Олигонуклеотид, способ амплификации нуклеиновой кислоты- мишени и набор для проведения реакции амплификации

Олигонуклеотид, способ амплификации нуклеиновой кислоты- мишени и набор для проведения реакции амплификации

Реферат

 

Описывается олигонуклеотид, имеющий следующее строение: 5' -S₁-N(R)-3' или 5'-S₁-N(R)S₂-3', где S₁ обозначает первую нуклеотидную последовательность, имеющую длину от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов, S₂ обозначает вторую последовательность, имеющую длину от одного до трех нуклеотидов. N обозначает нуклеотид, который содержит пуриновое или пиримидиновое основание, в состав которого входит экзоциклический амин, R обозначает группу-модификатор, причем R ковалентно связан с N через экзоциклический амин и имеет следующую структуру: R₁-C(H)-R₂, где R₁ и R₂ независимо друг от друга обозначают водород, фенильную группу, замещенную фенильную группу. Олигонуклеотид является праймером для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты. Описывается также способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и набор для проведения реакции амплификации. Применение модифицированных праймеров по изобретению позволяет уменьшить неспецифическую амплификацию, прежде всего образование праймерного димера, и/или соответственно увеличить выход требуемого целевого продукта по сравнению с амплификацией, проводимой с немодифицированными праймерами. 3 с. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 12 табл.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и химии нуклеиновых кислот. В частности, оно относится к способам и реагентам, предназначенным для увеличения выхода нуклеиновой кислоты в реакциях амплификации. Следовательно, изобретение может найти применение в любой области, в которой используется амплификация нуклеиновых кислот.

Разработка полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделало возможным амплификацию in vitro последовательностей нуклеиновых кислот. ПЦР описана в патентах США 4683195; 4683202; 4965188; у Saiki и др., 1985, Science 230: 1350-1354; Mullis и др., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273; и у Mullis и Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155: 335-350. В литературе имеются многочисленные данные о совершенствовании и применении ПЦР. Например, широкий спектр связанных с ПЦР проблем представлен в таких изданиях, как PCR Technology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (ред. H.A. Erlich), Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (ред. M.A. Innes и др.,), Academic Press, San Diego; и в PCR Strategies, 1995, (ред. M.A. Innes и др.,), Academic Press, San Diego. Коммерческие поставщики, такие как фирма Perkin Elmer (Norwalk, CT), продают реагенты для ПЦР и публикуют ПЦР-протоколы.

После первых публикаций по амплификации нуклеиновых кислот были описаны различные, основанные на применении праймеров способы амплификации нуклеиновых кислот, которые включают: лигазную реакцию синтеза цепи (Ligase Chain Reaction (LCR), Wu и Wallace, 1989, Genomics 4: 560-569 и Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. США, 88: 189-193); полимеразно-лигазную реакцию синтеза цепи (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1: 5-16); "брешь"-LCR (Gap-LCR) (публикация WO 90/01069); реакцию репарации цепи (публикация EP 439182-A2), 3SR (Kwoh и др., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. США, 86: 1173-1177); Guatelly и др. , 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. США, 87: 1874-1878; публикация PCT WO 92/0880A) и NASBA (патент США 5130238), но не ограничены ими. Обзор систем амплификации был опубликован Abramson и Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41-47.

Специфичность реакций амплификации, основанных на использовании праймеров, зависит от специфичности гибридизации праймера. При повышенных температурах, применяемых при обычной амплификации, праймеры гибридизируются только с требуемой целевой последовательностью, также называемой последовательностью-мишенью. Однако реакционные смеси для амплификации обычно готовят при комнатной температуре, значительно более низкой, чем температура, необходимая для обеспечения специфичности гибридизации праймера. При таких менее жестких условиях праймеры могут неспецифично связываться с другими только частично комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот или с другими праймерами и инициировать синтез нежелательных продуктов удлинения, которые могут быть амплифицированы наряду с последовательностью-мишенью. Амплификация неспецифических продуктов удлинения праймера может конкурировать с амплификацией требуемых последовательностей-мишеней и может в значительной степени снижать эффективность амплификации требуемой последовательности.

Одним из часто встречающихся типов продукта неспецифической амплификации является не зависящий от матрицы артефакт реакций амплификации, обозначенный как "праймерный димер". Праймерный димер представляет собой двухцепочечный фрагмент, длина которого обычно близка сумме длин двух праймеров, и вероятно он образуется при наложении одного праймера на другой. В результате сцепления образуется нежелательная матрица, которая вследствие своей небольшой длины эффективно амплифицируется.

Неспецифическая амплификация может быть снижена путем уменьшения образования продуктов удлинения праймеров до начала реакции. В одном из методов, названном протоколом "hot-start" (протоколом "горячей инициации"), один или несколько важных реагентов не добавляют в реакционную смесь до тех пор, пока температура не поднимется до уровня, достаточного для обеспечения необходимой специфичности гибридизации. Таким образом, в реакционной смеси не может осуществляться удлинение праймера в то время, когда условия реакции не гарантируют специфическую гибридизацию праймера.

Методы "горячей инициации", при которых вручную открывают реакционные пробирки после начальной стадии высокотемпературной инкубации и добавляют недостающие реагенты, являются трудоемкими и увеличивают риск загрязнения реакционной смеси. В альтернативном варианте для разделения или секвестирования реакционных компонентов может быть использован легкоплавкий материал, такой как воск, как описано в патенте США 5411876 и у Chou и др., 1992, Nucl. Acids Res. 20(7): 1717-1723. В этих методах высокая температура инкубации до начала реакции плавит легкоплавкий материал, позволяя, таким образом, реагентам смешиваться.

Другой способ уменьшения образования продуктов удлинения праймеров до начала реакции основан на термообратимом ингибировании ДНК-полимеразы специфическими для ДНК-полимеразы антителами, как описано в патенте США 5338672. Антитела инкубируют с ДНК-полимеразой в буфере при комнатной температуре до составления реакционной смеси с целью обеспечить образование комплекса антитело-ДНК-полимераза. Ингибирование антителом ДНК-полимеразной активности инактивируют путем высокотемпературной инкубации до начала реакции. Недостатком этого метода является то, что получение антител, специфических по отношению к ДНК-полимеразе, особенно в больших количествах, является дорогостоящим и требует значительных затрат времени. Кроме того, добавление антител в реакционную смесь может потребовать повторного планирования реакции амплификации.

Образование продуктов удлинения до начала реакции также можно ингибировать путем добавления в реакционную смесь одноцепочечного связывающего протеина, который нековалентно связывается с праймерами термообратимым образом и, препятствуя гибридизации, ингибирует удлинение праймера.

Неспецифическую амплификацию также можно уменьшить путем ферментативного разложения продуктов удлинения, образованных до начала реакции, с применением способов, описанных в патенте США 5418149. Разложения вновь синтезированных продуктов удлинения достигают путем включения в реакционную смесь дУТФ и урацил-ДНК-гликозилазы (UNG) и инкубации реакционной смеси при 45-60^oC до проведения реакции амплификации. Удлинение праймера приводит к образованию урацилсодержащей ДНК, которая разлагается UNG в условиях, соответствующих таковым до амплификации. Недостатком этого метода является то, что разложение продукта удлинения конкурирует с образованием продукта удлинения, а удаление неспецифического продукта удлинения праймера, вероятно, может оказаться менее полным. Преимуществом этого метода является то, что урацилсодержащая ДНК, попавшая в реакционную смесь в качестве загрязнителя от предыдущей реакции, также разлагается, и, таким образом, метод также позволяет уменьшить проблему загрязнения ПЦР амплифицированными нуклеиновыми кислотами, образовавшимися в предыдущих реакциях.

Обычные методы молекулярной биологии и химии нуклеиновых кислот, известные в данной области техники, достаточно полно описаны в литературе. См., например, Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ред., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames и S. J. Higgins, ред-ы, 1984); и в сериях Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).

Настоящее изобретение относится к ковалентно модифицированным олигонуклеотидным праймерам для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот in vitro. Применение модифицированных праймеров по изобретению позволяет уменьшить неспецифическую амплификацию, прежде всего образование праймерного димера, и/или соответственно увеличить выход требуемого целевого продукта по сравнению с амплификацией, проводимой с немодифицированными праймерами.

Согласно настоящему изобретению предлагается олигонуклеотидный праймер для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, имеющий следующее общее строение: где S₁ обозначает первую нуклеотидную последовательность длиной от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов; S₂ обозначает вторую нуклеотидную последовательность длиной от одного до трех нуклеотидов; N обозначает нуклеотид, который содержит пуриновое или пиримидиновое основание, в состав которого входит экзоциклический амин; R обозначает группу-модификатор, причем R ковалентно связывается с N через экзоциклический амин и R имеет следующую структуру: где R₁ и R₂ независимо друг от друга обозначают водород, C₁-C₁₀алкильную группу, алкоксигруппу, фенильную группу, феноксигруппу, замещенную фенильную группу, нафтильную группу или замещенную нафтильную группу. Алкильные группы могут быть разветвленными или неразветвленными.

В предпочтительном варианте N обозначает модифицированный обычный нуклеотид, т. е. N обозначает модифицированный аденозин, цитидин или гуанозин, причем модифицирующий фрагмент ковалентно присоединен к экзоциклическому амину аденинового, гуанинового или цитозинового основания. В более предпочтительном варианте N обозначает аденозин.

В предпочтительном варианте R обозначает 2-нафтилметильную группу, бензильную группу или замещенную бензильную группу. Предпочтительные замещенные бензильные группы имеют следующую структуру: где R₃ обозначает разветвленную или линейную C₁-C₆алкильную группу, более предпочтительно разветвленную или линейную C₁-C₄алкильную группу, метоксигруппу или нитрогруппу. Предпочтительно R₃ присоединен в пара-положении.

В более предпочтительном варианте R обозначает бензильную, пара-метилбензильную, пара-трет-бутилбензильную, пара-метоксибензильную или 2-нафтилметильную группу.

Согласно изобретению предлагаются также праймеры для амплификации, которые модифицированы путем фотолабильного ковалентного присоединения группы-модификатора, что приводит к частичному или полному ингибированию удлинения праймера. Фотолабильный модификатор может быть присоединен либо к экзоциклическому амину, как в описанных выше модифицированных нуклеотидах, либо к кольцевому азоту. В одном из вариантов по крайней мере одна нитробензильная группа присоединена к экзоциклическому амину аденинового, гуанинового или цитозинового основания 3'-концевого нуклеотида.

Далее, согласно изобретению предлагается пара или набор праймеров, причем по крайней мере один из праймеров модифицирован таким образом, как это описано выше. В предпочтительном варианте оба члена пары праймеров или все члены набора праймеров модифицированы.

Согласно изобретению предлагаются также способы амплификации нуклеиновой кислоты, включающие проведение реакции амплификации с использованием модифицированных праймеров по изобретению.

Далее согласно изобретению предлагаются способы амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, включающие проведение реакции амплификации с использованием фотолабильных модифицированных праймеров по изобретению, причем реакционную смесь облучают светом, достаточным для удаления группы-модификатора и позволяющим образовывать продукты удлинения праймера. В одном из вариантов облучение осуществляют в виде отдельной стадии до начала реакции амплификации, но после того, как реакционная смесь была нагрета до температуры выше приблизительно 50^oC. В другом варианте стадию облучения объединяют с предварительной стадией процесса амплификации, такой как стадия обратной транскрипции в реакции амплификации РНК, или с начальной стадией денатурации в реакции амплификации ДНК.

Согласно изобретению предлагаются также наборы для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот in vitro, при этом такие наборы содержат пару праймеров, из которых по крайней мере один праймер модифицирован таким образом, как это указано в данном описании. Наборы по настоящему изобретению также могут включать один или более реагентов для амплификации, например полимеразу или лигазу нуклеиновой кислоты, нуклеозидтрифосфатазу и соответствующие буферы.

Краткое описание чертежей На фиг. 1 приведены результаты амплификаций РНК ВИЧ-1, проведенных с использованием бензилированных праймеров согласно примеру 5.

На фиг. 2 приведены результаты амплификаций РНК HCV (цитомегаловирус человека), проведенных с использованием бензилированных праймеров согласно примеру 6.

На фиг. 3 приведены результаты амплификаций РНК HCV, проведенных с использованием праймеров, модифицированных одной из трех групп-модификаторов, согласно примеру 7.

На фиг. 4 приведены результаты амплификаций РНК HCV, проведенных с использованием фотолабильных модифицированных праймеров согласно примеру 8.

На фиг. 5 приведены результаты амплификаций ДНК микобактерий, проведенных с использованием праймеров, модифицированных с помощью бензильной группы, и праймеров, модифицированных с помощью пара-трет-бутилбензильной группы, согласно примеру 10.

На фиг. 6 приведена общая реакционная схема, пригодная для синтеза стекла с порами, контролируемыми дезоксиаденозином (dA-CPG), модифицированным бензилом или замещенным бензилом.

Для лучшего понимания изобретения приведены ниже значения некоторых терминов и понятий.

Понятия "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" относятся к полидезоксирибонуклеотидам (содержащим 2-дезокси-D-рибозу), к полирибонуклеотидам (содержащим D-рибозу) и к любому другому типу полинуклеотида, представляющего собой N-гликозид пуринового или пиримидинового основания или модифицированного пуринового или пиримидинового основания. Понятия "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" не подразумевают различия в длине цепи, и эти понятия могут использоваться взаимозаменяемо. Эти понятия относятся только к первичной структуре молекулы. Таким образом, эти понятия включают двух- и одноцепочечную ДНК, а также двух- и одноцепочечную РНК.

Понятие "обычный" по отношению к основаниям нуклеиновой кислоты, нуклеозидам или нуклеотидам обозначает таковые, которые встречаются в естественных условиях в изучаемом полинуклеотиде. Четыре обычные (также называемые "основными") дезоксирибонуклеотида ДНК содержат пуриновые основания аденин и гуанин и пиримидиновые основания цитозин и тимин. Четыре обычные рибонуклеотида РНК содержат пуриновые основания аденин и гуанин и пиримидиновые основания цитозин и урацил. Кроме указанных выше обычных или общих оснований в некоторых нуклеиновых кислотах в небольших количествах встречается целый ряд других пуриновых и пиримидиновых производных, называемых редкими или минорными основаниями. В контексте данного описания понятие "необычный" по отношению к основаниям нуклеиновой кислоты, нуклеозидам или нуклеотидам относится к редким или минорным основаниям нуклеиновой кислоты, нуклеозидам или нуклеотидам и к модификациям, производным или аналогам обычных оснований, нуклеозидов или нуклеотидов и включает синтетические нуклеотиды, имеющие модифицированнные фрагменты оснований и/или модифицированные фрагменты сахара (см. Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, том 26 (Sudhir Agrawal, ред., Humana Press, Totowa, NJ (1994) и Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, ред., IRL Press, Oxford University Press, Oxford).

Олигонуклеотиды могут быть получены любым приемлемым способом, включая, например, клонирование и рестрикцию соответствующих последовательностей и прямой химический синтез с помощью такого метода, как фосфотриэфирный метод, описанный у Narang и др., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99; фосфодиэфирный метод, описанный у Brown и др., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109-151; диэтилфосфорамидитный метод, описанный у Beaucage и др., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; и метод с использованием твердой подложки, описанный в патенте США 4458066. Обзор методов синтеза представлен у Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry, 1(3): 165-187, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Понятие "спаривание оснований", также известное в данной области как "спаривание оснований по Уотсону-Крику", относится к хорошо известному образованию водородных связей между комплементарными парами оснований аденин-тимин и гуанин-цитозин в двухцепочечной молекуле ДНК, аденин-урацил и гуанин-цитозин в гибридной молекуле РНК/ДНК и к аналогичному образованию связей необычных нуклеотидных пар.

Понятие "гибридизация" относится к образованию двойной (дуплексной) структуры в результате спаривания комплементарных оснований двух одноцепочечных нуклеиновых кислот. Гибридизация может происходить между полностью комплементарными цепями нуклеиновых кислот или между "практически комплементарными" цепями нуклеиновых кислот, которые содержат минорные области ошибочного спаривания. Условия, при которых будет происходить гибридизация только полностью комплементарных цепей нуклеиновых кислот, называются "жесткими условиями гибридизации" или "специфическими в отношении последовательности условиями гибридизации". Стабильные дуплексы практически комплементарных последовательностей могут быть получены в менее жестких условиях гибридизации; степень допустимых ошибочных спариваний может контролироваться с помощью соответствующего регулирования условий гибридизации. Специалисты в области технологии нуклеиновых кислот могут определить стабильность дуплекса эмпирически, анализируя различные параметры, в том числе, например, длину и концентрацию пар оснований олигонуклеотидов, ионную силу и частоту ошибочно спаренных пар оснований, следуя руководству в этой области (см., например, Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; и Wetmur, 1991, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol., 26(3/4): 227-259).

Понятие "праймер" относится к олигонуклеотиду, способному действовать в качестве точки инициации синтеза ДНК в таких условиях, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты, т.е. в присутствии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и агента, предназначенного для полимеризации (например, ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы) в соответствующем буфере и при приемлемой температуре. В контексте настоящего изобретения понятие "праймер" включает олигонуклеотиды, используемые в опосредованных лигированием процессах амплификации, в которых один олигонуклеотид "удлиняется" в результате лигирования со вторым олигонуклеотидом, гибридизующимся в соседнем положении. Таким образом, понятие "удлинение праймера", как оно используется в настоящем описании, относится как к синтезу ДНК, происходящему вследствие полимеризации отдельных нуклеозидтрифосфатов с использованием праймера в качестве точки инициации, так и к лигированию двух праймеров с образованием удлиненного праймера.

Предпочтительно праймер представляет собой одноцепочечную ДНК. Приемлемая длина праймера зависит от предполагаемого применения праймера, но обычно составляет от 6 до 50 нуклеотидов. Для праймеров с короткими молекулами обычно требуются более низкие температуры для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Праймер необязательно должен отражать точную последовательность матричной нуклеиновой кислоты, но он должен быть в достаточной степени комплементарным, чтобы гибридизироваться с матрицей. Конструкция приемлемых праймеров для амплификации конкретной последовательности-мишени хорошо известна в данной области техники и описана в литературе, указанной в настоящем описании.

Праймеры могут включать дополнительные элементы, способствующие обнаружению или иммобилизации праймера, но не изменяющие основное свойство праймера, а именно его действие в качестве точки инициации синтеза ДНК. Например, праймеры могут содержать дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты на 5'-конце, которая не гибридизируется с нуклеиновой кислотой-мишенью, но которая облегчает клонирование амплифицированного продукта. Область праймера, комплементарную матрице, которая в достаточной степени обеспечивает гибридизацию с матрицей, в настоящем описании обозначают областью гибридизации.

Понятия "мишень", "последовательность-мишень", "область-мишень" и "нуклеиновая кислота-мишень" относятся к области или подпоследовательности нуклеиновой кислоты, которая должна быть амлифицирована.

Праймер в контексте настоящего описания является "специфическим" по отношению к последовательности-мишени, если число ошибочных спариваний, образующихся при гибридизации последовательности праймера с последовательностью-мишенью, меньше числа ошибочных спариваний, образующихся при гибридизации последовательности праймера с последовательностями, не являющимися мишенями, которые могут присутствовать в образце. Могут быть выбраны такие условия гибридизации, при которых стабильные дуплексы формируются только в тех случаях, если число имеющихся ошибочных спариваний не превосходит число ошибочных спариваний, образующихся при гибридизации последовательности праймера с последовательностью-мишенью. При таких условиях праймер может образовывать стабильный дуплекс только с последовательностью-мишенью. Таким образом, использование праймеров, специфических по отношению к мишени, в приемлемых жестких условиях амплификации дает возможность осуществлять специфическую амплификацию тех последовательностей-мишеней, которые содержат сайты, обусловливающие образование связи между праймерами и мишенью. Использование специфических по отношению к последовательности условий амплификации позволяет осуществлять специфическую амплификацию тех последовательностей-мишеней, которые содержат сайты, связывающиеся со строго комплементарными праймерами.

Понятие "неспецифическая амплификация" относится к амплификации отличных от последовательности-мишени последовательностей нуклеиновых кислот, которые образуются вследствие гибридизации праймеров с последовательностями, отличными от последовательности-мишени, и затем служат субстратом для удлинения праймера. Гибридизация праймера с последовательностью, не являющейся мишенью, рассматривается как "неспецифическая гибридизация" и может осуществляться при менее жестких предреакционных условиях, характеризующихся более низкой температурой.

Понятие "праймерный димер" относится к не зависящему от матрицы продукту неспецифической амплификации, который образуется в результате удлинения праймера, когда в качестве матрицы служит другой праймер. Хотя праймерный димер, по-видимому, часто является конкатемером двух праймеров, т.е. димером, также могут образовываться конкатемеры более двух праймеров. Понятие "праймерный димер" в настоящем описании используется для общего обозначения не зависящего от матрицы продукта неспецифической амплификации.

Понятие "реакционная смесь" относится к раствору, содержащему реагенты, необходимые для проведения данной реакции. Понятие "реакционная смесь для амплификации" относится к раствору, содержащему реагенты, необходимые для проведения реакции амплификации, при этом такая смесь обычно содержит олигонуклеотидные праймеры и ДНК-полимеразу или лигазу в приемлемом буфере. "Реакционная смесь для ПЦР" обычно содержит олигонуклеотидные праймеры, термостабильную ДНК-полимеразу, дНТФ и двухвалентный катион металла в приемлемом буфере. Реакционную смесь рассматривают как полную, если она содержит все реагенты, необходимые для проведения реакции, и как неполную, если она содержит только часть набора необходимых реагентов. Для специалиста в данной области техники очевидно, что для удобства, стабильности при хранении или для обеспечения регулирования концентрации компонентов в зависимости от применения компоненты реакции обычно хранят в виде отдельных растворов, каждый из которых содержит часть полного набора компонентов, а затем реакционные компоненты объединяют перед реакцией с получением полной реакционной смеси. Кроме того, для специалиста в данной области техники очевидно, что для продажи реакционные компоненты упаковывают по отдельности и что пригодные коммерческие наборы могут содержать любую часть полного набора реакционных компонентов, включающую модифицированные праймеры по настоящему изобретению.

Модифицированные праймеры Праймеры для амплификации по изобретению модифицируют путем ковалентного присоединения группы к одному из четырех нуклеотидов на 3'-конце праймера. В одном из вариантов модифицированный праймер по изобретению состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей следующее общее строение: где S₁ обозначает первую нуклеотидную последовательность длиной от приблизительно 5 до приблизительно 50 нуклеотидов; S₂ обозначает вторую нуклеотидную последовательность длиной от одного до трех нуклеотидов; N обозначает нуклеотид, который содержит пуриновое или пиримидиновое основание, в состав которого входит экзоциклический амин; R обозначает группу-модификатор, причем R ковалентно связывается с N через экзоциклический амин и R имеет приведенную ниже структуру.

Как описано в примерах, модифицирующий эффект является максимальным, когда модификация затрагивает 3'-концевой нуклеотид. Таким образом, предпочтительно праймер имеет модифицированный 3'-концевой нуклеотид.

Подлежащий модификации нуклеотид выбирают из таковых, у которых основание содержит экзоциклический амин, участвующий в спаривании основания нуклеотида с комплементарным ему нуклеотидом. Обычно праймерами являются ДНК, состоящие только из обычных нуклеотидов. Из четырех обычных оснований нуклеотидов, присущих ДНК, аденин, гуанин и цитозин содержат экзоциклический первичный амин, который участвует в спаривании основания с комплементарным ему основанием. В предпочтительном варианте осуществления изобретения праймер модифицируют путем присоединения одной группы-модификатора к экзоциклическому амину, замещая один из двух атомов водорода аминной группы, который в немодифицированном основании может участвовать в спаривании оснований. Строения модифицированных нуклеотидов, содержащих модифицированное адениновое, гуаниновое и цитозиновое основание соответственно, приведены ниже: где S обозначает фрагмент сахара, а R обозначает группу-модификатор.

Настоящее изобретение не ограничено праймерами, состоящими из обычных нуклеотидов. Любой нуклеотидный аналог, в котором фрагмент основания содержит экзоциклический первичный амин, который участвует в спаривании основания с комплементарным основанием, может быть модифицирован в соответствии с настоящим описанием. Примеры необычных нуклеотидов включают 3-метиладенин, 7-метилгуанин, 3-метилгуанин, 5-метилцитозин и 5 гидроксиметилцитозин.

Группа-модификатор ограничивает способность модифицированного основания участвовать в образовании водородной связи, поскольку модификатор замещает один атом водорода. Оставшийся атом водорода еще сохраняет способность участвовать в образовании водородной связи. Таким образом, модификаторы могут оказывать воздействие как на кинетику, так и на термодинамику гибридизации. Изобретение включает различные группы-модификаторы, обладающие следующими свойствами, заключающимися в их способности: 1. оказывать воздействие на спаривание модифицированного основания с комплементарным основанием (спаривание оснований по Уотсону-Крику), но не препятствовать ему; 2. оказывать воздействие на удлинение модифицированного праймера, но не препятствовать ему; и 3. позволять осуществлять синтез цепи, комплементарной продукту удлинения модифицированного праймера.

Группа-модификатор оказывает стерическое воздействие на спаривание оснований и, следовательно, на удлинение праймера. Таким образом, физический объем модификатора влияет на степень его воздействия на гибридизацию. Когда модифицированный аденозиновый или цитидиновый нуклеотид включают в двухцепочечную нуклеиновую кислоту, группа-модификатор вдается в центральное пространство большой бороздки. Следовательно, даже относительно крупные группы-модификаторы должны вызывать лишь небольшие стерические нарушения в строении дуплекса. Однако пригодные модификаторы не являются настолько крупными, чтобы препятствовать образованию водородной связи или предотвращать ферментативное удлинение 3'-гидроксильной группы праймера. Когда модифицированный гуанозиновый нуклеотид включают в двухцепочечную нуклеиновую кислоту, группа-модификатор вдается в малую бороздку, которая не имеет достаточного пространства для размещения всего объема группы-модификатора. Следовательно, для присоединения к гуаниновому основанию предпочтительны более мелкие группы-модификаторы.

Продукты удлинения праймеров, которые используются в качестве матриц в последующих циклах амплификации, содержат модифицированное основание, включенное с помощью праймера. Группу-модификатор выбирают таким образом, чтобы наличие модифицированного основания в матрице не вызывало терминацию удлинения праймера или не приводило к ингибированию удлинения праймера. Предпочтительно строение группы-модификатора не должно приводить к увеличению количества случаев мутагенеза, при котором происходит потеря идентичности модифицированного основания при репликации полученной с помощью праймера матрицы. Воздействие модифицированного основания на матрицу или на продукт удлинения праймера можно оценить общепринятыми методами, следуя руководствам, указанным в настоящем описании и известным в данной области техники (см., например, Gniazdowski и Cera, 1996, Chem. Rev. 96: 619-634).

Группы-модификаторы R, удовлетворяющие вышеуказанным требованиям, имеют следующую структуру: где R₁ и R₂ независимо друг от друга обозначают водород, C₁-C₁₀алкильную группу, алкоксигруппу, фенильную группу, феноксигруппу, замещенную фенильную группу, нафтильную группу или замещенную нафтильную группу. Алкильные группы могут быть разветвленными или линейными. Также могут использоваться алкильные группы с большим числом атомов, по крайней мере до C₂₀.

В предпочтительном варианте R обозначает 2-нафтилметильную группу, бензильную группу или замещенную бензильную группу. Предпочтительные замещенные бензильные группы имеют следующее строение: где R₃ обозначает разветвленную или линейную C₁-C₆алкильную группу, более предпочтительно разветвленную или линейную C₁-C₄алкильную группу, метоксигруппу или нитрогруппу. Разветвленная или линейная C₁-C₄алкильная группа представляет собой метил, этил, пропил, бутил, изопропил, изобутил, трет-бутил и т.п. Предпочтительными алкильными группами являются метил и трет-бутил. Предпочтительно R₃ присоединен в пара-положении.

Особенно предпочтительные группы-модификаторы R приведены ниже: Ряд конкретных групп-модификаторов приведен в примерах. В целом эмпирический отбор конкретной пригодной группы-модификатора из указанного класса соединений может быть осуществлен специалистом в данной области техники общепринятым способом, следуя руководству, представленному в настоящем описании. Предпочтительно пригодность конкретной группы определяют эмпирически, используя модифицированные праймеры в реакции амплификации. Успешная амплификация свидетельствует о том, что модифицированное основание не полностью ингибирует удлинение праймера, а также о том, что присутствие модифицированного основания в полученной с помощью праймера матрице не приводит к прекращению удлинения праймера. Редукцию праймерного димера определяют по описанной в примерах методике.

Праймеры с фотолабильной модификацией В альтернативном варианте осуществления изобретения праймеры модифицируют с помощью одной или нескольких фотолабильных групп, которые могут быть удалены при экспозиции светом после того, как в реакции были достигнуты высокотемпературные реакционные условия, гарантирующие ее специфичность. Поскольку модификатор удаляют до удлинения праймера, не требуется, чтобы модифицированный праймер обладал способностью к удлинению до удаления группы. Примеры фотолабильных модификаторов, которые могут быть использованы в способах по настоящему изобретению, описаны у Pillai, 1980 "Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis", Synthesis: 1-26.

Предпочтительно фотолабильные праймеры по изобретению модифицируют на 3'-концевом нуклеотиде, присоединяя одну или две орто-нитробензильные группы: В праймерах, модифицированных путем присоединения одной нитробензильной группы к экзоциклическому первичному амину фрагмента основания, образовавшийся вторичный амин еще сохраняет способность участвовать в спаривании оснований, если аминная группа повернута таким образом, что сохранившийся атом водорода ориентирован по направлению к комплементарному основанию. Как описано в примерах, эти праймеры могут применяться при амплификации либо после удаления модификатора облучением ультрафиолетовым светом, либо без его удаления.

Праймеры, модифицированные путем присоединения двух нитробензильных групп к экзоциклическому амину основания, не могут удлиняться. Ингибирование в основном происходит из-за неспособности модифицированного основания участвовать в спаривании оснований, а этому препятствует то, что оба водорода экзогенного амина замещены объемистыми нитробензильными группами. Применение праймеров, модифицированных двумя нитробензильными группами, при амплификации, когда реакционную смесь облучают ультрафиолетовым светом в течение периода времени, достаточного для удаления нитробензильных групп, тем самым давая возможность протекать реакции удлинения праймера, описано в примерах.

В другом варианте осуществления группу-модификатор присоединяют к кольцевому атому азота. Праймеры, модифицированные присоединением нитробензильной группы к кольцевому атому азота основания, не могут удлиняться вследствие неспособности модифицированного основания подвергаться спариванию оснований. Удаление нитробензильных групп облучением ультрафиолетовым светом дает возможность протекать реакции удлинения праймера.

Применение фотолабильных праймеров, которые не могут удлиняться до тех пор, пока не удалена группа-модификатор, практически позволяет осуществить амплификацию методом "горячей инициации". Удлинение праймера ингибируют во время неспецифических предшествующих реакции условий. Реакционную смесь облучают и праймеры разблокируют только после того, как температура реакции была поднята до температуры, которая гарантирует специфичность реакции.

Синтез модифицированных праймеров Синтез модифицированных праймеров проводят с использованием стандартных химических способов, хорошо известных в данной области. Способы введения этих модификаторов могут быть подразделены на четыре класса: 1. модификатор может быть введен путем применения мо