Тромбоцитспецифичный химерный иммуноглобулин и методы его использования

Тромбоцитспецифичный химерный иммуноглобулин и методы его использования

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к тромбоцитспецифичным химерным иммуноглобулинам и их применению. Сущность изобретения: пациенту для ингибирования стеноза и/или рестеноза назначают эффективное количество химерного иммуноглобулина или его фрагмента, обладающего специфичностью к гликопротеину IIb/IIIа, при этом указанный иммуноглобулин или фрагмент содержит область связывания антигена, не принадлежащую человеку и специфичную к гликопротеину IIb/IIIа, и константную область иммуноглобулина человека. Изобретение позволяет снизить количество аллергических реакций. 8 с. и 25 з. п. ф-лы, 26 табл., 15 ил.

Агрегация тромбоцитов играет важную роль при образовании сгустков крови. При обычных обстоятельствах сгустки крови служат для предотвращения потери крови из сосудистой системы. Однако при определенных болезненных состояниях сгустки крови могут создавать препятствия потоку крови или полностью его перекрывать, что приводит к некрозу клеток.

Например, агрегация тромбоцитов и последующий тромбоз в месте атеросклеротической бляшки является важным причинным фактором в генезисе таких состояний, как стенокардия, острый инфаркт миокарда и повторная закупорка после успешно проведенного тромболиза и пластической операции на сосудах. Пациентов, подверженных стенокардии, обычно лечат с использованием тромболитических средств, таких как тканевый активатор плазминогена или стрептокиназа, которые растворяют фибриновый компонент сгустков. Основным осложнением, связанным с фибринолизом, является повторная закупорка вследствие агрегации тромбоцитов, которая приводит к дальнейшему поражению сердца. Поскольку, как известно, рецепторы гликопротеина (GP)IIb/IIIa отвечают за агрегацию тромбоцитов, то можно ожидать, что реагенты, которые блокируют указанные рецепторы, будут снижать или препятствовать повторной закупорке после применения тромболитической терапии и увеличивать скорость тромболиза. Можно ожидать, что подобные реагенты будут полезны при терапии других заболеваний, связанных с закупоркой сосудов, и терапии тромбоэмболических заболеваний.

В одном из подходов к блокированию агрегации тромбоцитов используют моноклональные антитела, специфичные для рецепторов GPIIb/IIIa. Муриновые моноклональные антитела, которые приводятся в Европейских патентных заявках с номерами 205207 и 206532, обозначенные как 7EЗ, подавляют агрегацию тромбоцитов и, вероятно, полезны при лечении тромботических заболеваний человека. Из области техники известно, что муриновые антитела обладают свойствами, которые могут в значительной степени ограничить их использование в терапии человека. Являясь инородными белками, муриновые антитела способны вызывать иммунные реакции, которые снижают или нивелируют их терапевтическую эффективность и/или приводят к возникновению аллергических ответных реакций или повышенной чувствительности у пациентов. Потребность в повторном назначении этих лечебных процедур при тромбоэмболических заболеваниях повышает вероятность возникновения иммунных реакций указанного типа.

Химерные антитела со связывающими областями, не принадлежащими человеку, которые соединены с константными областями, принадлежащими человеку, предложены в качестве средств, позволяющих обойти проблемы, вызываемые иммуноактивностью муриновых антител (см. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984) и Международную заявку N PCT/GB85 00392). Поскольку константная область в значительной степени ответственна за иммуноактивность молекулы антитела, то химерные антитела с константными областями человеческого происхождения должны в меньшей степени вызывать антимуриновую ответную реакцию у людей. Однако заранее нельзя определить, приведет ли присоединение константной области человека к муриновой связывающей области, обладающей требуемой специфичностью, к снижению иммуноактивности и/или изменению связывающей способности полученного химерного антитела.

Настоящее изобретение относится к тромбоцитспецифичным химерным иммуноглобулинам, содержащим вариабельную область или область связывания антигена, не принадлежащую человеку, и константную область, принадлежащую человеку. Химерные иммуноглобулины могут быть специфичными для рецептора GPIIb/IIIa или других компонентов тромбоцита. Указанные антитела связываются с тромбоцитами и могут блокировать агрегацию тромбоцитов и, таким образом, полезны в качестве антитромботических средств для предотвращения или уменьшения вероятности закупорки или повторной закупорки сосудов в различных клинических ситуациях (в частности, после тромболитической терапии, которая проводится одновременно с проведением пластической операции на сосудах) или для предотвращения стеноза или повторного стеноза. Антитромбоцитарные антитела по настоящему изобретению полезны также при получении изображения тромба.

На фиг. 1 приведен результат анализа по методу назерн-блоттинга тяжелой цепи и легкой цепи мРНК для моноклонального антитела 7E3 с использованием в качестве зондов клонированных вариабельных областей.

На фиг. 2A и 2B схематично представлены плазмиды p7E3V_KC_K (фиг.2A) и p7E3V_Hh C₄ (фиг. 2B), которые содержат химерные генно-инженерные конструкции, кодирующие, соответственно, легкие и тяжелые цепи химерного иммуноглобулина 7E3.

Фиг. 3 иллюстрирует связывание химерного иммуноглобулина 7E3, кодируемого векторами p7E3V_KhC_K и p7E3V_Hh C₄, c тромбоцитами.

На фиг. 4 показано подавление агрегации тромбоцитов химерным иммуноглобулином 7E3 (c7E3).

На фиг. 5 приведен график концентрации антитела в плазме (нг/мл) в зависимости от времени (в днях), который показывает быстрое первоначальное выведение c7E3 Fab (₁, K) из плазмы пациентов, страдающих от хронического заболевания коронарных сосудов, после введения дозы 0,20 мг/кг c7E3 Fab в виде внутривенного вливания в течение пяти минут.

Фиг. 6 (A-C) поясняет в обобщенном виде влияние на активность тромбоцитов дозы химерного 7E3 Fab в виде одного болюса (0,15 мг/кг, 0,20 мг/кг или 0,25 мг/кг) через 2 час после назначения антитела (₁, K) Зависимая от дозы ответная реакция наблюдается при изучении активности тромбоцитов с точки зрения блокады рецептора (фиг. 6A, вверху), агрегации тромбоцитов (фиг. 6B, посредине) и времени кровотечения (фиг. C, внизу). Линии соответствуют средним значениям.

Фиг. 7 (A-C) иллюстрирует продолжительность антитромбоцитарного воздействия химерного 7E3 Fab (₁, K), назначаемого перед проведением пластической операции на сосудах в виде одного болюса с дозой 0,25 мг/кг. Линии соответствуют средним значениям от времени ноль (базовая линия) и до 24 часов для блокады рецептора (фиг. 7A, вверху), агрегации тромбоцитов (фиг. 7B, посредине) и времени кровотечения (фиг. 7C, внизу).

Фиг. 8 (A-C) иллюстрирует суммарную антитромбоцитарную активность одного болюса с дозой 0,25 мг/кг с последующим непрерывным вливанием в течение 12 час (10 мкг/мин) химерного 7E3 Fab (₁, K) у одиннадцати пациентов. Линии соответствуют средним значениям, определенным для выраженной в процентах блокады рецептора (фиг. 8A, вверху), выраженной в процентах степени агрегации тромбоцитов для предварительной дозы (базовая линия во время ноль) (фиг. 8B, посредине) и времени кровотечения (фиг. 8C, внизу).

Фиг. 9 иллюстрирует абсолютное изменение в гематокритном числе от базового значения в течение 24 час после окончания вливания для 47 пациентов, описанное в Примере 4.

Фиг. 10 представляет собой график Каплана-Мейера, который иллюстрирует зависимость вероятности не вызванного необходимостью повторного чрескожного восстановления сосудов от времени рандомизации для трех испытуемых групп.

На фиг. 11 в виде диаграммы приведены вероятностные коэффициенты для 95%-ных доверительных интервалов для ключевых подгрупп (перечислены справа), которых подвергают испытаниям. Данные приведены для основных случаев прекращения проведения испытаний (смерть, нефатальный инфаркт миокарда, экстренная пластическая операция на сосудах или размещение коронарного стента или внутриаортального баллонного насоса при стойкой ишемии). Кроме того, слева в виде таблицы приведены абсолютные значения по частоте наблюдения основных случаев прекращения испытаний в каждой подгруппе (Частота случая (%)).

На фиг. 12 приведен график, показывающий долю всех пациентов, у которых отмеченные случаи не выявлены в течение шестимесячного периода наблюдения.

На фиг. 13 приведен график, показывающий долю тех пациентов, у которых отмеченные случаи не выявлены в течение шестимесячного периода наблюдения и у которых проведено успешное хирургическое вмешательство, не имевшее последствий по прошествии 30 дней.

На фиг. 14 приведен график, показывающий долю тех пациентов, у которых отмеченные случаи не отмечены в течение шестимесячного периода наблюдения, и учитывающий тех пациентов, у которых отмеченные случаи выявляются через 48 часов после первоначально успешного хирургического вмешательства.

На фиг. 15 приведен график, показывающий долю всех пациентов, у которых не отмечены попытки восстановления кровеносных сосудов в подвергнутой операции артерии в течение шестимесячного периода наблюдения.

Химерные иммуноглобулины по настоящему изобретению состоят из индивидуальной химерной тяжелой и легкой цепочек иммуноглобулина. Химерная тяжелая цепочка включает антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепочки не принадлежащего человеку антигена, специфичного для тромбоцитов (в частности, специфичного для рецептора GPIIb/IIIa), которая привязана к константной области тяжелой цепочки человека. Химерная легкая цепочка включает антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепочки не принадлежащего человеку антигена, которая привязана к константной области легкой цепочки человека.

Иммуноглобулины по настоящему изобретению могут быть одновалентными, бивалентными или поливалентными. Одновалентные иммуноглобулины (HL) представляют собой димеры, образованные химерной тяжелой цепочкой, которая связана посредством дисульфидных мостиков с химерной легкой цепочкой. Бивалентные иммуноглобулины представляют собой тетрамеры (H₂L₂), образованные двумя димерами, связанными по крайней мере с помощью одного дисульфидного мостика. Могут быть также получены поливалентные иммуноглобулины, например, за счет агрегации константной области тяжелой цепочки (в частности, константных областей тяжелой цепочки). Могут быть также получены фрагменты химерных иммуноглобулинов, такие как Fab, Fab' или F(ab')₂.

Не принадлежащие человеку антигенсвязывающие области химерного иммуноглобулина получают из иммуноглобулинов, специфичных для тромбоцитов. Предпочтительными иммуноглобулинами являются иммуноглобулины, специфичные для рецепторов GPIIb/IIIa тромбоцитов, которые способны блокировать связывание лиганда с рецепторным комплексом гликопротеина IIb/IIIa.

Тромбоз начинается с прилипания тромбоцитов в местах поражения стенок сосуда. Процесс прикрепления тромбоцитов протекает под контролем поверхностных рецепторов тромбоцитов, которые связываются белками внеклеточной матрицы обнажившейся поверхности субэндотелиального слоя, такими как фактор фон Виллебранда, коллаген, фибронектин, витронектин и ламинин. Прилипание тромбоцитов приводит к образованию составленного ими монослоя. Далее, в ответ на действие агониста, такого как эпинефрин, АДФ, коллаген и тромбин, происходит активация тромбоцитов. Активация приводит к воздействию рецептора гликопротеина IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) на поверхность тромбоцитов. После этого GPIIb/IIIa на активированных тромбоцитах становится доступен для связывания с фибриногеном, который стимулирует агрегацию тромбоцитов. Связывание GPIIb/IIIa с другими адгезивными белками, такими как фактор фон Виллебранда, также вызывает сшивку и агрегацию тромбоцитов. Таким образом, связывание адгезивных молекул, таких как фибриноген или фактор фон Виллебранда, к GPIIb/IIIa, вызывающее агрегацию тромбоцитов, представляет собой обычную стадию в процессе образования тромба, что делает рецептор GPIIb/IIIa привлекательной мишенью для терапевтических средств, которые могут помешать взаимодействию GPIIb/IIIa с указанными молекулами. Более того, можно ожидать, что при использовании анти-GPIIb/IIIa химерного антитела будет подавляться агрегация активированных тромбоцитов, при этом процесс первичного прилипания тромбоцитов не нарушается. Селективное ингибирование агрегации тромбоцитов может оказаться желательным, поскольку прилипание тромбоцитов, не сопровождающееся агрегацией, может способствовать остановке кровотечения.

Примерами подходящих антител, специфичных для тромбоцитов, являются 7E3 и 10E5. См. Европейские патентные заявки с номерами 205207 и 206532, описания которых приводятся здесь для справок. Антитело 7E3 (или взаимодействующее с ним антитело или функционально эквивалентный эпитоп) является наиболее предпочтительным постольку, поскольку оно является специфичным для комплексной формы рецептора GPIIb/IIIa. Могут также использоваться другие антитела, специфичные для рецептора GPIIb/IIIa (антигена, который распознает 7E3), такие как антитела, специфичные для любого из компонентов IIb или IIIa. Могут использоваться антитела, специфичные для других антигенов тромбоцитов. Например, могут применяться антитела, способные взаимодействовать с протеиновым зерном альфа-мембраны тромбоцита GMP-140, такие как антитело S12 (J. Biol. Chem., 259: 9799-9804 (1984); Патент США 4783330).

Антигенсвязывающая область химерного антитела может быть получена из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Антигенсвязывающая область имеет предпочтительно муриновое происхождение, поскольку муриновые антитела против тромбоцитов и, в частности, рецепторов GPIIb/IIIa, доступны или могут быть получены в муриновых системах. Альтернативными источниками антигенсвязывающих областей являются другие виды животных или грызунов (см., например, Newman et al. , Bio/Technology, 10: 1455-1460 (1992). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая область химерного иммуноглобулина содержит по крайней мере часть тромбоцитспецифичного иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, достаточную для специфического или селективного связывания гена, такую как один или несколько гипервариабельных участков или их частей, выделенных из не принадлежащего человеку иммуноглобулина (см., в частности, Winter, Патент США 5225539, Европейская патентная заявка 0239400, Патент Великобритании 2188638; Adair et al., Международная патентная заявка WO 91/09967; Jolliffe et al., Международная патентная заявка WO 91/09966). В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный иммуноглобулин включает по крайней мере одну химерную тяжелую цепочку, содержащую вариабельный участок, выделенный из тяжелой цепочки не принадлежащего человеку иммуноглобулина, которая соединена с по крайней мере частью константной области тяжелой цепочки человека, и по крайней мере одну химерную легкую цепочку, содержащую вариабельный участок, выделенный из легкой цепочки не принадлежащего человеку иммуноглобулина, которая соединена с по крайней мере частью константной области легкой цепочки человека. Возможны также и другие комбинации вариабельных и константных областей (см., частности, Патент США 5169939).

Константные области химерных антител получают из иммуноглобулинов человека. Константную область тяжелой цепочки можно выбрать из одного из пяти изотипов альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю. Более того, тяжелые цепочки различных подклассов (таких как подклассы IgG тяжелых цепочек) отвечают за различные функции эффектора и, таким образом, выбирая константную область нужной тяжелой цепочки, можно получить химерные антитела с требуемой эффекторной функцией. Предпочтительными константными областями являются гамма 1 (IgG1), гамма 3 (IgG3) и гамма 4 (IgG4). Константная область легкой цепочки может быть типа каппа или лямбда.

В общем случае химерные антитела получают, подготавливая для каждого из компонентов легкой или тяжелой цепи химерного иммуноглобулина ген слияния, включающий первый сегмент ДНК, который кодирует по крайней мере функциональную часть тромбоцитспецифичной вариабельной области, не принадлежащей человеку (например, функционально перестроенный вариабельный участок вместе с соседними сегментами) и связанной со вторым сегментом ДНК, который кодирует по крайней мере часть константной области иммуноглобулина человека. Каждый ген слияния собирают или вводят в вектор экспрессии, получая вектор экспрессии, который содержит ген слияния в способной экспрессироваться форме. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ДНК, включающая область связывания антигена, ковалентно соединяется с константной областью посредством интрона. В другом варианте осуществления настоящего изобретения могут быть созданы или получены генно-инженерные конструкции, у которых отсутствует один или несколько интронов. Затем подвергают трансфекции генами клетки реципиента, способные экспрессировать генные продукты. Подвергнутые трансфекции клетки реципиента выращивают в условиях, позволяющих провести экспрессию введенных генов, а затем экспрессированные иммуноглобулины или цепочки иммуноглобулина выделяют.

Гены, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, могут быть получены из лимфоидных клеток, которые продуцируют тромбоцитспецифичные антитела. Например, гибридомные клеточные линии являются источником вариабельной области иммуноглобулина для химерных антител по настоящему изобретению. Доступны также и другие клеточные линии грызунов. Клеточные линии можно получить, вводя грызуну провокационную пробу тромбоцитов человека, или компонент, содержащий рецептор GPIIb/IIIa, или фракции тромбоцитов, формируя слитые гибридные клетки между клетками, продуцирующими антитела, и клеточной линией миеломы, подвергая гибрид клонированию и отбирая клоны, которые продуцируют антитела против тромбоцитов или рецептора гликопротеина IIb/IIIa.

Константные области можно получить из продуцирующих антитела клеток человека, используя стандартные методики клонирования. Иначе, поскольку клонированию подвергают гены, представляющие два класса легких цепочек и пять классов тяжелых цепочек, из этих клонов легко получают константные области, принадлежащие человеку, связывающие фрагменты химерного антитела, такие как фрагменты F(ab')₂ или Fab, могут быть получены путем конструирования химерного гена тяжелой цепочки в усеченной форме. Например, химерный ген, кодирующий часть F(ab')₂ тяжелой цепочки будет включать ДНК последовательности, кодирующие область CH и область "талии" тяжелой цепочки. В качестве альтернативы подобные фрагменты можно получить ферментативным расщеплением химерного иммуноглобулина. Например, расщеплением с использованием папаина или пепсина можно генерировать, соответственно, фрагменты Fab или F(ab')₂.

Гены слияния, кодирующие легкие и тяжелые химерные цепочки (или их порции) преимущественно собирают в двух различных векторах экспрессии, которые можно использовать для котрансгенного переноса в клетки реципиента. Каждый вектор содержит два селектируемых гена - один для селекции в бактериальной системе, а второй в селекции в эукариотной системе, - при этом каждый вектор имеет разную пару генов. Указанные векторы позволяют осуществить продуцирование и амплификацию гена слияния в бактериальной системе и последующий котрансгенный перенос в эукариотные клетки и селекцию клеток, подвергнутых котрансгенному переносу. Примерами селектируемых генов для использования в бактериальной системе являются гены, которые придают устойчивость к действию ампицилина, и гены, которые придают устойчивость по отношению к действию хлорамфеникола. Предпочтительны два селектируемых гена: (i) ген ксантан-гуанинфосфорибозилтрансферазы (gpt) и (ii) ген фосфотрансферазы из Tn5 (обозначают как neo). Селекция с помощь gtp основана на способности фермента, кодируемого указанным геном, использовать ксантин в качестве субстрата при синтезе пуриновых нуклеотидов; аналогичные эндогенные ферменты такой способностью не обладают. В среде, содержащей ксантин и микофенольную кислоту, которая блокирует превращение монофосфата инозина в монофосфат ксантина, могут выжить лишь клетки, экспрессирующие ген gpt. Продукт гена neo блокирует ингибирование синтеза белка в эукариотных системах, вызванное антибиотиком G418 и другими антибиотиками этого класса. Две процедуры селекции могут использоваться одновременно или последовательно для отбора экспрессии генов иммуноглобулиновой цепочки, введенных в эукариотную клетку в двух различных ДНК векторах.

Предпочтительной клеточной линией реципиента является клетка миеломы. Клетки миеломы могут синтезировать, осуществлять сборку и секретировать иммуноглобулины, кодируемые подвергнутыми трансфекции генами иммуноглобулина. Более того, они владеют механизмом гликозилирования иммуноглобулина. Особенно предпочтительной клеткой реципиента является непродуцирующая линия клеток миеломы, такая как Sp2/0. Указанные клеточные линии продуцируют лишь иммуноглобулин, кодируемый подвергнутыми трансфекции генами иммуноглобулина. Клетки миеломы могут быть выращены в среде для выращивания культуры или в брюшине мыши, а секретируемый иммуноглобулин может быть выделен из асцитной жидкости. В качестве подходящих клеток реципиента могут служить другие лимфоидные клетки, такие как B-лимфоциты или клетки гибридомы.

Существует несколько способов трансфекции лимфоидных клеток векторами, содержащими гены, кодирующие иммуноглобулин. Предпочтительным способом введения ДНК в лимфоидные клетки является электропорация. При осуществлении этой методики клетки реципиента подвергают воздействию электрических импульсов в присутствии ДНК, которую необходимо ввести (см., например, Potter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161 (1984)). Другим способом введения ДНК является слияние протопластов. В этом методе для удаления стенок клетки бактерии, которая скрывает рекомбинантную плазмиду, содержащую химерный ген иммуноглобулина, используют лизоцим. Полученные сферопласты сливают с клетками миеломы в присутствии полиэтиленгликоля. После слияния протопластов трансфектанты отбирают и выделяют. Еще одним способом, который может использоваться для введения ДНК во многие типы клеток, является осаждение фосфатом кальция.

Гены химерного иммуноглобулина могут экспрессироваться также в нелимфоидных клетках, таких как бактерии или дрожжи. При экспрессии в бактерии тяжелые цепочки и легкие цепочки становятся частью телец включения. Таким образом, цепочки должны быть изолированы и очищены, а затем собраны в функциональные молекулы иммуноглобулина. Существуют и другие способы для экспрессии в E. coli (см., в частности, A. Pluckthun, Bio/Technology, 9: 545-551 (1991); A. Skerra et al., Bio/Technology, 9: 273-278 (1991)), в том числе секреция из E. coli в виде слитых белков, содержащих сигнальную последовательность.

Использование тромбоцитспецифичных химерных иммуноглобулинов Химерные тромбоцитспецифичные антитела по настоящему изобретению полезны в качестве антитромботических терапевтических средств. Например, химерные антитела (или их фрагменты) могут использоваться для подавления агрегации тромбоцитов и образования тромба у пациентов, имеющих тромб или подверженных риску образования тромба. Антитела могут также использоваться для подавления отклонений в менструальном цикле, вызываемых агрегацией тромбоцитов, которая может предшествовать образованию или преобразованию тромбов. Антитела могут использоваться в различных ситуациях, когда следует предотвратить образование или преобразование (окклюзию) тромбов. Более того, антитела могут использоваться в различных ситуациях, когда следует подавить (снизить, отсрочить или предотвратить) стеноз или рестеноз.

Например, пациенты, подверженные риску или страдающие от заболеваний коронарных артерий, могут почувствовать облегчение при назначении эффективного количества фрагментов химерных антитромбоцитных антител по настоящему изобретению (в частности, химерное антитело GPIIb/IIIa или предпочтительно его фрагмент, такой как химерный 7E3 Fab или F(ab')₂), с целью подавления окклюзии, реокклюзии, стеноза и/или рестеноза сосудов.

Например, антитела могут назначаться индивидууму (в частности, млекопитающему, такому как человек) для предотвращения тромбоза при легочной эмболии, преходящего ишемического нарушения мозгового кровообращения, глубокого венозного тромбоза, при проведении операции по шунтированию коронарной артерии, хирургической операции по установке искусственного клапана сердца или сосуда (в частности, собственного, несобственного или синтетического трансплантанта сосуда). Антитела по настоящему изобретению могут также назначаться индивидууму, с целью предотвращения агрегации тромбоцитов и тромбоза до, во время и после пластических операций на сосудах, которые проводятся методами баллонной коронарной атеректомии, лазерной пластической операции на сосудах или другими подходящими способами. Антитело может назначаться перед проведением пластических операций на сосудах, во время проведения пластических операций на сосудах и после проведения пластических операций на сосудах. Подобная обработка может предотвратить тромбоз и, таким образом, снизить вероятность тромботических осложнений после проведения пластических операций на сосудах, таких как смерть, инфаркт миокарда или рецидивы ишемии, которые приводят к необходимости проведения чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии или операции по шунтированию коронарной артерии (в случаях острой ишемии). Кроме того, подобное лечение может привести к более продолжительному положительному воздействию за счет снижения вероятности ишемии или осложнений при проведении хирургического вмешательства на коронарной артерии (в частности, при проведении пластических операций на сосудах), таких как смерть, инфаркт миокарда или рецидивы ишемии, которые приводят к необходимости проведения чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии или операции по шунтированию коронарной артерии (при проведении операций по реваскуляризации), что подтверждается уменьшением вероятности возникновения, отсрочкой или предотвращением стеноза или повторного сужения просвета сосуда.

Например, как показано в Примере 4, назначение химерного антитромбоцитного антитела (фрагмента химерного 7E3 Fab) в качестве вспомогательной терапии перед проведением пластической операции на кровеносных сосудах (чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии) эффективно увеличивает время кровотечения и снижает индуцируемую агонистом агрегацию тромбоцитов, что подтверждается ex vivo анализом агрегации тромбоцитов. Результаты исследований, приведенные в Примерах 4 и 5, также показывают, что блокада GPIIb/IIIa тромбоцитов и подавление агрегации под действием антитела c7E3 (фрагмента Fab) приводит к in vivo антитромботической эффективности при лечении людей.

Результаты рандомизованного обезличенного анализа с использованием плацебо в качестве контроля при назначении фрагмента химерного антитела 7E3 приведены в Примерах 6 и 7. Данные, представленные в Примере 6, свидетельствуют о том, что назначение фрагмента химерного антитела 7E3 пациентам, которым проводят пластические операции на сосудах и которые подвержены значительному риску внезапной закупорки (окклюзии) сосудов, может предотвратить внезапную закупорку (окклюзию) сосудов и уменьшить вероятность возникновения острой ишемии. Как далее показано в Примере 7, назначение фрагмента химерного антитела пациентам, которым проводят пластические операции на сосудах и которые подвержены значительному риску внезапной закупорки (окклюзии) сосудов, может позднее уменьшить, отсрочить и/или предотвратить развитие рестеноза.

Долговременное полезное воздействие проявляется в снижении вероятности возникновения неострых ишемических осложнений при назначении фрагмента химерного антитела анти-GPIIb/IIIa (см. Пример 7) является беспримерным. С целью предотвращения или уменьшения вероятности возникновения стеноза или рестеноза, могут использоваться дополнительные соединения, которые селективно связываются с рацептором GPIIb/IIIa; полезное клиническое воздействие при этом проявляется в уменьшении вероятности возникновения неострых ишемических осложнений. После их назначения указанные соединения могут дополнительно препятствовать закупорке или повторной закупорке сосудов. Указанные соединения включают, например, антагонисты GPIIb/IIIa, иммуноглобулин или неиммуноглобулиновые пептиды или белки (в частности, синтетические, рекомбинантные), их аналоги и нуклеиновые кислоты и аналоги нуклеиновых кислот. Пациенты, подверженные риску или страдающие от заболеваний коронарных артерий, могут ощутить полезное воздействие при назначении эффективного количества соединения, которое селективно связывается с рецептором GPIIb/IIIa, тем самым подавляя закупорку, повторную закупорку, стеноз и/или рестеноз сосудов.

Агрегация тромбоцитов активирует систему свертывания крови и приводит к формированию более устойчивой фибриновой сетчатой структуры и закупоривающего сгустка, которые могут подвергаться лизису под действием тромболитических средств. Антитела по настоящему изобретению или соединения, которые селективно связываются с рецептором GPIIb/IIIa, могут назначаться индивидууму (в частности, человеку) самостоятельно или в сочетании с тромболитическим средством, таким как активатор плазминогена (в частности, клеточный активатор плазминогена, урокиназа, стрептокиназа, рекомбинантный клеточный активатор плазминогена), или антикоагулянтом (в частности, антитромбиновым средством), или антитромбоцитарным средством, таким как аспирин, гепарин, гирулог, гирудин или кумариновые антикоагулянты (в частности, варфарин), например, с целью предотвращения и снижения вероятности повторной закупорки сосудов, которая может возникнуть после тромболиза, и с целью ускорения лизиса сгустка. Соединения, антитело или его фрагмент могут также назначаться до, вместе или после назначения тромболитического средства, антитромбинового средства, антикоагулянта или антитромбоцитарного средства в количествах, достаточных для предотвращения агрегации тромбоцитов, в результате которой может возникнуть закупорка или повторная закупорка сосуда, и/или для того, чтобы отсрочить или предотвратить развитие стеноза или рестеноза.

Эффективное количество (т.е. количество, достаточное для достижения желаемого терапевтического эффекта, такое как количество, достаточное для ингибирования агрегации тромбоцитов и тем самым для подавления образования или преобразования тромба, или количество, достаточное для предотвращения или отсрочки развития стеноза, или рестеноза, или случаев ишемии) соединения или антитела, или фрагмента антитела, может назначаться парентерально, преимущественно внутривенно, в фармацевтически приемлемом носителе, таком как стерильный солевой физиологический раствор. Могут вводиться буферные добавки. В состав композиции, включающей антитело, могут входить дополнительные добавки, такие как стабилизаторы (в частности, полисорбат 80, в соответствии с Фармакопеей США и Добавлениями к Фармакопее США). Антитело может назначаться в виде единичной дозы, непрерывно или с помощью нескольких вливаний (в частности, с помощью инъекции болюса с последующим продолжительным вливанием), иначе соединение или антитело может назначаться с использованием механизма контролируемого выделения (в частности, с помощью полимера или системы доставки "очажков") или другим подходящим способом. Назначаемое количество зависит от различных факторов, таких как клинические симптомы, вес индивидуума, и от того, проводится ли назначение других лекарств (в частности, тромболитических средств).

При проведении повторной терапии с использованием антитромбоцитарных антител может возникнуть тромбоцитопения, вызванная лекарствами; это явление может быть результатом того, что организм принимает покрытые антителом тромбоциты за чужеродные белки, мобилизует против них антитела, а затем выводит их наружу через ретикулоэндотелиальную систему быстрее, чем обычно. Вследствие чрезвычайно высокой плотности размещения рецепторов GPIIb/IIIa на поверхности тромбоцитов (приблизительно 80000 на один тромбоцит) и большого количества тромбоцитов в циркулирующей крови (приблизительно (0,25-0,5)10⁶ на 1 мкл), тромбоцитопения может оказаться серьезным осложнением при лечении антитромбоцитарными антителами, использование химерных антитромбоцитарных (в частности, анти-GPIIb/IIIa) антител позволяет обойти эту проблему. Химерные антитромбоцитарные антитела по настоящему изобретению могут свести к минимуму тромбоцитопению (снизить или предотвратить), которая в противном случае могла бы наблюдаться при использовании антитромбоцитарных антител. Например, минимальное сокращение содержания тромбоцитов в крови наблюдается при назначении химерного 7E3 Fab (см., в частности, Примеры 6 и 7).

Во-вторых, при назначении людям фрагмент химерного антитела 7E3 Fab показывает удивительно низкую частоту возникновения индуцируемой иммуногенности по сравнению с его муриновым двойником (см., в частности, Примеры 4 и 7). В процессе связывания тромбоцитов большая часть муриновой компоненты антитромбоцитарного химерного антитела связывается с поверхностью, в частности, посредством рецептора GPIIb/IIIa, и, таким образом, становятся недоступны для иммунной системы, что делает химерные антитела функционально неразличимыми от антител человека, направленных против того же самого эпитопа. По этой причине другие химерные антитромбоцитарные антитела по настоящему изобретению могут также быть неиммуногенными несмотря на их связывающую область муринового антигена.

Тромбоцитспецифичные химерные иммуноглобулины по настоящему изобретению полезны также для визуализации тромбов. С этой целью в общем случае более предпочтительно использовать фрагменты антитела. Как указано ранее, химерный ген тяжелой цепочки можно получить в усеченной форме, с целью получения фрагментов химерного иммуноглобулина (в частности, Fab, Fab' или F(ab')₂) для иммуносцинтиграфии. В указанные молекулы можно ввести метку непосредственно или с помощью хелатирующего агента, такого как DTPA, с радиоизотопами, такими как ¹³¹иод, ¹²⁵иод, ^99mтехнеций или ¹¹¹индий и получить агенты для радиоиммуносцинтиграфии. Иначе методами генной инженерии в сайт химерного антитела можно вести домен связывания (хелатирования) радиоактивных металлов, с целью получить сайт для введения метки. Таким образом, химерный иммуноглобулин может быть создан в виде белка, который содержит не принадлежащую человеку тромбоцитспецифичную вариабельную область, константную область человека (предпочтительно усеченную) и домен связывания металла, полученный из связывающего металл белка, такого как металлотионеин.

Тромбоцитспецифичный химерный иммуноглобулин или его фрагмент назначают пациенту, у которого подозревают тромб. По прошествии достаточного количества времени, необходимого для того, чтобы содержащий метку иммуноглобулин локализовался в месте расположения тромба, обнаруживают генерируемый меткой сигнал с помощью фотосканирующего устройства, такого как гамма-камера. Обнаруженный сигнал затем превращают в изображение тромба. Изображение позволяет локализовать тромб in vivo и выработать подходящую стратегию терапии.

Изобретение далее поясняется следующими примерами, которые его ни в коем случае не ограничивают.

Пример 1 Получение химерного тромбоцитспецифичного IgG4 A. Общая стратегия Стратегия клонирования вариабельных областей для генов с легкой и тяжелой цепочкой из гибридомы 7Е3 основана на образовании связи в геноме между