Белковый химерный рецептор, днк, кодирующая белковый химерный рецептор

Белковый химерный рецептор, днк, кодирующая белковый химерный рецептор

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии. Белковый химерный рецептор содержит внутриклеточную и внеклеточную части. Представлена внутриклеточная часть с аминокислотной последовательностью Syk человека или Syk свиньи, приведенной в описании. Внутриклеточная часть способна передавать сигнал рецептору на разрушение связанной с ним клетки-мишени или инфекционного агента мишени. Внеклеточная часть содержит в себе часть CD 4, связывающуюся с оболочкой вируса ВИЧ. Представлена ДНК, кодирующая белковый химерный рецептор. Изобретение позволяет специфически переключать потенциал распознавания мишени клетками иммунной системы и направлять его на антиген, распознаваемый внеклеточной частью антитела. 2 c. п. ф-лы, 10 ил.

Настоящее изобретение относится к функциональным протеин-тирозин-киназным химерам, которые обладают способностью "переключать" функции иммунной системы. В частности настоящее изобретение относится к регуляции лимфоцитов, макрофагов, натуральных клеток-киллеров или гранулоцитов путем экспрессии в указанных клетках химерных молекул, которые активируют эти клетки для ответа на мишени, распознаваемые указанными химерами. Настоящее изобретение также относится к функциональным протеин-тирозин-киназным химерам, которые способны направлять терапевтические клетки на специфическое распознавание и разрушение клеток, инфицированных специфическим инфекционным агентом, самого инфекционного агента, опухолевой клетки или аутоиммунногенной клетки. Более конкретно, настоящее изобретение относится к продуцированию протеин-киназных химер, способных активировать цитотоксические T-лимфоциты на распознавание и лизис клеток, экспрессирующих белки ВИЧ-оболочки. Поэтому настоящее изобретение также относится к лечению заболеваний, таких как СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), вызываемых вирусом ВИЧ.

Предшествующий уровень техники В основе ряда иммунологических явлений лежит распознавание антигена Т-клетками посредством T-клеточного рецептора. T-клетки регулируют так называемый клеточный иммунитет. Функции клеточного иммунитета заключаются в разрушении клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существует несколько видов T-клеток, а именно, клетки-"хелперы" и клетки-"супрессоры", которые модулируют иммунный ответ, и цитотоксические клетки (или клетки-"киллеры"), которые способны непосредственно разрушать аномальные клетки.

T-клетка, которая распознает уникальный антиген, находящийся на поверхности других клеток, и связывается с ним, становится активированной, после чего она может размножаться, и если эта T-клетка является цитотоксической клеткой, то она может разрушить связанную клетку.

Аутоиммунные заболевания характеризуются продуцированием антител, которые реагируют с хозяйской тканью, либо иммунных эффективных T-клеток, которые являются аутореактивными. В некоторых случаях аутоантитела могут продуцироваться благодаря нормальному иммунному ответу, опосредованному T- и B-клетками, активированными чужеродными факторами или микроорганизмами, которые содержат антигены, перекрестно реагирующие с аналогичными соединениями в тканях организма. Примерами клинически релевантных аутоантител могут служить антитела против ацетилхолиновых рецепторов при миастении (myasthenia gravis) и антитела против ДНК, эритроцитов и тромбоцитов при системной красной волчанке.

ВИЧ и иммунопатогенез В 1984 году было обнаружено, что этиологическим фактором, вызывающим СПИД, является ВИЧ. С тех пор определение СПИДа несколько раз пересматривалось в целях установления критериев, которые должны быть учтены при диагностике СПИДа. Однако несмотря на отклонения в диагностических параметрах, "наименьшим общим знаменателем" при диагностике СПИДа является ВИЧ-инфицирование с последующим развитием устойчивых симптомов, свидетельствующих о генерализации патологического процесса и возникновении заболеваний, характерных для СПИДа, таких как вторичные инфекции, опухоли и неврологические расстройства (Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed., MoGraw Hill (1991)).

ВИЧ представляет собой ретровирус человека группы лентивирусов. Известны четыре ретровируса человека, принадлежащие к двум различным группам, а именно T-лимфотропные ретровирусы человека (возбудители лейкоза) типа 1 (HTLV-1) и типа 2 (HTLV-2), и вирусы иммунодефицита человека ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Первые два вируса являются трансформирующими вирусами, тогда как два последних являются цитопатическими вирусами.

ВИЧ-1 был идентифицирован как наиболее распространенный возбудитель СПИДа, поражающий людей во всем мире. Гомология последовательностей ВИЧ-1 и ВИЧ-2 составляет примерно 40%, причем ВИЧ-2 является более близко родственным некоторым членам группы вирусов иммунодефицита обезьян (SIV). См. Curran J. et al. , Science, 329: 1357-1359 (1985); Weiss E. et al., Nature, 324: 572-575 (1986).

Помимо обычных ретровирусных генов (env, gag и pol) ВИЧ имеет еще шесть дополнительных генов, ответственных за репликацию и другие биологические функции вирусов. Как было установлено ранее, общим критерием СПИДа является глубокая иммуносупрессия, главным образом, супрессия клеточно-опосредованного иммунитета. Указанная иммуносупрессия приводит к заболеваниям, вызываемым условно-патогенными агентами, в частности к возникновению некоторых инфекций и опухолей.

Было установлено, что главной причиной иммунологических нарушений при СПИДе является количественная и качественная недостаточность в субпопуляции лимфоцитов, образующихся в тимусе (T-лимфоцитов), а именно популяции T4. Эта субпопуляция клеток может быть определена фенотипически благодаря присутствию на их поверхности молекулы CD4, которая, как уже было продемонстрировано, является рецептором для ВИЧ (Dalgleish et al., Nature, 312: 763 (1984)). Хотя клетки T4 являются главным типом клеток, инфицированных вирусом ВИЧ, однако, в принципе, любая клетка человека, экспрессирующая молекулу CD4 на своей поверхности, может связываться с ВИЧ и быть инфицированной этим вирусом.

Обычно CD4⁺-T-клеткам приписывают роль хелпера/индуктора благодаря их функции, заключающейся в передаче активационного сигнала B-клеткам, или индуцирования T-лимфоцитов, несущих реципрокный маркер CD8 с образованием цитотоксичных/супрессорных клеток (Reinherz & Schlossman, Cell, 19: 821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982)).

Посредством определенного аминокислотного участка вирусной оболочки (gp120) ВИЧ специфически и с высокой степенью аффинности связывается с частью V1-области молекулы CD4, расположенной близ N-конца этой молекулы. После связывания вирус сливается с мембраной клетки-мишени и интернализуется. После интернализации вирус использует обратную транскриптазу для транскрипции своей геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в клеточную ДНК и присутствует в ней в течение всей жизни клетки в качестве "провируса".

Этот провирус может оставаться латентным либо он может быть активирован, и тогда происходит транскрипция интегрированной вирусной ДНК с образованием мРНК и геномной РНК, что приводит к синтезу белков и сборке новых вирусных частиц, которые отпочковываются от клеточной поверхности. Хотя точный механизм, посредством которого вирус вызывает гибель клетки, пока не установлен, однако имеется предположение, что в основе этого механизма лежит активная репликация и отпочкование вируса от клеточной поверхности, что приводит к разрыву плазматической мембраны клетки и нарушению осмотического равновесия.

В процессе инфицирования в организме хозяина вырабатываются антитела вирусных белков, включая главные капсидные гликопротеины gp120 и gp41. Однако несмотря на включение этого гуморального иммунитета, заболевание, вызываемое вирусом прогрессирует, и приводит к летальной иммуносупрессии, характеризующейся множеством условно-патогенных инфекций, паразитемией, деменцией и смертью. Недостаточное для прекращения развития болезни продуцирование противовирусных антител является одним из самых тревожных и внушающих беспокойство аспектов процесса инфицирования, а поэтому проведение вакцинации на основе стандартных методик не предвещает положительных результатов.

В повышении эффективности гуморального ответа на вирусы иммунодефицита могут сыграть роль два фактора. Во-первых, аналогично другим РНК-вирусам (в частности, другим ретровирусам), вирусы иммунодефицита обнаруживают высокую частоту мутаций в ответ на иммунологический контроль хозяина. И, во-вторых, гликопротеины оболочки, сами по себе, являются в высокой степени гликозилированными молекулами, представляющими новые эпитопы, подходящие для высокоаффинного связывания с антителом. "Слабая" антигенная мишень, которой является вирусная оболочка, дает возможность хозяину немного ограничивать вирусную инфекцию путем продуцирования специфических антител.

Клетки, инфицированные вирусом ВИЧ, экспрессируют на своей поверхности гликопротеин gp120. Этот гликопротеин опосредует явления слияния, происходящие между CD4⁺-клетками посредством реакции, аналогичной процессу внедрения вируса в неинфицированные клетки, что приводит к образованию короткоживущих многоядерных гигантских клеток. Образование синцития зависит от прямого взаимодействия капсидного гликопротеина gp120 с белком CD4 (Dalgleish и др. , см. выше; Klatzman D. и др., Nature, 312: 763 (1984); Mc Dougal J.S. и др. , Science: 231: 382 (1986); Sodroski, J. и др., Nature, 322: 470 (1986); Lifson J.D. и др., Nature, 323: 725 (1986); Sodrosky J. и др., Nature, 321: 412 (1986)).

Свидетельством того, что CD4-gp120-связывание ответственно за вирусную инфекцию клеток, несущих CD4-антиген, было установление того факта, что между gp120 и CD4 образуется комплекс (Mc Dougal и др., см. выше). Другими исследователями было показано, что клеточные линии, которые не являлись инфективными для ВИЧ, превращались в инфицируемые клеточные линии после трансфекции и экспрессии кДНК-гена CD4 человека. Maddon и др., Cell, 46: 333-348 (1986).

Несколькими группами исследователей были предложены и успешно продемонстрированы in vitro терапевтические программы, основанные на использовании растворимого CD4 в качестве пассивного агента для восприпятствования вирусной адсорбции и синцитий-опосредованной клеточной трансмиссии (Denn et al., Nature, 3321: 82-84 (1988); Fisher et al., Nature, 331: 76-78 (1978); Hussey et al. , Nature, 331: 78-81 (1988); Smith et al., Science, 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1988)); а затем были получены гибридные белки иммуноглобулинов CD4, имеющие более продолжительный период полужизни и невысокую биологическую активность (Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339, 68-70 (1989); Byrn et al., Nature, 344: 667-670 (1990); Zeltlmeissl et al., DNA Cell Biol 9: 347-353 (1990)). Хотя CD4-иммунотоксиновые конъюгаты или белки слияния обнаруживают сильную цитотоксичность против инфицированных клеток in vitro (Chadhary et al. , Nature, 335: 369-372 (1988); Till et al., Science, 242: 1166-1168 (1988)), однако латентность синдрома иммунодефицита вряд ли позволит добиться эффективного снятия вирусной нагрузки с помощью лишь одного курса терапии, а антигенность чужеродных белков слияния будет, вероятно, ограничивать их переносимость при лечении, требующем введения многократных доз. Испытания, проведенные на обезьянах, зараженных SIV, показали, что растворимый CD4, при его введении животным, не обнаруживающим заметной CD4-цитопении, может снижать титр вируса SIV и улучшить in vitro-измерение миелоидного потенциала (Watanabe et al., Nature, 337: 267-270 (1989)). Однако после прекращения обработки наблюдалось быстрое восстановление вирусного титра, что дает основание предположить, что для предупреждения прогрессирующего ослабления иммунной системы может оказаться необходимым длительное введение.

Протеин-тирозин-киназы, ассоциированные с рецепторами клеточной поверхности Первоначальным стимулом для внедрения клеточных эффекторных программ в иммунную систему часто является распознавание клетками лигандных кластеров. Из известных рецепторов, способных к передаче активационных сигналов после агрегации, являются B-клеточные и T-клеточные рецепторы для антигена (De Franco, 1992, Eur. J. Biochem., 210: 381-388; Weiss, 1991, Annu, Rev. Genet. 25: 487-510), члены семейств иммуноглобулиновых (IgG и IgE) Fc-рецепторов (Fanger et al., 1989, Immunol. Tooay 10: 92-99; Ravetch & 1991, Annu. Rev. Immunol. , 9: 457-492), и ряд дополнительных рецепторов, включая CD2, CD4, CD8 и CD28, находящихся на поверхности T-клеток (Yokoyama & Shevach, 1989. Year. Immunol. , 4: 110-146), CD19, CD20, CD21 и CD40 на B-клетках (Clark & Ledbetter, 1989, Adv. Cancer. Res., 52: 81-149), и CD44, CD45 и CD58, присутствующие на моноцитах (Webb et al., 1990, Science 249: 1295-1297). Кроме того, большое число белков, связанных с фосфолипидом, стимулируют клеточную активацию зависимым от антигенного рецептора образом при их перекрестном связывании на поверхности T-клеток (Balk & Terhorst, 1989, Immunol. Ser. 45: 411-416; Kroczek et al. , 1986, Nature 322: 181-184; Yel et al., 1987, J. Immunol., 138: 91-97; Yokoyama & Shevach 1989, Year Immunol., 4: 110-146).

До сих пор остается неясным, каким образом простое физическое явление, такое как агрегация, приводит к явно детектируемому физиологическому сигналу. Введение клеточных эффекторных программ, опосредованных T-клеточными и B-клеточными рецепторами для антигена и различными формами Fc-рецептора, может быть имитировано путем перекрестного связывания химерных белков, несущих внутриклеточные домены отдельных цепей рецепторных комплексов (Irving & Weiss, 1991, Cell 64: 891-901; Kolanus et al., 1992, EMBO, J. 11: 4861-4868; Letourneur & Klausner, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88; 8905-8909; Letourneur & Klausner, 1992, Science 255: 79-82; Romeo & Seed, 1991, Cell 64: 1037-1046; Wagener et al., 1992, Cell 68: 83-95). Очевидно, что минимальный элемент, необходимый для эффективного "запуска", требует присутствия филогенетически консервативной (Reth, 1989, Nature 338: 383-384) пептидной последовательности, содержащей два тирозиновых остатка, разделенных 10 или 11 остатками и включенных в гидрофильное, обычно кислотное окружение ("контекст") (Romeo et al., 1992, Cell 68: 889-897; Irving et al., 1993, J. Exp. Meo. 177, 1093-1103). Образование рецепторных кластеров, несущих указанный элемент, способствует активации каскада событий, для которого, вероятно, главным является активность протеин-тирозин-киназы (PTK); причем ингибиторы PTK блокируют ранние события при B- и T-клеточной активации, такие как мобилизация кальция, с последующим высвобождением цитокинов и пролиферацией клеток (June et al., 1990, J. Immunol., 144: 1591-1599; Lane et al., 1991, J. Immunol. , 146: 715-722; Mustelin et al., 1990, Science, 247: 1584-1587; Stanley et al., 1990, J. Immunol., 145: 2189-2198). Хотя более отдаленные последствия рецепторной активации различаются в зависимости от типа клеток, однако ранние события для клеток от разных гематопоэтических линий дифференцировки поразительно схожи между собой. Например быстрое возрастание PTK-активности наблюдалось после перекрестного связывания B-клеточного рецептора для антигена (Gold et al., 1990, Nature 345: 810-813; Campbell & Sefton, 1990, EMBO J. 9: 2125-2131), T-клеточного рецептора для антигена (June, C.H., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7722-7726; June, C. H. et al. , 1990, J. Immunol. 144: 1591-1599), и высокоаффинный IgE-рецептор (Eiseman & Bolen, 1992, Nature 355: 78-80; Li et al., 1992, Mol. Cell, Biol. 12: 3176-3182), причем все они в качестве своих ранних мишеней фосфорилирования имеют -изоформу фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C (Carter et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2745-2749; Li et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 3176-3182; Park et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 24237-24240; Park et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 5453-5456; Secrist et al., 1991, J. Biol. Chem., 266: 12135-12139; Wiess et al. , 1991, Annu. Rev. Genet. 25: 487-510), которая непосредственно активируется путем тирозин-фосфорилирования (Nishibe et al., 1990, Science 250: 1253-1256).

Все известные в настоящее время активные PTK, ассоциируемые с рецепторами клеточной поверхности, делятся на два класса: ферменты, принадлежащие к семейству киназ, являющихся продуктами протоонкогенов Src, и ферменты, принадлежащие к недавно охарактеризованным киназам Syk. К первому классу относятся: Fyn-киназа, которая, как было показано, ассоциируется с T-клеточным рецептором (Gassman et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 283-286; Samelson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 4358-4362); киназы Lyn, Fyn, Blk и Sck, которые, как было показано, ассоциируются с B-клеточным IgM-рецептором (Burkhardt et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7410-7414; Campbell & Sefton, 1992, Mol, Cell, Biol. 12: 2315-2321; Yamanashi et al. , 1991, Science 251: 192-194); и киназы Lyn и Yes, которые, как было показано, ассоциируются с высокоаффинным IgE-рецептором (Eiseman & Bolen, 1992, Nature 355: 78-80; Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111; Hutchcroft, J. E. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8613-8619). Механизм наблюдаемой ассоциации пока точно не установлен, однако существует предположение, что внутриклеточные домены цепей рецепторного комплекса могут физически ассоциироваться с семейством Src-киназ (Clark et al., 1992, Science 258: 123-126; Timson Gauen et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5438-5446). Причем до сих пор неясно, являются ли эти ассоциации прямыми или непрямыми.

В настоящее время одно из самых убедительных свидетельств важной роли, которую играют киназы семейства Scr в активации клеток, было получено в результате исследований Fyn-Lck-киназ в T-клетках. Сверхсинтез Fyn в трансгенных мышах приводит к получению антигенгиперреактивного фенотипа T-клеток, тогда как сверхсинтез каталитически неактивной формы блокирует пролиферацию, опосредованную T-клеточным рецептором (Cooke et al., 1991, Cell 65: 281-291). Тимусные T-клетки, выделенные от мутантных мышей, у которых отсутствует Fyn-киназная активность, обнаруживали глубокий дефицит в способности к увеличению пролиферации в ответ на обработку форболовым сложным эфиром в комбинации либо с антителом против CD3, либо с конкавалином A (Appleby et al., 1992, Cell 70: 751-763; Stein et al., 1992, Cell 70: 741-750). T-клетки селезенки, выделенные от этих мышей, обнаруживали менее сильное, но также значительное ослабление ответной клеточной активации (Appleby et al., 1992, Cell 70: 751-763; Stein et al., 1992, Cell 70: 741-750).

В T-клетках, киназа Lck непрямо ассоциируется с T-клеточным рецептором (TCR) посредством корецепторов CD4 и CD8 (Rudd et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5190-5194; Shaw et al., 1989, Cell 59: 627-636; Turner et al. , 1990, Cell 60: 755-765; Veillette et al., 1988, Cell 55: 301-308). Сверхэкспрессия Lck в антиген-реактивной клеточной линии потенцирует восприимчивость рецептора таким же образом, что и в случае Fyn (Abraham & Veilette, 1990, Mol, Cell, Biol, 10: 5197-5206; Davidson et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 1483-1492; Luo & Sefton, 1992, Mol, Cell, Biol. 12: 4724-4732). В модели CD4-зависимой мышиной T-клеточной гибридомы восстановление антиген-специфической хелперной функции может быть достигнуто только с помощью молекул CD4, способных взаимодействовать с Lck (Glaichenhaus et al., 1991, Cell 64: 511-520).

Однако самое убедительное доказательство прямого участия киназы Lck в передаче сигнала, опосредованной рецептором для антигена, было получено в результате исследований мутантных клеточных линий, в которых отсутствует Lck. Были исследованы две такие линии; одна из них происходила от T-клеточной линии лейкоза человека Turkat (Goldsmith & Weiss, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6879-6883; Straus & Weiss 1992, Cell 70: 585-593), а другая происходила от клона мышиных цитотоксических T-клеток CTLL-2 (Karnitz et al., 1992, Mol, Cell, Biol, 12: 4521-4530). Обе эти Lck-негативные мутантные линии были дефектными в отношении TCR-опосредованной передачи сигнала, и комплементация любой мутантной линии путем трансфекции с помощью Lck-экспрессирующей плазмиды приводит к восстановлению чувствительности к раздражителям перекрестного связывания TCR (Karnitz et al., 1992. Mol. Cell. Biol. 12: 4521-4530; Straus & Weiss 1992, Cell 70: 585-593).

Недавно было показано, что члены нового семейства тирозин-киназ, первоначально представленные как киназы, близкородственные или идентичные киназам Syk (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15790-15796) и PTK 72 (Zioncheck et al., 1986, J. Buiol. Chem. 261: 15637-15643; Zioncheck et al., 1988, J. Bioll. Chem. 263: 19195-19202), ассоциируются с рецепторами клеточной поверхности. Хотя точного доказательства, что PTK 72 и Syk являются идентичными, представлено не было, однако имеются вполне определенные данные о том, что эти киназы имеют одинаковые распределения в тканях (тимусе и селезенке), молекулярные массы и лабильность в отношении протеолиза. Было показано, что PTK 72 ассоциируется с B-клеточным IgM-рецептором (Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111; Hutchcroft, J.E. et al. , 1992, J. Biol. Chem. , 267: 8613-8619), и фосфорилируется после перекрестного связывания рецептора с анти-IgM (Hutchcroft et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 14846-14849). Было продемонстрировано, что после перекрестного связывания поверхностного IgM имеет место сопутствующая активация фермента, измеренная по аутофосфорилированию и фосфорилированию экзогенного фрагмента белка (Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111; Hutchcroft, J. E. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8613-8619). Было также обнаружено, что PTK 72 ассоциируется с высокоаффинным рецептором IgE в базофильной клеточной линии лейкоза крыс (Hutchcroft et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9107-9111; Hutchcroft, J.E., et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8613-8619).

Второй член семейства Syk, а именно ZAP-70, представляет собой, как было показано, протеин-тирозин-киназу (PTK), ассоциирующуюся с дзета-цепью T-клеточного рецептора после перекрестного связывания рецептора (Chan et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9166-9170). Хотя экспрессия ZAP-70, Fyn или Lck в клетках COS приводит к небольшому увеличению полного клеточного тирозинфосфата, однако коэкспрессия ZAP-70 с Lck либо с Fyn приводит к резкому увеличению уровня фосфорилирования по остаткам тирозина (Chan et al., 1992, Cell 71: 649-662). Причем, если также присутствует химера "CD8-дзета-цепь", то в этом случае химера становится фосфорилированной, а киназа ZAP-70 является ассоциированной с ней (Сhan et al., 1992, Cell 71: 649-662). До сих пор остается неясным, активирует ли киназа ZAP-70 семейства киназ Src и/или наоборот; и кроме того, остается неясным, почему коэкспрессия киназ в клетках COS приводит к заметной конститутивной активации. Тем не менее активное ассоциирование ZAP-70 с перекрестно связанным T-клеточным рецептором (TCR) дает основание предположить, что эта протеин-тирозин-киназа (PTK) играет определенную роль в передаче рецепторного ответа.

В отличие от киназ семейства Src киназы Syk и ZAP-70 содержат два домена SH2 и не имеют сайта N-концевого миристилирования (Taniguchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15790-15796; Chan et al., 1992, Cell 71: 649-662). Естественно предположить, что механизм ассоциации киназы-рецептора предусматривает связывание двух доменов SH2 с двумя тирозинами мотивов запуска антигенного рецептора после их фосфорилирования. Однако это предположение пока еще остается только гипотезой.

Краткое описание изобретение Настоящее изобретение иллюстрирует возможность создания химер между внутриклеточным доменом протеин-тирозин-киназной молекулы и внеклеточным доменом, способным к распознаванию мишени. В частности образование химерных кластеров, несущих Syk- или ZAP-70-киназные последовательности, стимулирует мобилизацию кальция. Агрегацию лишь Syk-химеры или коагрегация химер, несущих Fyn- или Lck- и ZAP-70-киназы, являются достаточными для инициации цитолитической эффекторной функции. Такая эффекторная функция облегчает специфическое распознавание и деструкцию нежелательных клеток-мишеней, например патогенов, инфицированных патогенами клеток, опухолевых клеток или аутоиммунных клеток.

В соответствии с настоящим изобретением, может быть сконструирован любой член используемых химерных молекул. Например, образование химер, состоящих из внутриклеточной части соответствующим образом сконструированной молекулы антитела, позволяет специфически переключать потенциал распознавания мишени клетками иммунной системы и направлять его на антиген, распознаваемый внеклеточной частью антитела. Таким образом, благодаря присутствию в химерах антитела, способного распознавать определенную антигенную детерминанту на поверхности патогена, клетки иммунной системы, вооруженные химерами, могут реагировать на присутствие патогена в соответствии с эффекторной программой, присущей их линии дифференцировки, например хелперные T-лимфоциты могут направить свою цитотоксическую активность против мишени, а B-лимфоциты могут быть активированы для синтеза антител. Макрофаги и гранулоциты могут осуществлять свои эффекторные программы, включая высвобождение цитокинов, фагоцитоз и генерирование реактивного кислорода. Аналогичным образом, в случае присутствия антительной части, способной распознавать опухолевые клетки, иммунная система будет направлена преимущественно на опухолевые клетки. В случае присутствия антитела, способного распознавать иммунные клетки, обладающие нежелательной реактивностью по отношению к своим собственным детерминантам, эти аутореактивнные клетки будут мишенью для селективного лизиса.

В вышеуказанных примерах описание антителосодержащих химер является лишь данью традиции, и объем настоящего изобретения не ограничивается использованием только антителосодержащих химер, т.е. настоящее изобретение может быть с успехом осуществлено с применением внеклеточных доменов, не происходящих от антитела. Например, если внеклеточная часть является рецептором для вирусов, бактерий или паразитов, то клетки, "вооруженные" такими химерами, будут специфически направлены против клеток, экспрессирующих вирусные, бактериальные или паразитические детерминанты. Преимущество этого метода по сравнению с использованием антител заключается в том, что нативный рецептор для патогена может обладать чрезвычайно высокой селективностью или аффинностью по отношению к патогену, в результате чего повышается степень специфичности иммунного ответа. Аналогичным образом для удаления тех клеток иммунной системы, которые обладают нежелательной реактивностью по отношению к собственному антигену, может оказаться достаточным присоединять антиген (либо в качестве интактного белка в случае терапии для элиминации B-клеток, либо в качестве главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) в случае терапии для элиминации T-клеток) к внутриклеточным цепям протеин-тирозин-киназы, в результате чего иммунный ответ будет специфически направлен против клеток, обладающих нежелательной реактивностью по отношению к своим собственным детерминантам.

Еще одной целью использования химер является контроль клеточных популяций, образующихся in vivo после проведения других видов генной инженерии. Например предлагалось использовать опухоль-инфильтрующие лимфоциты или натуральные клетки-киллеры (NK-клетки), которые осуществляли бы свои цитотоксические функции в месте локализации опухоли. Настоящее изобретение дает удобный способ регуляции числа и активности таких лимфоцитов и клеток, не удаляя их из организма пациента для in vitro-амплификации. Таким образом, поскольку внутриклеточные домены химерных рецепторов опосредуют пролиферативные ответы клеток, то координация внеклеточных доменов с помощью ряда агрегирующих факторов, специфических для внеклеточных доменов (например, антитело, являющееся специфическим для внеклеточного домена), будет приводить к пролиферации клеток, несущих данные химеры.

Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают использование химер, содержащих протеин-тирозин-киназы семейства Syk или семейств Syk и Src, однако для целей, раскрываемых в настоящей заявке, может быть использована любая тирозин-киназа, имеющая функции, аналогичные функциям указанных молекул. Отличительными признаками предпочтительных молекул-"стимуляторов" иммунных клеток являются их способность к автономной экспрессии; их способность присоединяться к внеклеточному домену (прямо или посредством трансмембранного домена) так, чтобы полученная в результате химера присутствовала на поверхности терапевтической клетки; и способность инициировать клеточные эффекторные программы после вторичной агрегации со сталкиванием с целевым лигандом.

В настоящее время наиболее распространенным методом доставки химер к клеткам иммунной системы является определенный вид генной терапии. Однако восстановление клеток иммунной системы с использованием химерных рецепторов путем смешивания клеток с соответствующим образом солюбилизированных очищенных химерных белков может также приводить к образованию сконструированной клеточной популяции, способной реагировать на мишени, распознаваемые внеклеточным доменом химер. Аналогичные методы были использованы, например, для введения интактного рецептора ВИЧ, а именно CD4, в эритроциты в терапевтических целях. В этом случае сконструированная клеточная популяция не способна к самовосстановлению.

Настоящее изобретение относится к функциональным упрощенным протеин-тирозин-киназным химерам, которые обладают способностью к переключению функции иммунной системы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к регуляции лимфоцитов, макрофагов, натуральных клеток-киллеров или гранулоцитов путем экспрессии в указанных клетках химер, которые стимулируют клетки на ответ, направленный против мишеней, распознаваемых этими химерами. Настоящее изобретение также относится к способу, позволяющему направлять клеточный ответ против инфекционного агента, опухолевых, или раковых клеток, или аутореактивных клеток. Способ, позволяющий направлять клеточный ответ у млекопитающих и предусматривающий введение указанному млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, способных к распознаванию и разрушению инфекционного агента, опухолевой, раковой или аутореактивной клетки.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу, позволяющему направлять клеточный ответ против инфекционного агента и предусматривающему введение терапевтических клеток, способных к распознаванию и разрушению указанного агента, где указанным агентом является специфический вирус, бактерии, протозойные или грибки. А более конкретно, указанный способ направлен против таких агентов как ВИЧ и Pneeuocystis carinii.

Для лечения ВИЧ-инфекции пациенту вводят эффективное количество цитотоксических T-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор и обладающих способностью к специфическому распознаванию и лизису клеток, инфицированных вирусом ВИЧ, а также циркулирующим вирусом.

Таким образом, в одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к способу, позволяющему направлять клеточный ответ против ВИЧ-инфицированных клеток и предусматривающему введение пациенту эффективного количества цитотоксических T-лимфоцитов, способных к специфическому распознаванию и лизису клеток, инфицированных ВИЧ.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к химерным рецепторным белкам, направляющим цитотоксические T-лимфоциты на распознавание и лизис ВИЧ-инфицированных клеток. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к хозяйским клеткам, трансформированным вектором, содержащим химерные рецепторы.

Эти и другие варианты настоящего изобретения, не ограничивающие его объема, будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения.

В этом подробном описании приводятся ссылки на различные методики, известные специалистам по молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, содержащие описания этих известных методик, вводятся во всей своей полноте в настоящее описание посредством ссылки.

Известными работами, в которых описаны общие принципы технологии рекомбинантных ДНК, являются: Watson, J. D. et al., Molecular Biology of Gene, Volumes I and II, the Benjamin/Cumming Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J.E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & sons, publishers, New York, N.Y. (1985); Old, R.W., et al. , Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T. , et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harborg Laboratory, publisher Cold Spring Harbor, NY (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY, (1989).

Определения Термин "клонирование" означает использование техники рекомбинации in vitro для введения конкретного гена или другой ДНК-последовательности в векторную молекулу. Для успешного клонирования нужного гена необходимо использовать методы, предусматривающие генерирование ДНК-фрагментов для встраивания этих фрагментов в векторные V молекулы; введение сконструированной ДНК-молекулы в хозяйскую клетку, в которой эта молекула может реплицироваться; и отбор клона, содержащего целевой ген из хозяйских клеток-реципиентов.

Термин "кДНК" означает комплементарную или копийную ДНК, продуцированную из РНК-матрицы с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Таким образом, "ДНК-клон" означает двухцепочечную ДНК-последовательность, комплементарную нужной РНК-молекуле и содержащуюся в векторе клонирования.

Термин "кДНК-библиотека" означает коллекцию рекомбинантных ДНК-молекул, содержащих кДНК-вставки, соответствующие ДНК-копиям мРНК, экспрессируемой клеткой во время изготовления кДНК-библиотеки. Такая кДНК-библиотека может быть получена известными методами, описанными, например, в руководстве Маниатиса и др. (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, см. выше). Для этого сначала из клеток организма, из генома которого необходимо клонировать нужный конкретный ген, выделяют РНК. Для целей настоящего изобретения предпочтительно использовать клеточные линии лимфоцитов млекопитающих, а лучше человека. В соответствии с настоящим изобретением наиболее предпочтительным вектором является штамм WR вакцинного вируса (вируса коровьей оспы).

Термин "вектор" означает ДНК-молекулу, происходящую, например, от плазмиды, бактериофага или вируса млекопитающего или насекомого, в которую могут быть встроены или клонированы ДНК-фрагменты. Вектор может содержать один или несколько уникальных рестрикционных сайтов и может обладать способностью к автономной репликации в определенном хозяине или организме-переносчике так, чтобы клонированная последовательность могла репродуцироваться. Таким образом, "экспрессирующий ДНК-вектор" представляет собой любой автономный элемент, способный регулировать синтез рекомбинантного пептида. Такими экспрессирующими ДНК-векторами являются бактериальные плазмиды и фаги, а также плазмиды и вирусы млекопитающих и насекомых.

Термин "в основном чистый" означает соединение, например белок, полипептид, или антитело, которое, в основном, не содержит свойственных ему природных примесей. Обычно соединение считается в основном чистым, если содержание нужного соединения в данном материале составляет, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 75%, а наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% от всего материала. Чистота данного материала может быть измерена стандартными методами, например с помощью колоночной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле или ВЭЖХ-анализа. В отношении нуклеиновой кислоты понятие "в основном чистый" означает последовательность, сегмент или фрагмент нуклеиновой кислоты, непосредственно соединенные (т.е., ковалентно связанные) с обеими кодирующими последовательностями (т.е. с одной у 5'-конца и одной у 3'-конца), с которыми они непосредственно соединены в природном геноме организма, от которого происходит ДНК настоящего изобретения.

Термин "функциональное производное" означает "фрагменты", "варианты", "аналоги" или "химические производные" молекулы. Под понятием "фрагмент" молекулы, например, любой из ДНК-последовательностей настоящего изобретения, подразумевается любая нуклеотидная субпопуляция молекулы. Под понятием "вариант" такой молекулы подразумевается природная молекула, которая является, в основном, аналогичной полной молекуле или его фрагменту. Под понятием "аналог" молекулы подразумевается не встречающаяся в природе молекула, которая, в основном, аналогична полной молекуле или его фрагменту. Молекула считается "в основном аналогичной" другой молекуле, если аминокислотные последовательности обеих молекул являются, в основном, одинаковыми. В основном аналогичные аминокислотные молекулы обладают, в основном, одинаковыми биологическими активностями. Таким образом, при условии, что две молекулы обладают аналогичной активностью, они могут рассматриваться как "варианты", даже если одна из молекул содержит дополнительные или отсутствующие в другой молекуле аминокислоты либо если аминокислотные последовательности этих молекул не являются идентичными. В соответствии с настоящим описанием молекула называется "химическим производным" другой молекулы в том случае, если она содержит дополнительные химические группы, которые обычно не являются частью этой молекулы. Эти группы могут улучшать растворимость молекулы, ее абсорбцию, период биологической полужизни и т.п. Альтернативно, эти группы могут снижать токсичность молекулы, устранять или ослаблять нежелательное побочное действие молекулы, и т.п. Группы, способные опосредовать такие эффекты, раскрываются например, в Remington Pharmaceutical Sciences, 16th et., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Аналогичным образом, понятие "функциональное производное" гена химерного рецептора настоящего изобретения включает в себя "фрагменты", "варианты" или "аналоги" гена, которые могут быть "в основном аналогичными" по своей нуклеотидной последовательности и которые кодируют молекулу, обладающую активностью, аналогичной активн