1970-х годов провозгласило новую эру в медицине. В первое время исследователи и клиницисты имели доступ к практически неограниченным количествам стандартных антител, способных связываться с предопределенными антигенными сайтами и обладающих разнообразными иммунологическими эффекторными функциями. Эти белки, известные как "моноклональные антитела", казалось, подавали большие надежды, например, для удаления вредных клеток, микробных патогенов и вирусов in vivo. Способы, делающие возможным разработку специфичных моноклональных антител, обладающих специфичностью связывания, направленной против практически любого желательного антигенного эпитопа, включая антитела, которые расположены во внутриклеточных компартментах, обещали настоящий рог изобилия лекарственных "волшебных пуль".

К несчастью, разработка подходящих лекарственных продуктов, основанных на моноклональных антителах, а также поликлональных антисыворотках, серьезно затруднялась рядом недостатков, связанных с химическим строением натуральных антител. Первое, антитела, в основном, не способны эффективно проникать внутрь клеток, поскольку иммуноглобулины не способны преодолеть плазматическую мембрану клеток, и обычно только интернализируются, если это вообще происходит, как следствие неэффективных эндоцитотических механизмов. Второе, антитела, в основном, не пересекают сосудистые оболочки (например, субэндотелиальную базальную мембрану), что затрудняет эффективное включение антител в органы и интерстициальные пространства. Следовательно, можно было бы разработать лекарства для лечения многих серьезных заболеваний, если бы существовал эффективный способ доставки специфичных биологически активных молекул иммуноглобулинов через капиллярные барьеры и во внутриклеточные участки. Например, жизненный цикл ретровируса, такого как ВИЧ, включает внутриклеточную репликацию, при которой несколько закодированных вирусом полипептидов, имеющих важное значение для продукции контагиозных вирионов в инфицированной клетке, могли бы быть угнетены или блокированы, если бы специфичные моноклональные антитела против кодируемых вирусом белков могли легко проникать во внутриклеточные участки, где наблюдается репликация ретровируса.

Иммунолипосомы были разработаны как потенциальная нацеливающая система доставки различных молекул, содержащихся в липосоме, в клетку-мишень. Иммунолипосомы используют иммуноглобулины в качестве нацеливаемых агентов, причем ацилированный иммуноглобулин закреплен на липидном бислое липосомы, чтобы нацелить липосому на определенные клеточные типы, которые имеют внешние антигены, которые связываются ацилированным иммуноглобулином (иммуноглобулинами) иммунолипосом (Connor и Huang (1985) J. Cell Biol. 101: 582; Huang, L. (1985) Biochemistry 24:29; Babbitt и др., (1984) Biochemistry 23: 3920; Connor и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:1715; Huang и др. (1983) J. Biol. Chem. 258:14034; Shen и др. (1982) Biochim. Biophys. Acta 689:31; Huang и др. (1982) Biochim. Biophys. Acta 716:140; Huang и др. (1981). J.Immunol. Methods 46:141; и Huang и др. (1980) J. Biol. Chem. 255: 8015). Иммунолипосомы, в основном, содержат иммуноглобулины, которые присоединены к ацильным заместителям липосомного бислоя посредством поперечно-связывающего агента, такого как N-гидроксисукцимид, и которые, таким образом, закрепляются на липидном бислое липосомы. Следовательно, поперечно-связанный иммуноглобулин зафиксирован на липосоме и служит для нацеливания липосом на специфичные типы клеток, которые несут определенный заведомо внешний антиген, путем присоединения к внешнему клеточному антигену. В то время как такие способы могут служить для нацеливания липосом на определенные клеточные типы, иммунолипосомы обладают несколькими существенными недостатками, которые ограничивают их использование в качестве средств доставки лекарственных агентов, в частности для доставки белков внутрь клетки.

Были предприняты попытки модифицировать белки так, чтобы облегчить их транспорт через капиллярные барьеры и внутрь клеток (ЕР 0329185), однако до сих пор не сообщалось о создании всесторонне удовлетворительного способа. Сообщалось о химической модификации белков, таких как антитела, посредством неспецифической "катионизации", для облегчения трансваскулярной и внутриклеточной доставки белков (U.S.S.N. 07/693, 872). Однако существующие в настоящее время способы получения катионизированных иммуноглобулинов приводят к значительной утрате связывающего сродства (приблизительно 90%) катионизированного иммуноглобулина к его предопределенному эпитопу, по сравнению с некатионизированным иммуноглобулином. В общих чертах, катионизация включает присоединение диамина, такого как путресцин или гександиамин, посредством карбодиимидной связи к карбоксильным группам остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот в полипептидной цепи иммуноглобулина. Эти химические модификации первичных аминокислот, вероятно, нарушают вторичную и третичную структуру иммуноглобулина в степени, достаточной для потери связывающего сродства. Также настоящие способы производят некоторую степень катионизации остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, расположенных в различных доменах иммуноглобулиновой цепи, что приводит к значительной утрате связывающего сродства и/или специфичности.

Химическая модификация малых молекул также была предложена в качестве способа усиления транспорта малых биологически активных соединений. Felgner (W 091/17242) описывает формирование липидных комплексов, состоящих из липидных пузырьков и заключенных в них биологически активных веществ. Felgner и др. (W 091/16024) описывают катионные липидные соединения, которые, как утверждается, пригодны для усиления переноса малых биологически активных молекул в растениях и животных. Липосомы и поликатионные нуклеиновые кислоты были предложены в качестве способов доставки полинуклеотидов в клетки. Липосомы часто демонстрируют узкий спектр клеточной специфичности, и когда ДНК покрывает их снаружи, она зачастую чувствительна к действию клеточных нуклеаз. Новейшие поликатионные липосперминовые соединения подвергают воздействию широкий спектр клеток (Behr и др. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6982) и ДНК покрывают этими соединениями. В добавление, комбинация нейтрального и катионного липидов рассматривается как способ трансфекции животных клеток (Rose и др., (1991), Bio-Techniquer 10:520).

Другие подходы к усилению доставки лекарств, в частности, через гематоэнцефалический барьер, применяют фармакологически обоснованные процедуры, включающие перевод лекарств в инертное состояние или превращение гидрофильных лекарств в жирорастворимые. Большинство подходов по переводу в инертное состояние включают блокирование гидроксильных, карбоксильных и первичных аминогрупп лекарства, чтобы сделать его более жирорастворимым и, таким образом, облегчить его транспорт через гематоэнцефалический барьер. Pardridge и Schimmel, U. S. Patent 4902505 раскрывают химерные пептиды для усиления транспорта посредством рецептор-опосредованного трансцитоза.

Таким образом, в данной области существует потребность в методах облегчения транспорта специфичных белков, таких как антитела, через капиллярные барьеры и внутрь клетки и в фармацевтических композициях таких иммуноглобулинов для лечения заболеваний человека и животных, которые поддаются лечению внутриклеточными белками и прицельными агентами, такими как моноклональные антитела.

Краткое изложение изобретения Существующий ранее способ увеличения транспорта антител внутрь клеток посредством соединения катионного заместителя с первичной полипептидной цепью иммуноглобулина относительно неспецифичным связующим реагентом производит пагубные изменения во вторичной, третичной и/или четвертичной структуре белка. Эти структурные изменения однозначно вызывают потери в связывающем сродстве катионизированных антител. Чтобы преодолеть это явление, настоящее изобретение создает способы, при которых липидные заместители связываются с белком, таким как иммуноглобулин, обычно ковалентной связью с углеводной боковой цепью белка, таким образом, что липидный заместитель не наносит существенного вреда биологической активности белка (например, связыванию с антигеном).

Настоящее изобретение обеспечивает способы приготовления липидизированных белков, в основном, посредством липидизирования углеводной части гликопротеина или гликопептида. В целом, способы настоящего изобретения используют для присоединения липида, такого как липоамин, к полипептиду, обычно ковалентной связью липида и углеводной части белка, причем углеводная часть в общем случае химически окислена и реагирует с липоамином, образуя липидизированный белок. Получающийся в результате липидизированный белок, в основном, обладает выгодными фармакокинетическими характеристиками, такими как возросшая способность преодолевать сосудистые барьеры и достигать паренхимных клеток различных органов и возросшая способность достигать внутриклеточных компартментов. В одном аспекте настоящего изобретения липидизирование белков, таких как антитела, направленные против факторов транскрипции (например, Fos, Jun, AP-1, OCT-1, NF-AT), облегчает внутриклеточную локализацию липидизированного белка (белков).

Изобретение также обеспечивает способы приготовления липидизированных антител, которые эффективно транспортируются через капиллярные барьеры и интернализируются в клетки млекопитающих in vivo. Способы настоящего изобретения относятся к способам для химического присоединения по крайней мере одного липидного заместителя (например, липоамина) к углеводной части иммуноглобулина с целью получения липидизированного через углеводную часть иммуноглобулина, при которых липидизированный иммуноглобулин способен к внутриклеточной локализации. В альтернативных вариантах осуществления изобретения, по крайней мере, один липидный заместитель (например, липоамин) ковалентно связан с неуглеводной частью белка или полипептида (например, путем образования амидной связи с остатком аспарагиновой или глутаминовой кислоты карбоксильного заместителя боковой цепи или тиоэфирной связи с остатком цистеина). Также можно присоединить жирную кислоту к остатку аргинина или лизина с помощью аминозаместителей боковой цепи.

Подобно этому липидные заместители могут быть ковалентно присоединены к пептидомиметическим соединениям. Пептидные аналоги широко применяют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств, обладающих свойствами, аналогичными свойствам матричных пептидов. Эти виды непептидных соединений называют пептидомиметиками (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber и Freidinger (1985) TINS стр. 392; и Evans и др. (1987) J. Med. Chem. 30: 1229, включенные в настоящий документ в качестве ссылки) и обычно разрабатывают с помощью компьютерного молекулярного моделирования. Пептидомиметики, которые по структуре сходны с лекарственными пептидами, можно применять для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. В целом, пептидомиметики структурно сходны с типичными полипептидами (т.е. с полипептидами, обладающими биологической или фармакологической активностью), но имеют одну или более пептидных связей, факультативно замещенных связями, выбранными из следующей группы: -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(цис и транс), -COCH₂, -CH(OH)-CH₂ и -CH₂SO-, с помощью способов, известных в данной области, и кроме того описанных в следующих ссылках: Spatola, A.F. в "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptider, and Proteins", B. Weinstein, eds. , Marcel Dekker, New York, стр. 267 (1983); Spatola, A.F. Vega Data (March 1983), vol.1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications" (общий обзор); Morley, J.S., Trends Pharm. Sci (1980) стр. 463-468 (общий обзор); Hudson, D. и др., Int. J. Pept.Prot Res. (1979) 14:177 - 185 (-CH₂NH-, CH₂-CH₂-); Spatola, A.F. и др., Life Sci. (1986) 38:1243 - 1249 (-CH₂-S); Hann, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, цис и транс); Almquist, R,G и др., J. Med. Chem. (1980) 23:1392 - 1398 (-COCH₂-); Iennings -Wtite, C. и др., Tetrahedron Lett. (1982) 23:2533 (-COCH₂); Szelke, М. и др. , European Appln. ЕР 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)-CH₂-); Holladay, M.W. и др., Tetrahedron Lett. (1983) 25: 4401 - 4404 (-C(ОН)CH₂-); и Hruby, V.J., Life Sci. (1982) 31:189 - 199 (-CH₂-S-); каждый из этих источников включен в настоящий документ в качестве ссылки. Особенно предпочтительной непептидной связью является - CH₂NH-. Такие пептидомиметики могут иметь значительные преимущества перед полипептидами, включающими, например, более экономичное производство, большую химическую стабильность, усиленные фармакологические свойства (полупериод жизни, адсорбцию, мощность, эффективность и т. д. ), измененную специфичность (например, широкий спектр биологического действия), уменьшенная антигенность и другие. Липидизирование пептидомиметиков обычно включает ковалентное присоединение одной или более ацильных цепей непосредственно или через спейсер (например, амидогруппу), к неинтерферирующим позициям пептидомиметика, которые предсказаны количественными данными структуры-активности и/или молекулярным моделированием. Такие неинтерферирующие позиции, в целом, являются позициями, которые не образуют прямых контактов с макромолекулой (например, рецептором), с которой пептидомиметик связывается, производя таким образом терапевтический эффект. Липидизирование пептидомиметиков не должно существенно мешать желаемому биологическому или фармакологическому действию пептидомиметика.

Настоящее изобретение относится также к лекарственным и диагностическим композициям липидизированных белков, которые могут преодолевать сосудистые мембраны и проникать во внутриклеточные компартменты, в частности, липидизированных антител, которые присоединяются к внутриклеточным иммунотерапевтическим мишеням, таким как кодируемые вирусным геном продукты, являющиеся главными компонентами жизненного цикла вируса (например, ВИЧ-1 Tat белок), к внутриклеточным антигенам, которые активны биологически (например, онкогенный белок, такой как c-fos, c-src, c-myc, c-lck (p 56), c-fyn (p 59) и c-abl), и/или к трансмембранным или внеклеточным антигенам (например, рецепторы гормонов полипептидной природы, такие как 1-2 рецептор; рецептор фактора роста, полученного из тромбоцитов; рецептор фактора роста эпидермиса; рецептор фактора роста нервной ткани, рецептор фактора роста или TNF рецептор).

Другие белки, на которые можно нацеливать липидизированные антитела, включают, но не исчерпываются следующим списком: с-rasp21, с-her-2 белок, с- raf, любые из разных G белков и/или белки, активирующие G белки (GАБ), факторы транскрипции, такие как NF-AT, кальцинейрин, цис-транс пролилизомеразы. Липидизированные антитела можно применять, чтобы поместить диагностический реагент, такой как рентгеноконтрастное вещество, компонент магнитного резонанса, дающий изображение, в специфический участок тела, такой как специфический орган, ткань, участок тела, тип клеток, неоплазма или другие анатомические структуры (например, патологическое поражение). Липидизированные антитела также можно применять, чтобы поместить связанные с ними лекарственные агенты, такие как химиотерапевтические препараты, радиосенсибилизирующие агенты, радионуклиды, антибиотики и другие агенты, в специфические участки тела. И наоборот, липидизированные антитела настоящего изобретения могут быть использованы в терапии для нейтрализации (т.е. для связывания и, таким образом, инактивации) внутриклеточного антигена-мишени, такого как ВИЧ-1 Tat белок, трансмембранный или связанный с мембраной антиген-мишень (например, -глутамилтранспептидаза, c-ras^H p21, rasGAP), или внеклеточный антиген-мишень (например, отложения -амилоидного белка в мозгу при болезни Альцгеймера). Липидизированные антитела могут пересекать гематоэнцефалический барьер и реагировать с внеклеточным антигеном-мишенью, который обычно недоступен для действия иммуноглобулинов, циркулирующих в крови или лимфатической системе. Липидизированные антитела также могут реагировать с внутриклеточной частью трансмембранных белков, такими как цитоплазматический конец гликопротеинов вирусной оболочки или домены протеинкиназы протоонкогенных белков (с-srс, c-abl), и, таким образом, ингибировать продукцию инфективного вируса в оболочке или активность киназы соответственно.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает структурные формулы, представляющие различные липоамины, которые можно использовать в настоящем изобретении. Правая колонка приводит примеры липоаминов с разветвленной цепью, левая колонка приводит примеры липоаминов с прямой цепью.

Фиг. 2 схематически представляет (1) гликозилированное антитело, включающее тетрамер иммуноглобулина (две легкие цепи, соединенные с двумя тяжелыми цепями) и (2) липидизированные через углевод иммуноглобулины настоящего изобретения. В качестве примера показаны липоамидные заместители с разветвленной цепью, присоединенные к частично окисленным углеводным боковым цепям тетрамера иммуноглобулина. Такие углеводные боковые цепи могут быть расположены в участках C_H, V_H, C_Z и/или V_Z.

Фиг. 3 показывает благоприятное воздействие липидизированного анти-Tat иммуноглобулина на выживание in vitro клеток, зараженных ВИЧ-1, по сравнению с отсутствием эффекта у нативного (т.е. нелипидизированного) анти-Tat иммуноглобулина. Фиг. 4 показывает, что липидизированные антитела анти-Tat значительно ингибировали активность хлорамфеникол- ацетилтрансферазы (приблизительно на 75%), в то время как нативные (нелипидизированные) анти-Tat антитела, липидизированные анти-гп 120 антитела или rs CD4 были значительно менее эффективными в ингибировании активности этого фермента в клетках HZCD4-ХАТ.

Подробное описание Определения Все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют общепринятый смысл, если не было дано иного определения, и будут легко поняты специалистами в данной области, для которых предназначено настоящее изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут применяться в практике или испытаниях настоящего изобретения, описываются предпочтительные материалы и методы. Ниже приводятся определения терминов настоящего изобретения.

В том виде, в котором они используются здесь, названия аминокислот и их аббревиатуры являются общепринятыми (Immunology-A Synthesis, 2-е издание, E. S. Golub и D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts (1991), включены в настоящий документ в качестве ссылки).

Термин "соответствует" означает, что полинуклеотидная последовательность является гомологичной (т. е. является идентичной, но не строго эволюционно родственной) всей или части полинуклеотидной последовательности, на которую ссылаются, или что полинуклеотидная последовательность является идентичной полипептидной последовательности, на которую ссылаются. В отличие от этого, термин "является комплементарной" означает, что комплементарная последовательность является гомологичной всей или части полинуклеотидной последовательности, на которую ссылаются. Для иллюстрации нуклеотидная последовательность "ТАТАЦ" соответствует последовательности "ТАТАЦ", на которую ссылаются, и является комплементарной последовательности "ГТАТА".

Термины "значительное сходство" или "значительная идентичность", как они применяются в настоящем документе, означают характеристику полипептидной последовательности или последовательности в нуклеиновой кислоте, при которой полипептидная последовательность имеет по крайней мере 59% идентичной последовательности с последовательностью, на которую ссылаются, а последовательность в нуклеиновой кислоте имеет по крайней мере 70% последовательности, идентичной той, на которую ссылаются. Процент идентичности вычисляется, исключая малые делеции или добавки, которые в сумме составляют менее 25% последовательности, на которую ссылаются. Последовательность, на которую ссылаются, может быть частью большей последовательности, такой как константная область домена константной области гена иммуноглобулина; однако последовательность, на которую ссылаются, по крайней мере на 18 нуклеотидов длиннее в случае полинуклеотидов, и по крайней мере на 6 аминокислотных остатков длиннее в случае полипептидов.

Термин "естественно встречающийся" применяется здесь к объекту, который может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории, является естественно встречающейся. Липопротеин (например, естественно встречающийся белок, содержащий изопрен или миристимовую кислоту), который может быть выделен из организма, встречающегося в природе, а не был изготовлен человеком, является естественно встречающимся липопротеином.

"Участки гликозилирования" относятся к аминокислотным остаткам, которые распознаются эукариотической клеткой в качестве участков присоединения остатков сахаров. Аминокислотами, к которым углевод, такой как олигосахарид, обычно присоединяется, являются остатки аспарагина (N-связь), серина (O-связь) и треонина (O-связь). Аминокислотная последовательность, которая обычно является сигналом специфического сайта присоединения, обозначается здесь как "последовательность участка гликозилирования". Последовательность участка гликозилирования для гликозилирования N-связью - Aсн-X-Cур или - Aсн-X-Tре, где X может быть любой из обычных аминокислот, кроме пролина. Предоминантная последовательность участка гликозилирования для гликозилирования O-связью - (тре или сер)-X-X-про, где X - любая из обычных аминокислот. Последовательность узнавания для гликозаминогликанов (специфического типа сульфатированного сахара) - -сер- гли-X-гли-, где Х является любой обычной аминокислотой. Термины "N-связь" и "О-связь" относятся к химическим группам, которые служат участками присоединения между молекулой сахара и аминокислотным остатком. N-связанные сахара присоединяются через аминогруппу; O-связанные сахара присоединяются через гидроксильную группу.

Однако не все последовательности участка гликозилирования белка обязательно гликозилированы; некоторые белки секретируются как в гликозилированной, так и в негликозилированной формах, в то время как другие полностью гликозилированы по одной последовательности участка гликозилирования, но имеют другую последовательность участка гликозилирования, которая не гликозилирована. Следовательно, не все последовательности участков гликозилирования, которые присутствуют в полипептиде, являются обязательно участками гликозилирования, к которым действительно присоединены остатки сахаров. Начальное N-гликозилирование во время биосинтеза включает "стержневой углевод" или "стержневой олигосахарид" (Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York, включенный здесь в качестве ссылки).

Применяемый здесь термин "гликозилирующая клетка" обозначает клетку, способную гликозилировать белки, в частности эукариотическую клетку, способную прибавлять N-связанный "стержневой олигосахарид", содержащий, по крайней мере, один остаток маннозы и/или способную прибавлять О-связанный сахар к, по крайней мере, одному участку гликозилирования, по крайней мере, одного полипептида, экспрессируемого названной клеткой, в частности, секретируемого белка. Так, гликозилирующая клетка обладает, по крайней мере, одной ферментативной активностью, которая катализирует присоединение остатка сахара к последовательности гликозилирующего участка белка или полипептида, и эта клетка действительно гликозилирует, по крайней мере один экспрессируемый полипептид. Для примера, но не ограничения, клетки млекопитающих являются типичными гликозилирующими клетками. Другие эукаристические клетки, такие как клетки насекомых или дрожжи, могут быть гликозилирующими клетками.

Применяемый здесь термин "антитело" относится к белку, состоящему из одного или более полипептидов, главным образом кодируемых генами надсемейства иммуноглобулинов (например, см. The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams and A.N. Barclay, в Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F.W. Alt, и T. H. Rabbitts, eds. , (1989) Academic Press: San Diego, CA, стр. 361-387, которая включена здесь в качестве ссылки). Для примера, но не ограничения, антитело может включать часть или целую тяжелую цепь, часть или всю легкую цепь, или может включать только часть или целую тяжелую цепь. Ген узнавания иммуноглобулина включает каппа-, лямбда-, альфа-, гaммa(IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄), дельта-, эпсилон- и мю-гены константной области, а также бесчисленные гены вариабельных областей иммуноглобулина. "Легкие цепи" иммуноглобулинов (около 25 кДа или 214 аминокислот) кодируются вариабельным участком гена NH₂-конца (около 110 аминокислот), а каппа- или лямбда константные области генов на COOH-конце. "Тяжелые цепи" иммуноглобулинов (около 50 кДа или 446 аминокислот) также кодируются вариабельной областью гена (около 116 аминокислот) и одной из ранее упомянутых констант областей гена, например гамма (кодирует около 330 аминокислот). Антитела включают, но не исчерпываются следующим перечнем: фрагменты иммуноглобулинов (например, Fab, F(ab)₂, Fv), иммуноглобулины, состоящие из одной цепи, химерные иммуноглобулины, гуманизированные иммуноглобулины, приматизированные иммуноглобулины и различные комбинации легкая цепь-тяжелая цепь. Антитела могут вырабатываться в гликозилирующих клетках (например, в лимфоцитах человека, клетках гибридомы, дрожжевых клетках и т.д.), в негликозилирующих клетках (например, Е. coli) или синтезироваться химическими способами или производиться системами трансляции in vitro с использованием полинуклеотидной матрицы для прямой трансляции.

Применяемый здесь термин "липидизированное антитело" означает антитело, модифицированное таким образом, что получается липидное производное (например, ковалентное присоединение липоамина, такого как глицилдиоктадециламид, дилауроилфосфатидилэтаноламин или диоктадециламидоглицилспермидин) по одной или более углеводной доле, соединенной с иммуноглобулином в участке гликозилирования. В основном, липидный заместитель, такой как липоамин, ковалентно соединен через естественно встречающуюся углеводную часть в естественно встречающемся участке гликозилирования. Однако возможно получить иммуноглобулины с измененной последовательностью участка гликозилирования (в типичном случае, путем сайт-направленного мутагенеза полинуклеотидов, кодирующих цепи иммуноглобулина) и/или измененным характером гликозилирования (например, путем экспрессии кодирующих иммуноглобулин полинуклеотидов в гликозилирующих клетках, иных чем лимфоциты или в лимфоцитах других видов). Липидные заместители могут быть присоединены к одной или более естественно встречающейся или не естественно встречающейся углеводной части цепи иммуноглобулина. В случае, когда антитело производится путем прямого полипептидного синтеза или путем биосинтеза в негликозилирующих клетках (например, демонстрационной библиотеки фагов), в основном необходимо присоединение углеводного заместителя путем химической или энзимной модификации для последующего липидизирования (напротив, углевод можно липидизировать до присоединения к иммуноглобулину).

Применяемый здесь термин "липидизированный белок" относится к белку (включая мультимерные белки, гликопротеины и полипептиды различной длины), который был модифицирован путем присоединения липида (например, липоамина), в основном, через углеводную часть. Липидизированный белок приготовляется путем получения такого производного белка, в результате которого липидизированный белок отличается от естественно встречающихся связанных с липидами белков и липопротеинов. Для белков, обладающих биологической активностью (например, ферментов, рецепторов, факторов транскрипции), липидизирование не должно существенно уменьшать биологическую активность (например, по крайней мере 15% нативной биологической активности должны быть сохранены в липидизированном белке). Липидизированные пептидомиметики должны сохранять, по крайней мере, от 25 до 95% фармакологической активности соответствующего нелипидизированного пептидомиметика.

"Алкил" относится к полностью насыщенной алифатической группе, которая может быть прямой, разветвленной или циклической. Алкильные группы включают группы, примерами которых могут быть: метил, этил, циклопропил, циклопропилметил, sec-бутил, гептил и додецил. Все вышеперечисленные группы могут быть как незамещенными, так и замещенными неинтерферирующими заместителями, например галогеном; C₁-C₄ алкокси; C₁-C₄ ацилокси; формил; алкилендиокси; бензилокси; фенил или бензил, каждый из которых факультативно замещен от 1 до 3 заместителями, выбранными из галогена, C₁-C₄ алкокси или C₁-C₄ ацилокси. Термин "неинтерферирующий" характеризует заместители как не оказывающие вредного влияния на любые реакции, которые будут выполняться в соответствии с процедурой настоящего изобретения. Если в данной молекуле присутствует более одной алкильной группы, каждую из них можно независимо выбирать из группы "алкил", если не оговорено иное.

"Алкилен" относится к полностью насыщенному двухвалентному радикалу, содержащему только углерод и водород, и который может быть разветвленным или с прямой цепью. Этот термин в дальнейшем иллюстрируется такими примерами, как метилен, этилен, n-пропилен, t-бутилен, i-пентилен, n-гептилен и им подобными. Все перечисленные выше радикалы могут быть незамещенными или замещенными одним или более неинтерферирующими заместителями, например галогеном; C₁-C₄ алкокси; C₁-C₄ ацилокси; формил; алкилендиокси; бензилокси; фенил или бензил, каждый из которых факультативно замещен от 1 до 3 заместителями, выбранными из следующей группы: галоген, C₁-C₄ алкокси или C₁-C₄ ацилокси. Термин "неинтерферирующий" характеризует заместители, как не оказывающие неблагоприятного влияния на любые реакции, которые должны быть выполнены в соответствии с процедурой настоящего изобретения. Если в данной молекуле присутствует более одной алкиленовой группы, каждая из них может независимо избираться из группы "алкилены", если не оговорено иное.

"Арил", обозначаемый A_r, включает моноциклические или конденсированные карбоциклические ароматические группы из 6-20 атомов углерода. Арильные группы включают приведенные здесь в качестве примера фенил и нафтил. Эти группы могут быть замещены одним или более неинтерферирующими заместителями, например, выбранными из следующей группы: низший алкил, низший алкенил, низший алкинил, низший алкокси, низший алкилтио, низший алкилсульфинил, низший алкилсульфонил, диалкиламин, галоген, гидрокси, фенил, фенилокси, бензил, бензоил и нитро. Каждый заместитель может быть факультативно замещен добавочными неинтерферирующими заместителями.

"Амино" относится к группе -NH₂.

"Алкилкарбонил" относится к группе -(chr₁)-CO-, в которой R₁ является дополнительно обозначенной -позицией. R₁ может быть водородом, алкилом или аминогруппой. Предпочтительно R₁ является аминогруппой.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения В соответствии с настоящим изобретением созданы новые способы для облегчения химически модифицированным белкам, таким как антитела, прохождения через капиллярные барьеры и внутрь клеток. В целом, способы включают ковалентное присоединение по крайней мере одного неинтерферирующего липидного заместителя (например, глицилдиоктадециламида, глицилдигептадециламида, глицилдигексадециламида, дилауроилфосфатидилэтаноламина и глицилдиоктадекадиеноиламида) к реактивному участку молекулы белка (например, к окисленной периодатом углеводной части). Различные неинтерферирующие липидные заместители могут быть присоединены к белкам для получения липидизированных белков, таких как липидизированные антитела настоящего изобретения. Для примера, но не для ограничения, можно привести примеры липидов, которые можно присоединять к белкам, представляющим интерес, для получения липидизированного белка: липоамины, липополиамины, жирные кислоты (например, стеариновая кислота, олеиновая кислота и другие). В общих чертах, липид должен быть присоединен ковалентной связью к углеводу, связанному с белком (например, к углеводной боковой цепи гликопротеина). Предпочтительно использовать естественно встречающиеся углеводные боковые цепи для присоединения липоамина, хотя могут быть созданы и новые участки гликозилирования в полипептиде посредством манипуляций генетического характера с кодирующим полинуклеотидом и экспрессии кодирующего полинуклеотида в гликозилирующей клетке для получения гликозилированного полипептида.

Гликозилированные белки можно липидизировать для усиления его транссосудистого транспорта, поглощения органом и внутриклеточного проникновения, включая проникновение внутрь ядра клетки. В целом, гликозилированный полипептид, такой как антитело, окисляют посредством химического окислителя (например, периодата) для получения дополнительных карбоксильных и/или альдегидных групп, и он реагирует с липоамином для формирования ковалентной (амидной или имидной, соответственно) связи липоамина и белка.

В типичном случае, окисление углеводной боковой цепи является частичным окислением, в результате которого образуется по крайней мере одна реактивная карбоксильная или альдегидная группа, хотя, в основном, методы химического окисления производят некоторое количество молекул, которые окислены частично, и некоторое количество молекул, которые не окислены или окислены полностью. Однако, чтобы быть липидизированным реакцией с липоамином, белку необходимо быть окисленным для получения по крайней мере одной дополнительной альдегидной группы, которая может прореагировать с липоамином, несмотря на то, что возможно получить липидизированные белки путем связи также с дополнительными карбоксильными группами. Дополнительная карбоксильная или альдегидная группа окисленного гликопротеина является карбоксильной или альдегидной группой с карбонильным углеродом, полученным от окисленного олигосахарида, и который ковалентно связан с белком, как непо