Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов

Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к новым белкам, являющимся факторами роста и развития мегакариоцитов (MGDFs; в основном обозначенных как Mp1-лиганды), биологическая активность которых заключается в стимулировании роста мегакариоцитов и их дифференцировки или созревания, что в конечном счете приводит к образованию тромбоцитов. Изобретение относится также к производным MGDF, содержащим молекулы MGDF, соединенные с водорастворимыми полимерами, такими как полиэтиленгликоль, и к способам получения таких производных. Кроме того, изобретение относится к способам получения MGDFs в форме гомогенных препаратов из природных источников, а также к способам получения MGDFs из млекопитающих (включая человека) с помощью рекомбинантной генно-инженерной технологии. Преимущество изобретения заключается в том, что указанные белки имеют терапевтическое применение вследствие их увеличенной стабильности и времени их циркуляции, а химическая модификация данных белков препятствует их деградации. 16 с. и 23 з.п.ф-лы, 25 ил., 12 табл.

Изобретение относится к новым белкам, обозначенным как Mpl-лиганды или MGDF, которые стимулируют рост мегакариоцитов и усиливают дифференцировку или созревание мегакариоцитов, что неизбежно ведет к увеличению числа тромбоцитов. Кроме того, изобретение относится к способам получения данных белков в гомогенной форме из природных источников и методам генетической инженерии.

С другой стороны, настоящее изобретение тесно связано с новым классом MGDF-производных, в которых молекула MGDF соединена с водорастворимым полимером. Описаны также способы получения подобных производных. Кроме того, в настоящем изобретении описаны MGDF-производные, в которых молекула MGDF соединена с одной или более полиэтиленгликолевыми ("ПЭГ") группами, а также методы их получения.

Изобретение затрагивает по меньшей мере две широкие области исследований. Первая из них - развитие мегакариоцитов с последующим образованием тромбоцитов, а вторая - свойства полипептида, входящего в семейство рецепторов факторов роста, обозначенного как Mpl-рецептор, и его лигандов. Каждая из указанных областей исследований будет более подробно рассмотрена ниже.

А. Образование тромбоцитов из мегакариоцитов Тромбоциты крови - это циркулирующие клетки, которые играют важную роль в предотвращении кровопотери и свертывании крови. Мегакариоциты являются клеточным источником тромбоцитов и происходят из общей костно-мозговой клетки предшественника, которая дает начало всем росткам кроветворения. Эта общая клетка-предшественник известна как плюрипотентная стволовая клетка или PPSC.

Иерархия мегакариоцитарных клеток-предшественников была определена на основе времени появления и размера мегакариоцитарных (МК) колоний, образующихся в системах культивирования in vitro в ответ на воздействие соответствующих ростовых факторов. Бурст-образующая мегакариоцитарная клетка (BFU-MK) является наиболее примитивной мегакариоцитарной клеткой-предшественником. Считается, что BFU-MK дает начало многочисленным колониеобразующим мегакариоцитам (CPU- MK), представляющим собой более дифференцированные МК клетки-предшественники.

По мере того, как МК клетки проходят последовательную дифференцировку, они утрачивают способность к митозу, но приобретают способность к эндоредупликации. Эндоредупликация (или эндомитоз) - это феномен ядерного деления в отсутствие деления клетки. Эндоредупликация неизбежно приводит к образованию полиплоидных МК клеток. Дальнейшее созревание МК приводит к приобретению цитоплазматических органелл и компонентов мембраны, характерных для тромбоцитов.

Тромбоциты образуются из зрелых МК посредством малоизученного процесса, который, как считают, является следствием физической фрагментации МК. Возможны и другие механизмы. Обнаружение в мегакариоцитах протяженных мембранных структур привело к формированию модели образования тромбоцитов, согласно которой разделяющая мембранная система отделяет образующиеся тромбоциты внутри клетки. Другая модель образования тромбоцитов основывается на том факте, что мегакариоциты образуют длинные цитоплазматические отростки, примерно соответствующие по диаметру размеру тромбоцита. Предположительно, от этих отростков и отрываются тромбоциты под действием тока крови в костном мозге и/или в легких. Эти цитоплазматические отростки были названы Бекером и ДеБрюном протромбоцитами, чтобы подчеркнуть их предполагаемую роль предшественников в процессе формирования тромбоцитов. CM.Becker and DeBruyn, Amer.J.Anat. 145: 183 (1976).

На фиг. 1 представлены различные клетки-предшественники, участвующие в развитии мегакариоцитов и тромбоцитов. Крайняя левая клетка на фиг. 1 - PPSC, правее от нее - BFU-MK, за которой следует CFU-MK. Клетка, претерпевающая эндоредупликацию и расположенная сразу же справа от PPSC, представляет собой зрелую мегакариоцитарную клетку. В результате эндомитоза эта клетка становится полиплоидной. Далее справа представлена структура с длинными цитоплазматическими отростками, образующимися из полиплоидного ядра зрелой мегакариоцитарной клетки. В крайней правой части фиг. 1 изображены многочисленные тромбоциты, образовавшиеся путем фрагментации цитоплазматических отростков.

Далее перечислены некоторые важные публикации, имеющие отношение к изложенному описанию созревания мегакариоцитов и образования тромбоцитов: 1. Williams, N and Levine, R.F., British Journal of Haematology 52: 173-180 (1982).

2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, pub. Wiley-Liss, Inc.: 1-10 (1990).

3. Gewirtz, A. M. The Biology of Hematopoiesis, pub.Wiley- Liss, Inc.: 123-132 (1990).

4. Han, Z.C., et al., Int.J.Hematol. 54: 3-14 (1991).

5. Nieuwenhuis, H, K. and Sixma, J., New Eng.J. of Med. 327: 1812-1813 (1992).

6. Long.M., Stem Cells 11: 33-40 (1993).

В. Регуляция образования тромбоцитов Большое количество данных, полученных в различных лабораториях, указывает на то, что образование тромбоцитов регулируется гуморальными факторами. Сложность этого биологического процесса первоначально недооценивалась, но в настоящее время стало очевидно, что ряд человеческих ростовых факторов обладает такой способностью.

Регуляция роста мегакариоцитов происходит на нескольких клеточных уровнях. Некоторые цитокины усиливают образование тромбоцитов посредством увеличения пула клеток-предшественников. Другая группа гуморальных ростовых факторов служит факторами созревания, действуя на более дифференцированные клетки и ускоряя эндоредупликацию. Кроме того, в регуляции этих процессов имеются две независимые петли обратной связи.

Несколько групп неспецифических гематопоэтических ростовых факторов оказывают важное воздействие на созревание МК.

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерлейкин-3 (IL-3), IL-6, IL-11, фактор подавления лейкоза (LIF) и эритропоэтин (ЕРО) независимо и индивидуально ускоряют созревание МК in vitro, о чем судят по размеру МК, их числу и плоидности. Воздействие LIF, IL-6 и IL-11 на созревание МК частично (LIF и IL-6) или полностью (IL- 11) дополняет таковое действие IL-3. Данные приведенных ниже публикаций дают основание считать, что для усиления созревания МК in vivo может быть необходимо сочетание цитокинов.

Далее перечислены некоторые основные публикации, посвященные регуляции образования мегакариоцитов и тромбоцитов.

7. Hoffman, R. et al. Blood Cells 13: 75-86 (1987).

8. Murphy, M. J. , Hematology/Oncology Clinics of North America 3 (3): 465-478 (1988).

9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989).

10. Mazur, E. M. and Cohen, J.L., Clin.Pharmacol.Ther., 46(3): 250-256 (1989).

11. Gewirtz, A. M. and Calabretta. B., Int.J.Cell Cloning 8: 267-276 (1990).

12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990).

13. Gordon, M.S. and Hoffman, R., Blood 80 (2): 302- 307 (1992).

14. Hunt, P. et al., Exp.Hematol.21: 372-381 (1993).

15. Hunt, P. et al., Exp.Hematol.21: 1295-1304 (1993).

Сообщалось также о том (см. ссылку 16), что человеческая апластическая сыворотка содержит мегакариоцитарную колониестимулирующую активность, отличную от IL-3, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и факторов, присутствующих в кондиционированной среде лимфоцитов. Однако обусловливающие эту активность молекулы не выделены и не охарактеризованы до настоящего времени.

16. Mazur.E.M., etal. Blood 76:290-297 (1990).

С. Рецептор Mpl Миелопролиферативный лейкозный вирус (MPLV) - это дефектный по репликации ретровирус мышей, вызывающий у инфицированных им млекопитающих острый лейкоз. Показано, что экспрессируемый MPLV ген состоит из фрагмента гена, кодирующего ретровирусный поверхностный белок, соединенного с последовательностью, родственной рецепторам цитокинов, включая рецепторы GM-CSF, G-CSF и ЕРО.

Экспрессия указанного гена MPLV в мышиных клетках- предшественниках различных типов приводит к быстрому приобретению независимости от ростовых факторов, которые в норме необходимы для пролиферации и конечного созревания. Кроме того, тот факт, что в некоторых культурах костно-мозговых клеток, трансформированных MPLV, обнаруживаются мегакариоциты, указывает на связь между геном MPLV и ростом и дифференцировкой мегакариоцитов.

В настоящее время показано, что вирусный ген MPLV (обозначенный как v-Mpl) имеет гимолог в клетках млекопитающих, который назван клеточным геном Mpl (или c-Mpl). С использованием проб на основе v-Mpl удалось проклонировать кДНК, соответствующую человеческому c-Mpl гену. См. опубликованную заявку РСТ 92/07074 (публ.30 апреля 1992). Анализ последовательностей показал, что белок, кодируемый геном c-Mpl, принадлежит к высококонсервативному суперсемейству рецепторов цитокинов, также как и гомологичный продукт гена v-Mpl.

Вывод о функциональной роли клеточного гена c-Mpl в гематопоэзе основывается на данных о том, что его экспрессия обнаруживается в костном мозге, селезенке и эмбриональной печени нормальных мышей, но не в других тканях. В частности, c-Mpl экспрессируется в мегакариоцитах. Показано также, что человеческий c-Mpl экспрессируется в CD34-положительных клетках, включая очищенные мегакариоциты и тромбоциты. CD34 - это антиген, характерный для ранних кроветворных клеток-предшественников. Кроме того, обработка CD34-положительных клеток синтетическими олигонуклеотидами, антисмысловыми по отношению к c-Mpl мРНК, значительно подавляет колониеобразующую способность CFU-MK мегакариоцитарных предшественников, но не оказывает эффекта на эритроидные и гранулоцитарно-макрофагальные предшественники.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что c-Mpl кодирует молекулу клеточной поверхности, обозначенную как Mpl-рецептор. Связывание лиганда активирует рецептор и, вероятно, приводит к образованию и/или развитию мегакариоцитов.

Опубликованная заявка PCT 92/07074 относится к последовательности белка, кодируемого геном cMpl как человека, так и мыши. Продукт этого гена, который, как упоминалось, является рецептором, состоит по меньшей мере из трех областей или доменов: внеклеточного домена, трансмембранного домена и внутриклеточного (или цитоплазматического) домена. Соединенные вместе, эти домены составляют интактный рецептор Mpl. В упомянутой публикации PCT также говорится о растворимой форме рецептора, которая в значительной степени соответствует внеклеточному домену зрелого белка c-Mpl. Внутриклеточный домен содержит гидрофобную область, и при соединении ее через трансмембранный домен с внеклеточным доменом весь белок становится нерастворимым. С другой стороны, когда внеклеточный домен продукта гена c-Mpl отделен от трансмембранного и внутриклеточного доменов, белок становится растворимым, поэтому внеклеточная форма белка обозначена как "растворимая" форма рецептора.

Ниже перечислены основные публикации, посвященные рецепторам v-Mpl и c-Mpl и их генам.

17. Wendling. F., et al., Leukemia 3 (7): 475-480 (1989).

18. Wendling. F., et al., Blood 73 (5): 1161-1167 (1989).

19. Souyri. M.,et al., Cell 63: 1137-1147 (1990).

20. Vigon. l., Proc.Natl.Acad.Sci USA 89: 5640-5644 (1992).

21. Skoda. R.C., et al. The EMBO Journal 12 (7): 2645-2653 (1993).

22. Ogawa. M., Blood 81 (11): 2844-2853 (1993).

23. Methia. N., et al. Blood 82 (5): 1395-1401 (1993).

24. Wendling. F., et al. Blood 80: 246a (1993).

D. Потребность в агенте, способном стимулировать образование тромбоцитов Имеются сообщения о том, что переливание тромбоцитов производят все в большем числе случаев в медицинских центрах Северной Америки, Западной Европы и Японии. см. Gordon, M.S. и Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992). Это в значительной степени обусловлено усовершенствованием медицинских методов и распространением новых технологий в сердечной хирургии, а также пересадок костного мозга, сердца и печени. Увеличение доз химиопрепаратов при терапии раковых больных и распространение HIV- 1 инфекции также внесли свой вклад в возрастающую потребность в тромбоцитах.

Переливание тромбоцитов несет с собой возможность распространения многих заболеваний, передающихся с кровью, а также возможность аллоиммунизации. Кроме того, получение очищенных тромбоцитов - процедура дорогостоящая и все более частое ее применение ведет к возрастанию общих медицинских расходов. Поэтому существует острая необходимость в новых усовершенствованных методах получения тромбоцитов для переливания людям.

Далее приведены некоторые примеры экспериментальных подходов к увеличению образования тромбоцитов.

В патенте США N 5,032,396 описана способность интерлейкина-7 (IL-7) стимулировать образование тромбоцитов. Интерлейкин-7, известный также как лимфопоэтин-1, это лимфопоэтический ростовой фактор, стимулирующий рост предшественников T- и B-клеток в костном мозге. В опубликованной заявке PCT 88/03747 (подана 19 октября 1988) и в заявке на Европейский патент 88309977.2 (подана 24 октября 1988) описаны ДНК, векторы и необходимые способы для получения IL-7 млекопитающих методами генетической инженерии. Данные, представленные в патенте США, свидетельствуют о том, что IL-7 может увеличивать число циркулирующих тромбоцитов у нормальных и сублетально облученных мышей.

В патенте США N 5,087,448 показано, что мегакариоциты и тромбоциты млекопитающих можно стимулировать к пролиферации при помощи интерлейкина-6 (IL-6). Рекомбинантный человеческий IL-6 представляет собой гликопротеин с мол. массой 26,000, обладающий несколькими биологическими активностями. Представленные в этом патенте данные указывают на то, что IL-6 увеличивает образование мегакариоцитарных колоний в тестах in vitro.

Ни в одном из процитированных патентов не упоминаются Mpl-лиганды, описанные в настоящем изобретении.

Несмотря на упомянутые достижения, потребность в новых стимуляторах мегакариоцитов и/или тромбоцитов у млекопитающих остается весьма острой.

Е. Предпосылки получения химически модифицированного MGDF Белки для терапевтического применения в настоящее время доступны в значительных количествах и приемлемых формах в основном благодаря достижениям технологии рекомбинантных ДНК. Химические модификации таких белков могут эффективно предотвращать физический контакт протеолитических ферментов с собственно белковым каркасом, тем самым препятствуя деградации. При определенных условиях могут проявиться и такие преимущества, как увеличение стабильности и времени циркуляции терапевтического белка и уменьшение его иммуногенности. Однако, необходимо подчеркнуть, что эффект модификации в отношении каждого конкретного белка трудно предсказать. Френсисом опубликована обзорная статья, посвященная модификации белков, в том числе и слитных: Focus on Growth Factors 3:4-10 (May, 1992) (опубликовано Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD UK).

Полиэтиленгликоль ("ПЭГ", "пэг" или PEG) - одно из химических веществ, применяемых для приготовления фармакологических форм терапевтических белков. Например, Адаген-R, препарат пэгированной аденозиндезаминазы, рекомендован для лечения острого комбинированного иммунодефицита; пэгированная супероксиддисмутаза проходит клинические испытания для лечения повреждений головы; пэгированный альфа-интерферон прошел фазу 1 клинических испытаний для лечения гепатита; пэгированная глюкоцереброзидаза и пэгированный гемоглобин находятся на стадии доклинических испытаний. Для некоторых белков показано, что прикрепление полиэтиленгликоля защищает от протеолиза (Sada et at., J. Fermentation Bioengineering 71: 137:139 (1991)), и известны методы присоединения полиэтиленгликоля. См. Патент США N 4,179,337, Davis et al., "Неиммуногенные полипептиды", выданный 18 декабря 1979, и Патент США N 4,002,531, Royer "Модификация ферментов полиэтиленгликолем и продукты этого процесса", выданный 11 января 1977. В качестве обзора см. Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs (J.S.Holcerberg and J.Roberts, eds.pp. 367-383 (1981)).

Для модификации белков используют и другие водорастворимые полимеры, такие как кополимер полиэтиленгилколь/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, кополимер этилен/малеиновый ангидрид и полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры).

Ряд подходов был использован для присоединения молекул полиэтиленгликоля к белку. Обычно молекулы полиэтиленгликоля присоединяют к белку посредством одной из активных групп белка. Подходящими для такого присоединения являются аминогруппы, например аминогруппы остатков лизина или аминогруппы N-конца. Например, Ройер (Патент США N.4,002,531) использовал восстанавливающее алкилирование для присоединения молекул полиэтиленгликоля к ферменту. В Европейском патенте N 0539167 на "Имидаты ПЭГа и их белковые производные", опубликованном 28 апреля 1993 г., Райт описывает пептиды и органические соединения со свободной аминогруппой (группами), модифицированными имидатными производными ПЭГа или другими водорастворимыми органическими полимерами. В Патенте США No 4,904,584, выданном 27 февраля 1990 г., Шоу описывает модификацию остатков лизина в белках для присоединения молекул полиэтиленгликоля через реактивные аминогруппы.

Один из терапевтических белков, который был химически модифицироваи, это - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, "G-CSF". См.EP N 0401384, ЕР N 0473268 и ЕР N 0335423.

Другим примером служит пэгированный IL-6 (см. Европейский патент N 0442724, озаглавленный "Модифицированный hlL-6", а также родственную заявку U. S. 07/632,070, в которой описаны молекулы полиэтиленгликоля, присоединенные к IL-6. В Европейском патенте, N 0154316, опубликованном 11 сентября 1985, описано взаимодействие лимфокина с альдегидом полиэтиленгликоля.

Возможность модификации MGDF неизвестна, поскольку она определяется специфическими структурными параметрами каждого конкретного белка. Кроме того, непредсказуемо воздействие такой модификации на биологические свойства отдельного белка. В силу многочисленных клинических применений MGDF, описанных в настоящей заявке, было бы желательно получить производное этого белка с измененными свойствами. Подобные молекулы могли бы иметь увеличенное время полужизни и/или усиленную активность in vivo, наряду с другими свойствами.

Пэгирование белка обычно приводит к образованию смеси молекул химически модифицированного белка. Например, молекулы белка с пятью остатками лизина и свободной аминогруппой на N-конце при пэгировании по описанному методу могут образовать гетерогенную смесь, в которой некоторые молекулы белка будут иметь шесть присоединенных молекул ПЭГа, некоторые - пять, некоторые - четыре или три, или две, или одну, или вообще ни одной. При этом полиэтиленгликолевые группы могут быть присоединены к различным молекулам белка в различных участках.

Часто желательно получить гомогенный продукт, содержащий по существу всего одну или небольшое число (2-3) форм модифицированного белка, отличающихся числом и/или локализацией полиэтиленгликолевых групп. Однако, при некоторых терапевтических показаниях могут быть желательны или пригодны смеси моно-, ди-и/или три-пэгированных форм.

Непостоянство смеси от партии к партии является недостатком при разработке терапевтического пэгированного белка. В этом случае важна предсказуемость биологической активности. Например, показано, что при неселективной конъюгации супероксиддисмутазы с полиэтиленгликолем отдельные фракции модифицированного фермента оказываются полностью неактивными (P.McGoff et al., Chem. Pharm. Bull. 36: 3079-3091 (1988)). См.также Rose et al. Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991), которыми показано селективное прикрепление линкерной группы карбоксигидразида к С-концу карбоксильной группы белкового субстрата (инсулина). Если терапевтический белок непостоянен по составу от партии к партии, предсказуемость его свойств недостижима. Отдельные молекулы полиэтиленгликоля в определенных участках могут быть прикреплены слабее, чем в других, что может приводить к диссоциации ПЭГа и белка. Очевидно, если молекулы ПЭГа случайным образом присоединены к белку и диссоциируют также случайно, фармакокинетику терапевтического белка точно предсказать невозможно.

Также весьма желательным было бы получить такое производное MGDF, в котором бы отсутствовало соединительное звено между полимером и белком. Одна из проблем, связанных с применением описанных выше методов, состоит в том, что обычно требуется некое соединительное звено между белком и молекулой полиэтиленгликоля. Это соединительное звено может быть антигеном, что также является недостатком при разработке терапевтического препарата белка.

Методы без участия соединительных групп описаны Fransis et al., в кн. "Стабильность белковых фармацевтических препаратов: пути деградации in vivo и стратегия стабилизации белков" (Ed.Ahern., Т. and Manning,М.С.) Plenum, New York, 1991). См. также Delgado et al., "Соединение ПЭГа с белком путем активации с трезил-хлоридом, применения в иммуноаффинных клеточных препаратах и Fisher et al., ред. Разделение с использованием систем с водной фазой. Применение в клеточной биологии и биотехнологии. Plenum Press, N.Y., 1989, стр.211-213, где описано использование трезил-хлорида, что приводит к отсутствию соединительных групп между полиэтиленгликолем и белком. Данный метод трудно применить для получения терапевтических препаратов, поскольку использование трезил-хлорида приводит к образованию токсичных побочных продуктов.

Chamow et al.,. Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) описали модифицирование CD-иммуноадгезина альдегидом моно-метокси полиэтиленгликоля ("MePEG") посредством восстановительного алкилирования. Авторы сообщают, что 50% CD4-lg было модифицировано MePEG при селективной реакции по альфа-аминогруппе N-конца (см.цит.источник, стр.137). Авторы также сообщают, что способность модифицированного CD4-lg связываться in vivo с белком gp 120 уменьшалась в зависимости от степени связывания с MePEG.

Таким образом, имеется потребность в производных MGDF, в частности в пэгированном MGDF. Существует также необходимость разработки способов получения подобных производных.

В настоящем изобретении заявлены новые полипептиды, специфически усиливающие рост и/или развитие мегакариоцитов ("Mpl-лиганды" или "MGDFs"), которые, по существу, свободны (т.е. очищены) от других белков (т.е. белков млекопитающих в случае Mpl- лигандов, получаемых из соответствующих источников). Эти белки могут быть выделены из клеток, продуцирующих факторы естественным образом или в силу индукции другими факторами. Они могут также быть получены методами генетической инженерии. Кроме того, Mpl- лиганды могут быть синтезированы химическими методами или получены при комбинировании описанных подходов.

Заявленные в настоящем изобретении Mpl-лиганды могут быть получены в нативном виде из клеток и тканей млекопитающих. В разделе Примеров настоящей заявки описаны два Mpl-лиганда, выделенные из апластической плазмы собак. Однако, как описано в других Примерах настоящей заявки, близкородственные Mpl-лиганды присутствуют в апластической плазме человека и свиньи. Примечательно, что активность человеческого, свиного и собачьего Mpl-лиганда специфически подавляется растворимой формой мышиного Mpl-рецептора, что свидетельствует о сильном сходстве этих Mpl-лигандов как в отношении структуры, так и в отношении функции.

Mpl-лиганды человека, свиньи и других млекопитающих могут быть выделены из природных источников методами, описанными в настоящей заявке (см. Пример 10). Таким образом, настоящее изобретение включает в себя Mpl-лиганды млекопитающих, т. е. собаки, свиньи, человека, мыши, лошади, овцы и кролика. Особенно предпочтительными являются Mpl-лиганды собаки, свиньи и человека.

Кроме того, гены, кодирующие Mpl-лиганды человека, были клонированы из библиотек эмбриональных почки и печени. Эти гены просеквенированы, как описано в разделе Примеров настоящей заявки. Показано, что две полипептидные последовательности человека обладают активностью в клеточных тестах (см. Пример 4). Они отличаются по длине, однако идентичны в значительной части своих аминокислотных последовательностей. Одинаковые участки имеют гомологию с эритропоэтином. Mpl-лиганды обозначаются и как факторы роста и развития мегакариоцитов (MGDFs); все указания на Mpl-лиганды имеют такое же отношение и к MGDFs, и наоборот. "Полипептид MGDF" означает полипептид, обладающий способностью специфически стимулировать или ингибировать рост и/или развитие мегакариоцитов. Примеры подобных полипептидов приведены в настоящей заявке.

Описанные в настоящем изобретении Mpl-лиганды проявляют специфическую активность по отношению к мегакариоцитарному ростку кроветворения, усиливая созревание и/или пролиферацию мегакариоцитов, как это показано в Примерах 2 и 4 далее. Термин "специфически" означает, что биологическая активность полипептидов проявляется в значительной степени в отношении мегакариоцитов, нежели в отношении клеток других типов. Те факторы, которые обладают стимулирующим воздействием на мегакариоциты, имеют in vivo активность, стимулирующую образование тромбоцитов. Происходит это посредством стимуляции созревания и дифференцировки мегакариоцитов.

Два предпочтительных Mpl-лиганда собачьего происхождения имеют молекулярные массы около 25 кД и 31 кД, как определено электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в невосстанавливающих условиях. Оба белка были очищены по одной и той же методике, приведенной в разделе Примеров.

Два предпочтительных лиганда человеческого происхождения, MGDF-1 и MGDF-2, состоят соответственно из 332 и 173 аминокислот и не включают 21 аминокислоту предполагаемого сигнального пептида.

Другим аспектом настоящего изобретения являются процессы выделения и очистки указанных Mpl-лигандов или их фрагментов из природных источников, предпочтительно цельной крови, сыворотки или плазмы млекопитающих. В качестве исходного материала наиболее предпочтительны апластические кровь, сыворотка или плазма. Они могут быть получены с использованием процедуры облучения млекопитающих, например, дозой около 400-800 рад с помощью кобальта-60, что делает данных животных апластичными. Подобная процедура хорошо известна, как видно из публикаций, процитированных в Примере 1. В случае человека апластические кровь, сыворотка или плазма могут быть получены от пациентов, проходящих радиотерапию, например, при онкологических заболеваниях.

Затем апластические кровь, сыворотка или плазма подвергаются процессу очистки. Заявленный в настоящем изобретении процесс очистки состоит из нескольких ключевых этапов: аффинной хроматографии с пектином и аффинной хроматографии с Mpl-рецептором. Каждый из этих этапов дает приблизительно 300-500-кратную очистку 25 кД и 31 кД белков из апластической плазмы собаки. Другим стандартные методы очистки белков могут быть использованы вместе с указанными для дальнейшей очистки Mpl-лигандов, как это описано ниже.

Другим аспектом настоящего изобретения являются полинуклеотиды, кодирующие белок Mpl-лиганда млекопитающих. Такие последовательности ДНК могут включать выделенные последовательности ДНК, которые направляют экспрессию белков Mpl-лигандов млекопитающих, как это описано далее. Эти последовательности ДНК могут также включать 5' и 3' некодирующие последовательности млекопитающих, ланкирующие кодирующие последовательности Mpl-лигандов. Кроме того, последовательности ДНК могут кодировать аминотерминальный сигнальный пептид. Подобные последовательности могут быть получены любым из известных методов, включая полный или частичный химический синтез. Кодоны могут быть оптимизированы для экспрессии в определенном хозяине (например, E.coli или клетках CHO).

В настоящем изобретении также заявлены рекомбинантные молекулы ДНК, каждая из которых представляет собой векторную ДНК, соединенную с последовательностями ДНК, кодирующими Mpl-лиганд млекопитающих. В этих рекомбинантных молекулах ДНК Mpl- лиганда функционально соединена с регуляторной последовательностью, обеспечивающей репликацию и экспрессию Mpl-лиганда в определенных клетках- хозяевах. Клетки-хозяева (например, бактерий, насекомых, млекопитающих, дрожжей или растений), трансформированные такими молекулами ДНК с целью экспрессии рекомбинантного белка Mpl-лиганда, также являются предметом данного изобретения.

Молекулы ДНК и трансформированные клетки, заявленные в настоящем изобретении, могут быть использованы для получения рекомбинантного белка Mpl-лиганда млекопитающих или его фрагментов. Клеточную линию, трансформированную последовательностями ДНК, кодирующими Mpl-лиганд или его фрагмент (или упомянутыми выше рекомбинантными молекулами ДНК) в функциональной ассоциации с подходящими регуляторными последовательностями, культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантной ДНК. В этом процессе многие клеточные линии могут быть использованы в качестве клеток-хозяев для экспрессии белка. Предпочтительными для получения Mpl-лиганда являются клеточные линии млекопитающих (например, клетки CHO) и бактериальные клетки (например, E.coli).

Для получения Mpl-лиганда в клетках E.coli предпочтительно, чтобы на N-конце экспрессируемого белка находились остатки Met и Lys, поскольку в этом случае выход продукта экспрессии обычно выше. Человеческий MGDF насчитывает 165 аминокислот (т.е. Met-2 Lys-1 [1-163] MGDF (при отсчете с первой аминокислоты зрелого белка). После очистки продукта, экспрессированного в таких бактериальных клетках, как E.coli, терминальные Met-Lys остатки могут быть удалены обработкой какой- либо дипептидазой (например, катепсином С).

Экспрессированный белок Mpl-лиганда затем выделяют из клеток-хозяев, клеточного лизата или культуральной среды одним из обычных методов. Кондиционированная среда может быть подвергнута тем же этапам очистки (или их модификациям) Mpl-лиганда, что и апластическая плазма.

Другим предметом настоящего изобретения являются рекомбинантные Mpl-лиганды. Эти белки, по существу, свободны от других биологических структур животного происхождения, в особенности белков. Заявленные в настоящем изобретении Mpl-лиганды характеризуются одной или более физической, биохимической, фармакологической или биологической активностями. Данные активности описаны в заявке.

В настоящем изобретении также заявлен химически модифицированный MGDF, состоящий из собственно белка MGDF, соединенного по меньшей мере с одним водорастворимым полимером, а также методы получения и применения таких композиций. В частности, заявлен такой химически модифицированный MGDF, в котором посредством реакции с полиэтиленгликолем к MGDF присоединяется ПЭГ. Подобное соединение может быть достигнуто такими описываемыми ниже реакциями пэгирования, как ацилирование или алкилирование. Ацилирование или алкилирование с ПЭГом могут проводиться в таких условиях, при которых конечный продукт будет монопэгирован или полипэгирован. При полипэгировании обычно происходит прикрепление ПЭГа к эпсилонаминогруппам остатков лизина, при этом также возможно пэгирование N-конца белка. При монопэгировании предпочтительно происходит присоединение ПЭГа к альфа-аминогруппе N-конца белка. Выход и гомогенность продукта реакции монопэгирования могут быть увеличены посредством такого восстанавливающего алкилирования, при котором селективно модифицируется альфа-аминогруппа N-конца белка MGDF, тем самым обеспечивая избирательное прикрепление водорастворимого полимера к N-концу белка. Такой подход позволяет получать преимущественно гомогенные препараты конъюгата полимер/MGDF-белок, так же как и (в случае использования ПЭГа) препараты пэгированного белка MGDF, в которых полиэтиленгликоль непосредственно соединен с белком.

В настоящем изобретении также заявлены фармацевтические препараты (композиции), содержащие терапевтически эффективное количество очищенного природного или рекомбинантного Mpl-лиганда, который может быть модифицирован таким водорастворимым полимером, как полиэтиленгликоль, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или буфером. Данные фармацевтические препараты могут быть использованы для лечения таких болезненных состояний или расстройств, которые характеризуются недостатком мегакариоцитов и/или тромбоцитов, также как и недостатком Mpl-лиганда in vivo. Они могут также использоваться профилактически для компенсации ожидаемой потери мегакариоцитов или тромбоцитов (например, при хирургических операциях).

Таким образом, заявленные в настоящем изобретении Mpl- лиганды могут применяться для лечения апластических анемий, например, для усиления образования тромбоцитов у больных (скажем, у больных СПИДом или у больных, подвергнутых химиотерапии опухолей). Mpl- лиганд может быть использован для лечения таких нарушений кроветворения, как тромбоцитопения. Mpl-лиганд может стать частью сочетанной терапии больных, перенесших трансплантацию костного мозга. Ими могут быть люди или другие млекопитающие. Mpl-лиганд, полученный от одного биологического вида, может применяться для больных другого биологического вида.

Другим предметом настоящего изобретения является способ лечения других патологических состояний, характеризующихся недостатком тромбоцитов, путем введения больному терапевтически эффективного количества описанного выше фармацевтического препарата. Подобные терапевтические методы могут предусматривать введение одновременно с Mpl-лигандом или последовательно эффективного количества по меньшей мере одного мегакариоцитарного колониестимулирующего фактора, цитокина (например, EPO), растворимого Mpl-рецептора, гематопоэтина, интерлейкина, ростового фактора или антител.

В настоящем изобретении заявлены также антитела (поликлональные, моноклональные, гуманизированные или рекомбинантные), а также фрагменты антител, полученные (т.е. реагирующие) против Mpl- лиганда млекопитающих или его фрагмента. Соответственно, в настоящее изобретение включены клетки, способные секретировать такие антитела (т.е. гибридомы в случае моноклональных антител), методы получения таких антител и их применения в диагностических и терапевтических целях.

Другим предметом настоящего изобретения является способ определения Mpl-лиганда в жидкостях организма. При этом могут быть использованы антитела, специфически распознающие Mpl-лиганд, как в "сэндвич" -варианте, так и сами по себе. Подобный подход может быть использован для определения необходимости введения больному Mpl-лиганда и/или выявления у данного больного недостаточности тромбоцитов. Реагенты для постановки подобных тестов могут быть собраны в набор, включающий положительный и отрицательный контроли, антитела и другие стандартные компоненты таких наборов.

Другие аспекты и преимущества заявленного изобретения станут очевидными из последующего подробного описания вариантов его осуществления.

Многочисленные преимущества настоящего изобретения будут более очевидны при рассмотрении следующих чертежей: Фиг.1 отражает развитие и созревание мегакариоцитов и тромбоцитов.

Фиг.2 показывает, что растворимый мышиный Mpl-рецептор практически полностью подавляет способность плазмы облученных собак ("апластическая собачья" или "АРК9") индуцировать развитие мегакариоцитов. Тест на развитие мегакариоцитов описан в примере 2.

Фиг. 3 показывает, что активность АРК9, обогащенная аффинной хроматографией с лектином и аффинной хроматографией с Mpl- рецептором ("Mpl-лиганд"), стимулирует рост клеток 1А6.1, и что растворимый мышиный Mpl-рецептор блокирует этот рост.

Фиг. 4 приводит обзор этапов очистки 25 кД и 31 кД форм Mpl-рецептора собаки из апластической плазмы собаки.

Фиг.5 показывает очистку Mpl-лиганда обратно-фазовой хроматографией высокого разрешения (RP-HPLC). Во фракции 21 содержится высокоочищенный 31 кД Mpl- лиганд; фракция 22 содержит смесь 31 кд и 25 кД Mpl-лиганда; фракция 23 содержит высокоочищенный 25 кД Mpl-лиганд.

Фиг. 6 показывает сравнение активностей Mpl-лиганда во фракциях, полученных RP-HPLC (колонка C4) и содержащих 25 кД и/или 31 кД белки Mpl-лиганда.

Ф