Рекомбинантный белок-фактор ингибирования липогенеза, днк, его кодирующая, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм клеток млекопитающих соs 1-продуцент фактора ингибирования липогенеза, способ его получения и композиция, обладающая активностью ингибирования липогенеза

Рекомбинантный белок-фактор ингибирования липогенеза, днк, его кодирующая, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм клеток млекопитающих соs 1-продуцент фактора ингибирования липогенеза, способ его получения и композиция, обладающая активностью ингибирования липогенеза

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Получен рекомбинантный белок - фактор ингибирования липогенеза с молекулярным весом 23 кДа, установлена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, кодирующая полученный белок. Белок получен культивированием клеток млекопитающих COS 1, трансформированных вектором экспрессии pSR-20-2, содержащим установленный фрагмент ДНК. Рекомбинантный белок используется в композиции, обладающей активностью ингибирования липогенеза. Изобретение обеспечивают возможность проведения терапии и диагноза различных цитопений. 6 с. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 9 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение касается ранее неизвестного отдельного белка, который способен подавлять дифференцировку клеток на адипоциты, способен подавлять липопротеидную липазу и который (одновременно или по отдельности) способен индуцировать колониестимулирующий фактор. Настоящее изобретение касается также ДНК, которая кодирует упомянутый белок, вектора экспрессии рекомбинантной ДНК, включающего в себя упомянутую ДНК, хозяина, который трансформируется согласно упомянутому вектору экспрессии рекомбинантной ДНК, и белкового состава, включающего в себя эффективное количество упомянутого белка.

Известный уровень техники Хорошо известно, что существование стромальных клеток костного мозга, которые поддерживают протекание гомопоэза, в дополнение к гемопоэтическим ствольным клеткам и гемопоэтическим различным факторам, или, иначе говоря, гемопоэтическую микросреду, является необходимым для протекания гемопоэза у живого организма. У людей в момент их рождения гемопоэз активно совершается в костном мозге по всему телу. Однако, когда гомопоэз перестает быть необходимым с вырастанием его или ее, костный мозг постепенно оказывается захваченным адипоцитами, распространяющимися от краев конечностей вследствие разрастания мозгового пространства. Костный мозг, в котором протекает гомопоэз, называют красным костным мозгом, а костный мозг, где произошла замена на адипоциты, называют желтым костным мозгом. При ускорении протекания гомопоэза из-за кровотечения или гемолиза гемопоэз возобновляется в желтом костном мозге (Kashiwamura, М. (1988), "IGAKUNO AYOMI (History of Medicine)", 146, 264-268).

Клетки, которые обладают гемопоэтической функцией в гемопоэтической микросреде, в основном представляют собой преадипоциты. Известно, что при дифференцировке этих клеток на адипоциты они теряют эту функцию (Kodama, H. (1986), "SOSHIKI BAIYO (Tissue Culture)", 12, 191-195).

Например, преадипоцитная клетка линии PA6 типа мышиного костного мозга способна поддерживать пролиферацию гемопоэтических ствольных клеток. Однако при дифференцировке этих клеток на адипоциты эта активность уменьшается (Kodama, H. et al. (1984), J. Cell. Physiol. 118, 233-240). Известно, что бластные клеточные мегакариоцитные и макрофаговые колонии могут индуцироваться при совместном культивировании клеток PA6 и клеток мышиного костного мозга (Kodama, H. (1987), "YIKKEN IGAKU" (Experimental medicine)", 5, 826-830). Таким образом, белок, способный подавлять липогенез, воздействует на преадипоциты и адипоциты костного мозга, промотируя их гемопоэтическую способность, или, иначе говоря, он промотирует их способность индуцировать лейкоциты, макрофаги и тромбоциты (возникающие в мегакариоцитах).

Кроме того, сообщают, что величина колониестимулирующего фактора, продуцируемого в преадипоцитной клеточной линии H-I/A, происходящей из мышиного костного мозга, понижается при дифференцировке этих клеток на адипоциты (Nakamura M. et al. (1985), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179, 283-287).

Как будет показано ниже, ингибирующий липогенез фактор, отвечающий настоящему изобретению, воздействует на клетки линии H-I/A, ускоряя продуцирование макрофагового колониестимулирующего фактора. Помимо стимулирующего воздействия в отношении моноцитов и макрофагов макрофаговый колониестимулирующий фактор оказывается также способным выступать в роли мегакариоцитного потенцирующего фактора (Teramura, M. et al. (1990), Int. J. Cell Cloning, 8, 245-252). Известно также, что макрофаговый колониестимулирующий фактор проявляет способность воздействовать на моноциты, ускоряя продуцирование ими мегакариоцитного потенцирующего фактора. Более того, из данных, полученных при проведении клинической терапии, следует, что макрофаговый колониестимулирующий фактор способствует выздоровлению от нейтропении и тромбоцитопении, сопутствующих проведению карциномной химиотерапии (Motoyoshi, K. (1986), " GAN TO KAGAKURYOHO (Cancer and chemotherapy)", 16, 3531-3536).

Таким образом, ингибирующий липогенез фактор, отвечающий настоящему изобретению, воздействует на костно-мозговые или периферические преадипоциты и адипоциты, усиливая их способность поддерживать протекание гемопоэза.

Примерами белков, которые были известны до появления настоящего изобретения и которые подавляют адипоцитную дифференцировку и липопротеидную липазу у адипоцитов, является опухолевый некрозный фактор- (Price, S.R. et al. (1986), Arch. Biochem. Biophys., 251, 738-746 and Kawakami, M. et al. (1987), J. Biochem., 101, 331-338), интерлейкин-I (Beutler, B.A. and Cerami, A. (1985), J. Immunol., 135, 3969-3971), интерфероны (Keay, S. and Grossberg, S.E. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4099-4103, and Patton, J. S. et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8313-8317) и ингибирующий лейкоз фактор (Mori, M. et al. (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun., 160, 1085-1092). Кислоты кДНК этих факторов уже были клонированы, и их полные структуры уже подтверждены.

Кроме того, хотя до даты приоритета настоящего изобретения и появилось сообщение, в котором описываются выделение и экспрессия кДНК предшественника обезьянего интерлейкина-II наряду с раскрытием природы активности в отношении стимулирования плазмацитомного роста и активности в отношении образования мегакароцитной колонии применительно к надосадочной жидкости культуры (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 7512-7516 (1990)), отсутствует прямая корреляция с настоящим изобретением, поскольку в этом сообщении нечетко проведена существенная идентификация обезьянего интерлейкина-II, а также нечетко подтверждены экспрессия и активность человеческого интерлейкина-II.

Раскрытие существа изобретения Настоящие изобретатели раскрыли ранее неизвестный отдельный белок, преимущественно обладающий активностью в отношении подавления дифференцировки клеток на адипоциты, в отношении подавления протекания липопротеидной липазы на адипоциты, а также в отношении индуцирования колониестимулирующего фактора (фактор, индуцирующий колониестимулирующий фактор), и тем самым оказались в состоянии получить большие количества упомянутого белка, используя способ генной инженерии, результатом чего явилось настоящее изобретение.

Настоящее изобретение позволяет получать большие количества фактора, ингибирующего липогенез. Как таковой, упомянутый фактор может быть эффективно использован в терапии и диагностике различных типов анемий и других заболеваний крови. Например, упомянутый фактор может быть использован в случае апластической анемии, лейкопении, вызванной токсином или радиацией, инфекцией, вызванных вирусами, бактериями и паразитами, цитопении, возникающей после трансплантации костного мозга, и цитопении, вызванной химиотерапией канциростатическими средствами, и т.д. Кроме того, упомянутый фактор может быть также применен при консервации компонентов переливаемой крови, что в настоящее время находит широкое использование. Более того, помимо этих иммунологических усиливающих воздействий упомянутый фактор может быть также использован для предотвращения ожирения, препятствующего нормальному функционированию организма, или в качестве терапевтического препарата при лечении болезни.

Термин "цитопения", используемый в настоящем изобретении, распространяется на все эти заболевания, а также на различные заболевания иммунной системы, иногда вызываемые этими заболеваниями. Термин "цитопениевый амелиорант (улучшатель)" является родовым названием этих лекарственных препаратов, обладающих свойствами, эффективными в отношении предотвращения и терапии цитопении.

Кроме того, по крайней мере, одна из разновидностей активности, включающая в себя подавление морфологической дифференцировки преадипоцитных клеток на адипоциты, подавление липопротеидной липазы у адипоцитов и поддержание и промотирование способности у преадипоцитов продуцировать колониестимулирующий фактор, может быть названа как "ингибирующая липогенез активность", и белок, обладающий такой активностью, может быть назван как "ингибирующий липогенез фактор".

Настоящее изобретение касается следующих аспектов.

1. Изобретение касается белка, получаемого способом генной инженерии, который в существенной мере не содержит другие белки человеческого происхождения, обладает активностью в отношении ингибирования липогенеза и обладает свойствами, указанными ниже: 1) обладает кажущимся молекулярным весом порядка 23000, установленным электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия при восстанавливающих условиях с использованием 12,5%-ного геля; 2) он обладает N-концевой аминокислотной последовательностью в виде ряда из аминокислот 1 - 10, указанного в последовательности номер 2 перечня последовательностей, и 3) он подвергается элюированию при концентрациях хлорида натрия в области от 220 до 290 мМ в случае проведения слабой катионообменной хроматографии в следующих условиях: а) в колонке используется вещество СМ-тойоперлпэк 650М (2,2 на 20 см, фирма "Тосох корпорейшн"), б) для приготовления элюирующего буферного раствора используют раствор A (раствор борной кислоты с концентрацией 10 мМ в гидрооксиде натрия (pH 9,0) при содержании 13 мМ хлорида калия) и раствор B (раствор A, содержащий 300 мМ хлорида натрия), в) скорость потока составляет 3 мл/мин, г) градиент концентрации при проведении упомянутой хроматографии устанавливается линейно изменяющимся с переходом за 50 мин от раствора A с концентрацией 100% к раствору B с концентрацией 100%.

2. Изобретение касается белка, получаемого способом генной инженерии, который в существенной мере не содержит другие белки человеческого происхождения, обладает активностью в отношении ингибирования липогенеза и состоит из аминокислотной последовательности, составленной из аминокислот с числами 1 - 178 с образованием последовательности, указанной в аминокислотной последовательности номер 2 перечня последовательностей, или представляет собой вещество с теми же свойствами, что и упомянутый белок, у которого один или несколько аминокислотных остатков удалено, вставлено или замещено в одном или нескольких сайтах упомянутого белка.

3. Изобретение касается белка, получаемого способом генной инженерии, который в существенной мере не содержит другие белки человеческого происхождения, состоит из аминокислотной последовательности, составленной из аминокислот с числами 1 - 178 с образованием последовательности, указанной в аминокислотной последовательности номер 2 перечня последовательностей, и обладает активностью в отношении ингибирования липогенеза.

4. Изобретение касается белка по пп. 1, 2 или 3, содержащего атом водорода или группу Met (метильная группа) в N-концевом положении.

5. Изобретение касается ДНК-кодирования для белка по пп. 1, 2, 3 или 4.

6. Изобретение касается ДНК-кодирования для белка по п. 1 или п. 2, состоящего из нуклеотидной последовательности с номерами нуклеотидов от 81 до 614 с образованием последовательности, указанной в нуклеотидной последовательности номер 1 перечня последовательностей, или последовательности, обладающей эквивалентными свойствами.

7. Изобретение касается ДНК-кодирования для белка по п. 1 или п. 3, состоящего из нуклеотидной последовательности с номерами нуклеотидов от 81 до 614 с образованием последовательности, указанной в нуклеотидной последовательности номер 1 перечня последовательностей.

8. Изобретение касается ДНК с группой ATG в 5'-концевом положении у ДНК по пп. 5, 6 или 7.

9. Изобретение касается вектора экспрессии рекомбинантной ДНК, включающего в себя ДНК по пп. 5, 6, 7 или 8, в случае чего упомянутая ДНК может быть экспрессирована и репликатирована.

10. Изобретение касается хозяина, трансформированного посредством вектора экспрессии рекомбинантной ДНК по п. 9.

11. Изобретение касается способа продуцирования белка, который включает в себя культивирование хозяина, трансформированного под воздействием вектора экспрессии рекомбинантной ДНК, включающего в себя ДНК-кодирование для белка по пп. 1, 2, 3 или 4, в случае чего упомянутая ДНК может быть экспрессирована и репликатирована, и выделение упомянутого белка из клеточного экстракта или раствора культуры.

12. Изобретение касается фармацевтического состава, содержащего терапевтически эффективное количество белка по пп. 1, 2, 3 и (одновременно или по отдельности) 4 наряду с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.

13. Изобретение касается цитопениевого амелиоранта, содержащего терапевтически эффективное количество белка по пп. 1, 2, 3 и (одновременно или по отдельности) 4 наряду с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.

14. Изобретение касается препарата против ожирения, содержащего терапевтически эффективное количество белка по пп. 1, 2, 3 и (одновременно или по отдельности) 4 наряду с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.

15. Изобретение касается терапевтического или превентивного способа подавления дифференцировки преадипоцитов на адипоциты посредством введения терапевтически эффективного количества белка по пп. 1, 2, 3 и (одновременно или по отдельности) 4 пациентам с цитопенией.

16. Изобретение касается терапевтического или превентивного способа подавления дифференцировки преадипоцитов на адипоциты посредством введения терапевтически эффективного количества белка по пп. 1, 2, 3 и (одновременно или по отдельности) 4 пациентам, страдающим ожирением.

Желательно, чтобы белок, отвечающий настоящему изобретению, представлял собой белок по п. 2 или п. 3, причем лучше по п. 3.

При этом желательно, чтобы ДНК отвечала ДНК-кодированию для белка по п. 2 или п. 3, а лучше - ДНК-кодированию для белка по п. 3.

Определение белка по п. 1 может быть иным.

17. Изобретение касается белка, получаемого способом генной инженерии, который в существенной мере не содержит другие белки человеческого происхождения, обладает активностью в отношении ингибирования липогенеза и обладает свойствами, указанными ниже: 1) он обнаруживает кажущийся молекулярный вес порядка 23000, установленный электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия при восстанавливающих условиях с использованием 12,5%-ного геля; 2) он обладает N-концевой аминокислотной последовательностью вида (N)-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val: и 3) он подвергается элюированию при концентрациях хлорида натрия в области от 220 до 290 мМ в случае проведения слабой катионообменной хроматографии в следующих условиях: а) в колонке используется вещество СМ-тойоперлпэк 650М (2,2 на 20 см, фирма "Тосох корпорейшн"), б) для приготовления элюирующего буферного раствора используют раствор A (раствор борной кислоты с концентрацией 10 мМ в гидрооксиде натрия (pH 9,0) при содержании 13 мМ хлорида калия) и раствор B (раствор A, содержащий 300 мМ хлорида натрия), в) скорость потока составляет 3 мл/мин, г) градиент концентрации при проведении упомянутой хроматографии устанавливается линейно изменяющимся с переходом за 50 мин от раствора A с концентрацией 100% к раствору B с концентрацией 100%.

Определение белка по п. 2 может быть иным.

18. Изобретение касается белка, получаемого способом генной инженерии, который в существенной мере не содержит другие белки человеческого происхождения, обладает активностью в отношении ингибирования липогенеза и состоит из аминокислотной последовательности со следующей общей формулой (I), приведенной в конце описания, или касается вещества с такими же свойствами, что и у упомянутого белка, в случае которого один или несколько аминокислотных остатков удалено, вставлено или замещено в одном или нескольких сайтах упомянутого белка.

Описание белка по п. 3 может быть иным.

19. Изобретение касается белка, получаемого способом генной инженерии, который в существенной мере не содержит другие белки человеческого происхождения, обладает активностью в отношении ингибирования липогенеза и состоит из аминокислотной последовательности со следующей общей формулой (I), приведенной в конце описания.

Описание ДНК по п. 6 может быть иным.

20. Изобретение касается ДНК-кодирования для белка по п. 17 или п. 18, состоящего из нуклеотидной последовательности по следующей общей формуле (II), приведенной в конце описания, или нуклеотидной последовательности с эквивалентными свойствами.

Описание ДНК по п. 7 может быть иным.

21. Изобретение касается ДНК-кодирования для белка по п. 17 или п. 19, сводящегося к образованию нуклеотидной последовательности со следующей общей формулой (II), приведенной в конце описания.

Кислоту ДНК, отвечающую настоящему изобретению, получают, например, готовя мРНК, кодирующую белок, обладающий активностью в отношении ингибирования липогенеза, делая это из клеток млекопитающего, которые обладают способностью продуцировать упомянутый белок, с последующим превращением мРНК в двухцепочечную кДНК, используя известный способ. Хотя для животных клеток, которые служат в качестве источника упомянутой выше мРНК, отвечающей настоящему изобретению, и предпочитают использовать линию клеток КМ-102 человеческого костно-мозгового стромального происхождения (Harigaya, K. and Handa, H. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3477-3480), могут быть использованы не только опухолевые клеточные штаммы, но также могут быть использованы клетки и ткань, которые могут быть выделены из млекопитающих, или же иные установленные клеточные линии.

Хотя при проведении экстракции мРНК и может быть использован гуанидиновый тиоцианатный горячий фенольный способ или гуанидиновый тиоционатный-гуанидиновый хлористоводородный кислотный способ, предпочтение следует отдавать гуанидиновому тиоционатному хлористоцезиевому способу.

Поскольку известно, что большая часть мРНК, присутствующей в цитоплазме эукариотных клеток, обладает поли-A-последовательностью в 3'-концевой области, мРНК адсорбируют в олиго (dT)-целлюлозной колонке, с преимуществом используя эту характеристику, и затем уже очищают элюированием. Эта мРНК может быть далее подвергнута фракционированию центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и т.д.

Чтобы быть уверенным, что полученная таким способом мРНК кодирует белок, обладающий активностью в отношении ингибирования липогенеза, мРНК может быть транслирована в белок с проверкой его физиологической активности или же белок может быть идентифицирован с использованием антитела, являющегося специфическим в отношении упомянутого белка. Например, это может быть осуществлено инжекцией мРНК в ооциты Африканской древесной лягушки (Xenopus Iaevis), чтобы произошла трансляция мРНК в белок (Gurdon, J.B. et al., (1972), Nature, 233, 177-182), или использованием трансляционной реакции, в случае которой применяют ретикулоцитную лизатную систему или систему с экстрактом из семян пшеницы (Schleif, R.F. and Wensink, P.C. (1981), "Practical Method in Molecular Biology", Springer-Verlag, NY).

Тест на активность в отношении ингибирования липогенеза может быть осуществлен измерением активности в отношении морфологического изменения-подавления перехода предадипоцитов в адипоциты, что достигается использованием, например, мышиной клеточной линии 3T3-LI и т.д., или измерением липопротеидной липазой активности (Beutler, B.A. et al. (1985), J. Immunol., 135, 3972-2977).

После осуществления синтеза одноцепочечной кДНК из полученной таким способом мРНК посредством обратной транскриптазы, где мРНК играет роль матрицы, из одноцепочечной кДНК синтезируют двухцепочечную кДНК. Хотя к способам, которые могут быть использованы для проведения этого синтеза, и относятся SI-нуклеазный способ (Efstratiadis, A. et al. (1976), Cell, 7, 279-288), способ Ланда (Land, H. et al. (1981), Nucleic Acids. Res., 9, 2251-2266) и способ О. Жун Ео (Yoo, O, J. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 10449-1053), предпочтение следует отдавать способу Окаяма-Берга (Okayama, H. and Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 161-170), если говорить об объекте, являющемся предметом настоящего изобретения.

Далее, результирующие рекомбинантные плазмиды вводят в культуру Escherichia coli, например, в штамм DH5 , что необходимо для трансформации упомянутого хозяина. Требуемая рекомбинанта может быть избирательно получена с использованием тетрациклиновой невосприимчивости или ампициллиновой невосприимчивости в качестве индекса. Например, в случае, когда клеткой хозяина является культура Escherichia coli, трансформация клетки хозяина может быть произведена использованием способа Ханахана (Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580). Точнее, трансформация может быть осуществлена добавлением упомянутой рекомбинантной ДНК к компетентным клеткам, приготовленным в присутствии CaCl₂, MgCl₂ или RbCl. Между прочим, фаговые векторы лямбда-штамма и т.д. могут быть также использованы в качестве вектора вместо плазмиды.

Для селекции штамма со способностью ДНК-кодирования в отношении требуемого фактора, ингибирующего липогенез, из трансформированного хозяина, полученного указанным выше способом, могут быть использованы различные способы, указанные ниже.

1. Отборочный способ с использованием синтетической олигонуклеотидной пробы В том случае, когда аминокислотная последовательность требуемого белка полностью или частично известна (какая-либо область требуемого белка, если упомянутая последовательность состоит из большого числа продолжающихся специфических последовательностей), синтезируют олигонуклеотид, который соответствует упомянутым аминокислотам (нуклеотидная последовательность может быть сконструирована по частоте использования кодона или же она может состоять из большого числа нуклеотидных последовательностей, где нуклеотидные последовательности могут быть смешанными; в последнем случае число упомянутых последовательностей может быть снижено встраиванием инозина). Этот олигонуклеотид используют в качестве пробы (меченой фосфором-32 или серой-35) при гибридизации с использованием денатурированной ДНК трансформированного штамма, который был подвергнут иммобилизации на нитроцеллюлозном фильтре, после чего проводят поиск и селекцию результирующего положительного штамма.

2. Отбор с использованием пробы, приготовленной проведением полимеразной цепной реакции В том случае, когда аминокислотная последовательность целевого белка полностью или частично известна, синтезируют олигонуклеотиды спиралей одного и обратного направлений, соответствующие белку упомянутых аминокислот. Полимеразную цепную реакцию (Saiki, R.K. et al., (1988), Science, 239, 487-491) проводят, используя эти олигонуклеотиды для амплификации ДНК-фрагмента, кодирующего требуемый фактор, ингибирующий липогенез. Кислоту кДНК синтезируют обратной транскрипцией из мРНК клеток, которые продуцируют фактор, ингибирующий липогенез, или геномная ДНК может быть использована для матричной ДНК, применяемой в этом способе. После введения метки в виде фосфора-32 или серы-35 в приготовленный таким способом ДНК-фрагмент требуемый клон подвергают селекции, проводя колониевую гибридизацию, или бляшковую гибридизацию с использованием ДНК-фрагмента с меткой в качестве пробы.

3. Отбор с продуцированием фактора, ингибирующего липогенез, при использовании других животных клеток Штамм с кислотой кДНК, кодирующей требуемый фактор, ингибирующий липогенез, выбирают из исходных трансформированных клеточных штаммов, либо культивируя трансформированный штамм, амплифицируя ген, трансфектируя ген в животные клетки (в этом случае прибегают либо к саморепликатируемой плазмиде, содержащей транскрипционную промоторную область, либо к плазмиде, которая может быть внедрена в животную клеточную хромосому), продуцируя белок, кодированный геном, и измеряя ингибирующую липогенез активность у надосадочной жидкости с культурой или у клеточного экстракта, либо, как возможный вариант, обнаруживая ингибирующий липогенез фактор, используя антитело, пригодное для этого фактора.

4. Селекция с использованием антитела для фактора, ингибирующего липогенез Требуемый штамм подвергают селекции, заблаговременно вводя кДНК в вектор экспрессии, продуцируя белок в пределах трансформанты и обнаруживая трансформанту, продуцирующую фактор, ингибирующий липогенез, используя при этом антитело для фактора, ингибирующего липогенез, и вторичное антитело для упомянутого антитела.

5. Способ с использованием селективной гибридизационной трансляционной системмы В этом методе после нанесения пятна из кДНК, полученной из трансформанты, на нитроцеллюлозный фильтр или что-то, ему подобное, что необходимо для гибридизации мРНК или клеток, продуцирующих фактор, ингибирующий липогенез, мРНК, связанную с кДНК, подвергают диссоциации и извлечению. Извлеченную мРНК затем либо инжектируют в белковую трансляционную систему, такую как ооциты Африканской древесной лягушки, либо транслируют в белок, используя свободную от клеток систему, такую как кроликовый ретикулоцитный лизат или пшеничный зерновой экстракт, что делают с целью проверки активности такого белка в отношении ингибирования липогенеза, либо, как возможный вариант, фактор, ингибирующий липогенез, может быть обнаружен посредством использования антитела для упомянутого фактора, чем обеспечивается селекция требуемого штамма.

Как это будет описано в последующих примерах, после осуществления первичного отбора с использованием синтетической олигонуклеотидной пробы, сконструированной с учетом существования AUUUA-мотива (Shaw, G. and Kamen, R. (1986), Cell, 46, 659-667), присутствующего наряду с кислотами мРНК цитокинов, что делается еще до применения описанных выше способов, требуемая трансформанта может быть также выбрана применением описанного выше способа 3 в отношении выбранных положительных трансформант, а точнее, продуцированием ингибирующего липогенез фактора в других животных клетках, после чего следует отбор.

Способ получения ДНК, кодирующей фактор, ингибирующий липогенез, из полученной таким способом трансформанты, представляющей интерес, может находиться в согласии с известным способом (Maniatis, T. et al., (1982), "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Например, это может быть достигнуто выделением плазмидной ДНК из клеток и выделением кДНК-области из упомянутой плазмидной ДНК.

Последовательность, существующая у ДНК, полученной этим способом, может быть определена, например, использованием химического модифицированного способа Максама-Гильберта (Maxam, A.M. and Gilbert, W. (1980), "Methods in Enzymology", 65, 499-559) или использованием способа завершения дидезоксинуклеотидной цепи посредством применения фага M13 (Messing, J. and Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269-276).

И здесь, вводя фрагмент, содержащий ген, кодирующий фактор, который ингибирует липогенез, клонированный в этом способе в подходящую векторную ДНК, можно трансформировать клетки хозяина у других прокариотов и эукариотов. Более того, посредством введения надлежащего промотора и последовательности, связанной с экспрессией гена, в эти векторы, ген может быть выражен в надлежащих клетках хозяина.

Примерами прокариотных клеточных хозяев являются, допустим, культуры Escherichia coli и Bacillus subtilis. Чтобы осуществить экспрессию гена, представляющего интерес, в этих клетках хозяина, клетки хозяина могут быть трансформированы с участием репликона, выделенного из частиц, совместимых с хозяином, или, иначе говоря с плазмидным вектором, содержащим точку начала репликации и регуляторные последовательности. Кроме того, желательно, чтобы вектор обладал последовательностью, способной давать трансформированные клетки с избирательным экспрессионным характером (фенотип).

Например, штамм K12 культуры E. coli часто используют для получения хозяина, тогда как плазмиды pBR322 и pUC обычно используют для получения вектора. Однако настоящее изобретение не ограничивается использованием этих образований, и могут быть использованы любые из различных известных типов бактериальных штаммов и векторов. Примерами промоторов являются триптофановый промотор, лактозный промотор, триптофан-лактозный промотор, липопротеидный промотор, лямбда () P_L-промотор бактериофагового происхождения и промотор в виде фактора TU со спрямленной полипептидной цепью, находящийся в культуре Eschirichia coli. Любой из этих промоторов может быть использован при продуцировании ингибирующего липогенез фактора, отвечающего настоящему изобретению.

Например, штамм 207-25 желательно использовать для культуры Bacillus subtilis и pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984), J. Biochem., 95, 87-93) и т.д. - использовать для вектора. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими образованиями. Часто для промотора используют регуляторную последовательность -амилазного гена культуры Bacillus subtilis. Секреция вне бактерий может быть, далее, осуществлена использованием ДНК-последовательности, кодирующей сигнальную пептидную последовательность у -амилазы, как это необходимо.

К эукариотным клеткам хозяина относятся клетки позвоночных, насекомых, дрожжей и т.д. Хотя COS-клетки, которые являются клетками обезьяны (Gluzman, Y. (1981), Cell, 23, 175-182), и штамм с недостаточным содержанием редуктазы фолевой кислоты от яичниковых клеток Китайского хомяка (Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220) и т.д. часто и используют в качестве клеток позвоночных, настоящее изобретение не ограничивается этими клетками.

Векторы с промотором, расположенным выше гена, который должен быть экспрессирован, РНК-стыкующий сайт, сайт полиадениляции или транскрипционная завершающая последовательность и т.д. могут быть использованы для вектора экспрессии у клетки позвоночных. Этот вектор может также обладать репликационным началом, как это необходимо. Вектор экспрессии может быть проиллюстрирован образованием pSV2dhfr, имеющим ранний промотор SV40 (Subramani, S. et al. (1981). Mol. Cell. Biol., 1, 854-864). Однако настоящее изобретение не ограничивается упомянутым вектором экспрессии.

Между тем дрожжевую культуру в типичном случае используют для хозяина эукариотного микроорганизма. В частности, желательно использовать дрожжевую культуру вида сахаромицинов, такую как Saccharomyces cerevisiae. В качестве векторов экспрессии для эукариотных микроорганизмов, таких как дрожжи, может быть, например, использован спиртовый дегидрогеназный генный промотор (Bennetzen, J.L. and Hall, B.D. (1982), J. Biol. Chem., 257, 3018-3025) или кислортный фосфатазный генный промотор (Miyanohara, A. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 1-5).

Что касается клеток хозяина, то для вектора экспрессии, если, к примеру, говорить о COS-клетках, могут быть использованы вектор, способный автономно претерпевать репликацию в COS-клетках и имеющий SV40-репликационное начало, транскрипционной и РНК-связующий сайт. Упомянутый вектор экспрессии может быть введен в COS-клетки использованием DEAE-декстранового способа (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308), кальциевофосфатным-ДНК-соосадительным способом (Graham, F. and Van der Ed., A.J. (1973), Virology, 52, 456-457) или электропорационным способом (Neumann, E. et al. (1982), EMBO J., 1, 841-845), чем обеспечивается получение требуемых трансформированных клеток. Между тем, в случае использования яичниковых клеток Китайского хомяка для клеток хозяина трансформированные клетки, которые стабильно продуцируют фактор, ингибирующий липогенез, могут быть получены котрансфекцией вектора, способного экспрессировать неогенное функционирование, как в случае резистентного маркера G418: такого как pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY) или pSV2-neo (Southern, P.J. and Berg, P. (1982), J. Mol. Appl. Cenet. 1, 327-341), наряду с вектором экспрессии, с последующей селекцией G418-резистентных колоний.

Требуемая трансформанта, полученная таким способом, может быть культивирована обычным способом, и тем самым фактор, ингибирующий липогенез, может быть продуцирован либо внутри, либо вне клеток. Среда, используемая при проведении упомянутого культивирования, может быть с успехом выбрана из тех различных типов, которые обычно используют с учетом характера взятых клеток хозяина. Примерами сред, которые могут быть использованы в случае, когда упомянутые выше COS-клетки применяют в качестве клеток хозяина, являются среда RPMI-1640 и минимальная питательная среда Игла (Eagle), модифицированная Далбекко (Dulbecco), к которой при необходимости добавляют сывороточную компоненту, такую как сыворотка коровьего плода.

Так, фактор, ингибирующий липогенез, который продуцирован либо внутри, либо вне клеток трансформанты, может быть выделен и очищен самыми разными известными способами выделения, применяемыми с учетом физических свойств, химических свойств и т.д. фактора, ингибирующего липогенез. Практические варианты реализации упомянутых способов включают обработку обычными белковыми осадителями, ультрафильтрацию, различные типы жидкостной хроматографии, такой как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография по сродству и высокоэффективная жидкостная хроматография, диализ и использование этих методов в совокупности.

По описанному выше способу требуемый фактор, ингибирующий липогенез, может быть легко произведен в промышленном масштабе, причем как с высоким выходом, так и с высокой чистотой. Различные физические свойства рекомбинантного ингибирующего липогенез фактора, отвечающего настоящему изобретению, который получен этим способом, подробно описаны в последующих примерах. Этот фактор является полезным в различных областях, указанных ранее, что следует из его биологической активности.

Чтобы вещество, полученное способом генной инженерии с использованием ДНК, отвечающей настоящему изобретению, по способу, описанному выше, экспрессировало активность в отношении ингибирования липогенеза, не всегда оказывается необходимым, чтобы упомянутое вещество обладало всеми аминокислотными последовательностями предшественника (белка, составленного из аминокислот с аминокислотными числами от -21 до +178), указанными в последовательности с номером 2 перечня последовательностей; необходимой может быть лишь часть последовательности, к примеру, и эти аминокислотные последовательности включаются в белок, отвечающий настоящему изобретению, поскольку упомянутая последовательность проявляет активность в отношении ингибирования липогенеза.

Примерами такого белка, который проявляет активность в отношении ингибирования липогенеза, являются белки, состоящие из 178 аминокислот с аминокислотой Pro (пролин), которая представляет собой аминокислоту с номером 1 у аминокислотной последовательности, указанной в последовательности с номером 2 перечня последовательностей, и является N-концевой, или, иначе говоря, сюда входят те белки, которые, как это считается, представляют собой факторы с четко проявляемой активностью в отношении ингибирования липогенеза. Между прочим, этот белок обладает кажущимся молекулярным весом порядка 23000, установленным электрофорезом в полиакрилламидном геле с додецилсульфатом натрия при восстанавливающих условиях.

В добавление к сказанному, ДНК, кодирующая упомянутый развившийся фактор с активностью в отношении ингибирования липогенеза, служит также примером ДНК, отвечающей настоящему изобретению. Более желательно, чтобы упомянутая ДНК представляла собой ДНК с номерами от 81 до 614 у нуклеотидной последовательности, указанной последовательностью с номером 1 перечня последовательностей.

В общем случае считают, что гены у эукариотов проявляют полиморфизм, типа известного в случае гена интерферона и т.д. (см., например, работу Nishi, T. et al. (1985), J. Biochem., 97, 153-159). При проявлении этого полиморфизма в виде замещения одной или нескольких аминокислот появляются случаи, когда все разные аминокислоты остаются теми же самыми, несмотря на изменение в нуклеотидной последовательности.

Даже те белки, у которых один или несколько аминокислотных остатков удалено, введено или замещено, по крайней мере, в одном сайте аминокислотной последовательности предшественника фактора с ингибирующей активностью в отношении липогенеза, состоящего из аминокислот с номерами от -21 до +178 у аминокислотной посл