Реконструированные человеческие антитела к человеческому интерлейкину-8

Реконструированные человеческие антитела к человеческому интерлейкину-8

Реферат

 

Изобретение касается реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8. Большая часть реконструированного антитела происходит из человеческого антитела, a CDR обладает низкой антигенностью для человека. Реконструированное человеческое антитело кодируется ДНК-последовательностью, входящей в вектор экспрессии. Реконструированные человеческие антитела данного изобретения обладают низкой антигенностью для людей и поэтому они могут применяться для терапии в медицине. 11 с. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл.

Изобретение относится к определяющим комплементарность областям (CDR, гипервариабельным участкам) и вариабельным областям (V-участкам) мышиных моноклональных антител к человеческому интерлейкину-8 (ИЛ-8), к человеко/мышиным химерным антителам к человеческому ИЛ-8, а также к реконструированным человеческим антителам, причем области, определяющие комплементарность вариабельной области человеческой легкой цепи (L-цепи) и вариабельной области тяжелой цепи (H-цепи) человека замещены CDR мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8. Кроме того, данное изобретение представляет ДНК, которая кодирует вышеупомянутое антитело и его части. Данное изобретение также относится к вектору, который содержит вышеупомянутую ДНК, и более конкретно, экспрессии вектора и клетке-хозяину, трансформированной указанным вектором. Кроме того, данное изобретение представляет процесс получения реконструированного человеческого антитела к ИЛ-8, а также к процессу получения химерных антител к человеческому ИЛ-8.

Интерлейкин-8 (ИЛ-8) был открыт в культуре супернатанта моноцитов, стимулированных липополисахаридом (ЛПС), и является хемокином, известным так же как продуцируемый моноцитами фактор хемотаксиса нейтрофилов (ПМФХН) или активирующий нейтрофилы протеин-1 (АНП-1). ИЛ-8 продуцируется разными клетками, действует на нейтрофильные гранулоциты и лимфоциты и обладает активностью, которая вызывает хемотаксис по градиенту его концентрации. К тому же он не только индуцирует хемотаксис у нейтрофилов, но также активирует функции нейтрофилов, такие как дегрануляция, выделение пероксидов и усиление адгезии на эндотелиальных клетках.

При воспалительных заболеваниях, и более конкретно, при респираторных заболеваниях, таких как легочный муковисцидоз, идиопатический легочный фиброз, респираторный дистресс-синдром взрослых, саркоидоз и эмпиема, а также при кожных заболеваниях, таких как псориаз, и при хроническом ревматоидном артрите, болезни Крона и язвенном колите, наблюдается патологическая инфильтрация лейкоцитов в месте воспаления при этих заболеваниях. Кроме того, ИЛ-8 обнаруживается в исследуемых пробах от пациентов с этими заболеваниями, что наводит на мысль о том, что ИЛ-8 может играть центральную роль в воспалении (McElvaney, N.G. et al., J. Clin. Invest., 90, 1296-1301, 1992; Lynch III, J. P. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 145, 1433-1439, 1992; Donnelly, S. C. et al., Lancet, 341, 643-647, 1993; Car, B.D. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Mеd., 149, 655-659, 1994; Antony, V.В. et al., J. Immunol. , 151, 7216-7223, 1993; Takematsu, H. et al., Arch. Denmatol., 129, 74-80, 1993; Brennan, F.M. et al., Eur. J. Immunol., 20, 2141- 2144, 1990; Izzo, R. S. et al., Scand. J. Gastroenterol., 28, 296-300, 1993; Izzo, R.S. et al., Am. J. Gastroenterol., 87, 1447-1452, 1992).

Вслед за иммунизацией мышей человеческим ИЛ-8 в качестве антигена Ко Y-C., et al. получили мышиные моноклональные антитела WS-4, которые связываются с человеческим ИЛ-8 и подавляют связывание человеческого ИЛ-8 с нейтрофилами в результате этого связывания, и именно это нейтрализует биологическую активность, которой обладает ИЛ-8. Было четко показано, что изотопы мышиных моноклональных антител WS-4 состоят из к-типа L цепи и C1-типа H цепи (J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992).

Известные примеры антител к человеческому ИЛ-8, кроме WS-4, включают А. 5.12.14 (Boylan, A.M. et al., J. Clin. Invest., 89, 1257-1267, 1992), антитела анти-Рер-1 и антитела анти-Рер-3, раскрытые в международных патентных заявках N WO 92-04372 и DM/C7 (Mulligan, M.S. et al., J. Immunol., 150, 5585-5595, 1993).

Было также обнаружено с помощью введения мышиных моноклональных антител WS-4 на экспериментальной модели с использованием кроликов, что инфильтрация нейтрофилов подавляется при ишемическом и реперфузионном поражении легких (Sekido N., et al., Nature, 365, 654-657, 1993), индуцируемом ЛПС дерматите (Harada A. , et al., Internatl. Immunol., 5, 681-690, 1993) и индуцируемом ЛПС или интерлейкином-1 (ИЛ-1) артрите (Akahoshi Т., et al., Lymphokine Cytoline Res., 13, 113-116, 1994).

Гомолог человеческого ИЛ-8 существует у кроликов и называется кроличьим ИЛ-8. Так как было четко показано, что мышиные моноклональные антитела WS-4 перекрестно реагируют с кроличьим ИЛ-8, и что антитела подавляют связывание кроличьего ИЛ-8 с кроличьими нейтрофилами (Harada А., et al., Internatl. Immunol., 5, 681-690, 1993), эти данные наводят на мысль о том, что антитела к человеческому ИЛ-8 должны быть полезны в качестве терапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний у людей.

Моноклональные антитела, происходящие от других млекопитающих, а не от человека, проявляют высокую степень иммуногенности (также называемую антигенностью) у людей. По этой причине даже если мышиные антитела вводятся людям, в результате того, что они метаболизируются как чужеродное вещество, период полувыведения мышиных антител у людей относительно короток, что таким образом предотвращает соответствующее проявление нежелательных эффектов. Кроме того, человеческие антимышиные антитела, которые продуцируются в ответ на введенные мышиные антитела, вызывают иммунный ответ, который некомфортабелен и опасен для больного, примеры чего включают сывороточную болезнь и другие аллергические реакции. По этой причине мышиные антитела нельзя часто вводить людям.

Чтобы разрешить эти проблемы, был разработан процесс получения очеловеченного антитела. Мышиные антитела могут быть очеловечены двумя способами. Более простой способ включает продукцию химерных антител, у которых вариабельная область (V область) происходит из исходного мышиного моноклонального антитела, а константная область (С область) происходит из подходящего человеческого антитела. Так как получающиеся в результате химерные антитела содержат вариабельную область мышиного антитела в ее полной форме, они обладают специфичностью, идентичной специфичности исходных мышиных антител, и можно ожидать, что они будут связывать антиген.

Кроме того, так как пропорция протеиновых последовательностей, происходящих от другого животного, а не человека, в химерных антителах существенно снижена по сравнению с исходными мышиными антителами, предсказывается, что они обладают меньшей иммуногенностью по сравнению с исходными мышиными антителами. Хотя химерные антитела хорошо связываются с антигеном и обладают низкой иммуногенностью, однако все еще остается возможность появления иммунного ответа на мышиную вариабельную область (LoBuglio A.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).

Хотя второй способ очеловечивания мышиных антител более сложен, латентная иммуногенность мышиных антител снижается значительно. При этом способе только гипервариабельная область (CDR) пересаживается из вариабельной области мышиных антител в человеческую вариабельную область для создания реконструированной человеческой вариабельной области. Однако, чтобы еще больше приблизить строение CDR реконструированной человеческой вариабельной области к строению исходного мышиного антитела, бывают обстоятельства, при которых может быть необходимо пересадить часть протеиновой последовательности структурной области (FR), несущей CDR из вариабельной области мышиного антитела, на человеческую вариабельную область.

Затем эти реконструированные человеческие вариабельные области связываются с человеческой константной областью. Эти части, происходящие из нечеловеческих протеиновых последовательностей, состоят в очеловеченном антителе только из CDR и очень незначительной части CO. CDR состоит из гипервариабельных протеиновых последовательностей, и они не проявляют видовой специфичности. По этой причине реконструированные человеческие антитела, которые содержат мышиные CDR, не должны обладать иммуногенностью, большей, чем иммуногенность природных человеческих антител, содержащих человеческие CDR.

Дополнительные детали, касающиеся реконструированных человеческих антител, можно найти, обратившись к Riechmann L., et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeyen M., et al., 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, С.-A. et al. Protein Eng. , 4, 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Hum. Antibodies Hybridomas, 2, 124-134, 1991; Gorman, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; and, Sato, К. et al., Cancer Res. , 53, 851-856, 1993.

Как изложено выше, хотя реконструированные человеческие антитела, как предсказано, будут применимы в целях терапии, неизвестны реконструированные человеческие антитела к человеческому ИЛ-8. Кроме того, не существует стандартных процессов, которые могут универсально применяться в отношении произвольных антител для получения реконструированных человеческих антител. Таким образом, необходимы различные ухищрения для того, чтобы создать реконструированные человеческие антитела, которые проявляют достаточную связывающую активность и/или нейтрализующую активность в отношении конкретного антигена (например, Sato К., et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1933). Данное изобретение представляет антитела к человеческому ИЛ-8, обладающие низкой степенью иммуногенности.

Данное изобретение представляет реконструированные человеческие антитела к человеческому ИЛ-8. Данное изобретение также представляет человеческо/мышиные химерные антитела, которые применимы в процессе продукции указанных человеческих антител. Кроме того, данное изобретение также представляет фрагмент реконструированного человеческого антитела. Дополнительно данное изобретение представляет систему экспрессии для продукции химерных антител и реконструированных человеческих антител и их фрагментов. Кроме того, данное изобретение также представляет процесс получения химерных антител к человеческому ИЛ-8 и их фрагментов, а также процесс получения реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8 и их фрагментов.

Более конкретно, данное изобретение представляет: 1) V область L цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8 и 2) V область H цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение представляет: 1) L цепь, содержащую С область человеческой L цепи и V область L цепи мышиного моноклонального антитела к ИЛ-8 и 2) H цепь, содержащую С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет химерные антитела к человеческому ИЛ-8, состоящие из: 1) L цепей, причем каждая включает человеческую С область L цепи и V область L цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8 и 2) H цепей, причем каждая содержит С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиного моноклонального антитела к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение представляет: 1) V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8 и 2) V область H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет: 1) L цепь, содержащую С область человеческой L цепи и V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8 и 2) H цепь, содержащую С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.

Дополнительно данное изобретение представляет химерные антитела к человеческому ИЛ-8, состоящие из: 1) L цепей, причем каждая включает С область человеческой L цепи и V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8 и 2) H цепей, причем каждая включает С область человеческой H цепи и V область H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение представляет: 1) CDR V области L цепи моноклональных антител к человеческому ИЛ-8 и 2) CDR V области H цепи моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет: 1) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8 и 2) CDR V области H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет реконструированную V область человеческой L цепи антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из: 1) структурных областей (FR) V области человеческой L цепи и 2) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8; а также как реконструированную V область H цепи антител к человеческому ИЛ-8, состоящую из: 1) FR V области H цепи и 2) CDR V области H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение представляет реконструированную человеческую L цепь антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из: 1) С области человеческой L цепи и 2) V области L цепи, состоящей из FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8; а также в виде реконструированной H цепи антитела к человеческому ИЛ-8, состоящей из: 1) C области человеческой H цепи и 2) V области H цепи, состоящей из FR человеческой H цепи и CDR H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение также представляет реконструированное человеческое антитело к человеческому ИЛ-8, состоящее из: (A) L цепей, причем каждая включает: 1) человеческую С область L цепи и 2) V область L цепи, содержащую FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8; а также (Б) H цепей, причем каждая включает: 1) человеческую С область H цепи и 2) V область H цепи, содержащую FR человеческой H цепи и CDR H цепи мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8.

Более конкретно, данное изобретение представляет: 1) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8, имеющие следующие последовательности или их часть: CDR1: Arg Ala Ser Glu Ile Ile Туг Ser Туг Leu Ala CDR2: Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp CDR3: Gin His His Phe Gly Phe Pro Arg Thr а также 2) CDR V области H цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8, имеющие следующие последовательности или их часть: CDR1: Asp Туг Туг Leu Ser CDR2: Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Arg Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly CDR3: Glu Asn Tyr Arg Tyr Asp Val Glu Leu Ala Tyr Кроме того, данное изобретение представляет реконструированную V область L цепи антитела к человеческому ИЛ-8, включающую: 1) структурные участки (FR) V области L цепи и 2) CDR V области L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8; а также реконструированную V область человеческой H цепи антител к человеческому ИЛ-8, состоящую из: 1) FR V области H цепи; и 2) CDR V области H цепи моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.

Кроме того, данное изобретение представляет реконструированную человеческую L цепь антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из: 1) человеческой С области L цепи и 2) V области L цепи, состоящей из FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8; а также реконструированную человеческую H цепь антитела к человеческому ИЛ-8, состоящую из: 1) человеческой С области H цепи и 2) V области H цепи, включающей FR человеческой H цепи и CDR H цепи моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8.

К тому же данное изобретение также представляет реконструированное человеческое антитело к человеческому ИЛ-8, состоящее из (A) L цепей, причем каждая включает: 1) С область человеческой L цепи и 2) V область L цепи, состоящую из FR человеческой L цепи и CDR L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 к человеческому ИЛ-8, и (Б) H цепей, причем каждая включает: 1) С область H цепи и 2) V область H цепи, состоящую из FR человеческой H цепи и CDR H цепи мышиного моноклонального антитела WS-4 к человеческому ИЛ-8.

Примеры вышеупомянутых FR человеческой L цепи включают такие, которые имеют аминокислотные последовательности A или их часть, представленные в конце описания.

Примеры вышеупомянутых FR человеческой H цепи включают те, которые имеют аминокислотные последовательности Б или их часть, представленные в конце описания.

Дополнительно данное изобретение также касается ДНК, которая кодирует полипептид, включенный в вышеуказанные различные антитела, и ее фрагментов. Данное изобретение также относится к вектору, который содержит вышеупомянутую ДНК, примером которого является вектор экспрессии. Кроме того, данное изобретение представляет собой клетку-хозяина, которая трансформируется вышеупомянутым вектором.

Кроме того, данное изобретение также представляет процесс получения химерных антител к человеческому ИЛ-8 и его фрагментов, а также процесс получения реконструированных человеческих антител к человеческому ИЛ-8 и их фрагментов.

Фиг. 1 показывает векторы экспрессии HEF-VL-gк и HEF-VH-g1, содержащие промотор/энхансер человеческого фактора элонгации 1(HEF-1), которые применимы для экспрессии L цепи и H цепи, соответственно, антител данного изобретения.

Фиг. 2 является графиком, показывающим результаты ELISA по подтверждению способности связывания с человеческим ИЛ-8 химерного антитела WS-4 (chL/chH) данного изобретения, секретируемого в культуральную среду клетками COS.

Фиг. 3 является диаграммой конструирования ДНК, которая кодирует аминокислотные последовательности каждого из первой версии "a" (RVHa) V области H цепи реконструированного человеческого антитела WS-4 данного изобретения (А) и первой версии "a" (RVLa) V области L цепи реконструированного человеческого антитела WS-4 (В).

Фиг. 4 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 V области L цепи (RVLa) и V области H цепи (RVHa) реконструированных человеческих антител WS-4 данного изобретения в комбинации с, соответственно, V областью H цепи химерных антител WS-4 (chH) и V областью L цепи химерных антител WS-4 (chL), экспрессируемых в клетках COS, со способностью связывания химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения, секретируемых в культуральную среду клеток COS.

Фиг. 5 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 8 типов реконструированных человеческих антител WS-4, содержащих RVLa данного изобретения (RVLa/RVHa, RVLa/RVHb, RVLa/RVHc, RVLa/RVHd, RVLa/RVHe, RVLa/RVHf, RVLa/RVHg и RVLa/RVHh), секретируемых в культуральную среду клеток COS.

Фиг. 6 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 8 типов реконструированных человеческих антител WS-4, содержащих вторую версию RVLb данного изобретения (RVLb/RVHa, RVLb/RVHb, RVLb/RVRc, RVLb/RVHe, RVLb/RVHf, RVLb/RVHg и RVLb/RVHh), продуцируемых в культуральный супернатант клеток COS, со способностью связывания химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения, секретируемых в культуральную среду клеток COS.

Фиг. 7 является графиком, показывающим результаты ELISA по сравнению способности связывания с человеческим ИЛ-8 очищенных реконструированных человеческих антител WS-4 RVLa/RVHg и RVLb/RVHg данного изобретения и очищенных химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения.

Фиг. 8 является графиком, показывающим результаты исследований подавления связывания лигандных рецепторов по сравнению способности подавлять связывание ИЛ-8 с рецепторами к ИЛ-8 очищенных реконструированных человеческих антител RVLa/RVHg и RVLb/RVHg данного изобретения со способностью подавления связывания мышиных антител WS-4 и химерных антител WS-4 (chL/chH) данного изобретения.

Клонирование ДНК, кодирующей мышиную V область Чтобы клонировать ген, который кодирует V область мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8, необходимо получить гибридому, которая продуцирует мышиные моноклональные антитела к человеческому ИЛ-8, для получения такого гена. После извлечения мРНК из гибридомы мРНК превращали в однонитевую кДНК известными методами с последующей амплификацией целевой ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения гена. Примером источника этого гена является гибридома WS-4, которая продуцирует мышиные моноклональные антитела к человеческому ИЛ-8, полученному Ко Y.C., et al. Процесс получения этой гибридомы описан в J. Immunol. Methods, 149, 227-235, 1992, и далее описан в качестве справочного примера 1.

1) Извлечение всей ДНК Для клонирования целевой ДНК, которая кодирует V область мышиных моноклональных антител к ИЛ-8, всю РНК можно получить путем разрушения клеток гибридомы с помощью обработки тиоцианатом гуанидина и проведения центрифугирования в градиенте плотности на основе хлорида цезия (Chirgwin J.M., et al. , Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979). Кроме того, можно также использовать другие методы, которые применяются при клонировании генов, такие как те, при которых производятся обработка детергентом и обработка фенолом в присутствии ингибитора рибонуклеазы (РНКазы), такого, как ванадиевый комплекс (Berger S. L., et al., Biochemistry, 18, 5143-5149, 1979).

2) Синтез кДНК Затем можно получить однонитевую кДНК, комплементарную мРНК путем обработки всей РНК обратной транскриптазой с использованием олиго(dТ), олигонуклеотида, комплементарного поли(А)-хвосту, расположенному на 3' конце мРНК, в качестве праймера и мРНК, содержащейся во всей РНК, полученной вышеописанным способом, в качестве матрицы (Larrick J. W., et al., Bio/Technology, 7, 934-938, 1989). Дополнительно можно также в то же время использовать случайный праймер. Кроме того, в случае, когда желательно сначала выделить мРНК, это может быть сделано путем нанесения всей РНК на колонку олиго(dТ)-целлюлозы, с которой связан поли(А)-хвост мРНК.

3) Амплификация ДНК, кодирующей V область, с помощью полимеразной цепной реакции.

Затем кДНК, которая кодирует вышеназванную область, специфично амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для амплификации V области L цепи (к) типа мышиных моноклональных антител используются 11 типов олигонуклеотидных праймеров, показанных в ПОСЛ ИД NN 1-11 (мышиная каппа вариабельная; МКВ) и олигонуклеотидный праймер, показанный в ПОСЛ ИД N 12 (мышиный каппа константный; МКК) в качестве 5' концевого праймера и 3' концевого праймера, соответственно. Вышеупомянутые праймеры МКВ гибридизуются с последовательностью ДНК, которая кодирует мышиную лидерную последовательность L цепи каппа-типа.

Для амплификации V области H цепи мышиных моноклональных антител используются 12 типов олигнуклеотидных праймеров, показанные в ПОСЛ ИД NN 13-24 (мышиные тяжелые вариабельные; МТВ) и олигонуклеотидный праймер, показанный в ПОСЛ ИД N 25 (мышиная тяжелая константная; МТК), в качестве 5' концевого праймера и 3' концевого праймера, соответственно. Вышеупомянутые МТB праймеры гибридизуются с последовательностью ДНК, которая кодирует мышиную С область H цепи.

Кроме того, все 5' концевые праймеры (МКВ и МТВ) содержат последовательность GTCGAC, которая создает сайт расщепления рестрикционным ферментом SalI около 3' конца, тогда как оба 3' концевых праймера (МКК и МТК) содержат нуклеотидную последовательность CCCGGG, которая создает сайт расщепления рестрикционным ферментом XmaI вблизи 5' конца. Эти сайты расщепления рестрикционным ферментом используются для субклонирования целевых фрагментов ДНК, которые кодируют обе V области, в соответствующие векторы клонирования. В случае, когда эти сайты расщепления рестрикционными ферментами присутствуют также в целевой последовательности ДНК, которая кодирует обе V области, должны использоваться другие сайты расщепления рестрикционными ферментами для субклонирования в соответствующие клонирующие векторы.

4) Выделение ДНК, кодирующей V область Затем, чтобы получить фрагмент ДНК, который кодирует целевую V область мышиного моноклонального антитела, продукты амплификации ПЦР разделяют и очищают в агарозном геле с низкой температурой плавления или на колонке [набор для очистки продуктов ПЦР (QIAGEN PCR Purification Spin Kit: QIAGEN); набор для очистки ДНК (GENECLEAN II, BIO 101). Фрагмент ДНК, который кодирует целевую V область мышиных моноклональных антител, получают путем ферментативной обработки очищенного продукта амплификации рестрикционными ферментами SalI и XmaI.

Далее с помощью расщепления подходящего клонирующего вектора, такого как плазмида pUC19 теми же самыми рестрикционными ферментами, SalI и XmaI, и ферментативного связывания вышеупомянутого фрагмента ДНК с этой pUC19 получают плазмиду, которая содержит фрагмент ДНК, который кодирует целевую V область мышиных моноклональных антител. Определение последовательности клонированной ДНК может быть выполнено обычным методом, примером чего является использование автоматического секвенатора ДНК (Applied Biosystems). Клонирование и определение последовательности целевой ДНК описаны детально в примерах 1 и 2.

Гипервариабельные участки (CDR) Данное изобретение также представляет гипервариабельный участок или определяющую комплементарность область (CDR) вариабельной области мышиных моноклональных антител к человеческому ИЛ-8. V области как L цепи, так и H цепи этих антител образуют связывающий антиген сайт. Эти области на L цепи и H цепи имеют сходную основную структуру. V области обоих цепей содержат четыре структурные области, у которых последовательность является относительно консервативной, и эти четыре структурные области связаны с помощью трех гипервариабельных участков или CDR (Kabat Е.А. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1991).

Большинство частей вышеупомянутых четырех структурных областей (FR) имеют -пластинчатую структуру, и три CDR образуют петли. CDR могут в некоторых случаях образовывать часть -пластинчатую структуру. Три CDR поддерживаются трехмерно в чрезвычайно близких положениях с помощью FR и принимают участие в образовании связывающего антиген сайта вместе с тремя спаренными CDR. Данное изобретение представляет CDR, которые применимы в качестве компонентов очеловеченных антител, а также ДНК, которая кодирует их. Эти CDR можно определить по экспериментальным правилам Kabat Е.А. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", путем сравнения последовательностей V области с известными аминокислотными последовательностями V области, детальное объяснение чего представлено в осуществлении 3.

Получение химерных антител Перед созданием реконструированной человеческой V области антитела к человеческому ИЛ-8 необходимо подтвердить, образуют ли действительно используемые CDR связывающую антиген область. С этой целью были получены химерные антитела. Чтобы получить химерные антитела, необходимо сконструировать ДНК, которая кодирует L цепь и H цепь химерного антитела. Основной метод конструирования обеих ДНК включает связывание соответствующих последовательностей ДНК мышиной лидерной последовательности, присутствующей в ПЦР-клонированной ДНК, и последовательности мышиной V области с последовательностью ДНК, которая кодирует человеческую С область, уже присутствующей в векторе экспрессии для клетки млекопитающего.

Вышеупомянутые С области человеческого антитела могут быть любыми С областями L цепи и любыми С областями H цепи, и что касается L цепи, примеры включают Cк или С человеческой L цепи, тогда как, что касается H цепи, если это IgG, примеры включают C1, C2, C3 или C4 (Ellison J. et al., DNA, 1, 11-18 (1981), Takahashi N. Et al., Cell, 29, 671-679 (1982), Krawinkel U. Et al., EMBO J., 1, 403-407 (1982)) или другие изотипы.

Получены два типа векторов экспрессии для продукции химерных антител, а именно вектор экспрессии, который содержит ДНК, кодирующую V область мышиной L цепи и С область человеческой L цепи под контролем энхансерно/промоторной области регуляции экспрессии, и вектор экспрессии, который содержит ДНК, которая кодирует V область мышиной H цепи и С область человеческой H цепи под контролем области управления экспрессией энхансерно/промоторного типа. Затем клетки-хозяева, такие как клетки млекопитающих, одновременно трансформировали обоими этими экспрессирующими векторами, и трансформированные клетки культивировали или in vitro, или in vivo для продукции химерного антигена (например, WO91-16928).

Или же, ДНК, которая кодирует V область L цепи мыши и С область L цепи человека, и ДНК, кодирующую V область мышиной H цепи и С область человеческой H цепи, могут вводиться в единственный вектор экспрессии, клетки-хозяева трансформируются с применением этого вектора и затем культивируются или in vitro, или in vivo для продукции химерных антител.

Получение химерных антител из моноклональных антител WS-4 описано в осуществлении 4.

кДНК, которая кодирует лидерную последовательность цепи к-типа мышиных WS-4 и V область, клонируется с использованием ПЦР и соединяется с вектором экспрессии, который содержит ДНК человеческого генома, которая кодирует Cк область человеческой L цепи. Подобным же образом кДНК, которая кодирует лидерную последовательность H цепи и V область мышиного антитела WS-4, клонируется с использованием ПЦР и связывается с вектором экспрессии, который содержит ДНК человеческого генома, которая кодирует человеческую С1, область.

Более конкретно, подходящие нуклеотидные последовательности вводятся на 5' и 3' концах кДНК, которая кодирует V областей мышиных антител WS-4 с использованием специально сконструированных праймеров ПЦР, так что (1) их можно легко вставить в вектор экспрессии и (2) они соответствующим образом функционируют в указанном векторе экспрессии (например, эффективность транскрипции улучшается с помощью введения последовательности Козака в данное изобретение).

Затем ДНК, которая кодирует V область мышиного антитела WS-4, полученная путем амплификации с помощью ПЦР с использованием этих праймеров, вводится в вектор экспрессии HEF (см. фиг. 1), который уже содержит желаемую человеческую C область. Эти векторы пригодны для временной или постоянной экспрессии генетически сконструированного антитела в разных системах клеток млекопитающих.

При испытании на активность по связыванию с антигеном химерных антител WS-4, полученных таким образом, была продемонстрирована активность антител WS-4 в отношении связывания с человеческим ИЛ-8 (см. фиг. 2). Таким образом, было сделано заключение, что была клонирована верная мышиная V область и определена правильная последовательность.

Создание реконструированных человеческих антител WS-4 Чтобы получить реконструированные человеческие антитела, в которых CDR мышиных моноклональных антител пересажены в человеческие антитела, желательно, чтобы была высокая степень гомологии между аминокислотными последовательностями FR мышиных моноклональных антител, имеющих CDR, подлежащие пересадке, и аминокислотными последовательностями FR человеческих моноклональных антител, в которые должны быть пересажены эти CDR.

С этой целью человеческие V области для того, чтобы служить основой для конструирования V областей реконструированных человеческих антител WS-4, можно выбирать путем сравнения аминокислотных последовательностей FR мышиных моноклональных антител с аминокислотной последовательностью FR человеческих антител. Более конкретно, V области L и H цепей мышиных антител WS-4 сравнили со всеми известными человеческими V областями, найденными в базе данных Национального фонда биомедицинских исследований (National Biomedical Research Foundation, NBRF) с использованием генетического аналитического программного обеспечения, GENETEX (Software Development Co., Ltd.).

При сравнении с известными V областями человеческих L цепей было обнаружено, что V область L цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожа на область человеческих антител HAU (Watanabe S. еt al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. , 351, 1291-1295, 1970), имеющих гомологию, равную 69,2%. С другой стороны при сравнении с известными V областями H цепи человеческих антител было обнаружено, что V область H цепи антител WS-4 наиболее близко похожа на V область человеческих антител VDH26 (Buluwela L. еt al., EMBO J., 7, 2003-2010, 1988), имеющую гомологию, равную 71,4%.

В основном гомология аминокислотных последовательностей мышиных V областей с аминокислотными последовательностями человеческих V областей меньше, чем гомология с аминокислотными последовательностями мышиных V областей. Это показывает, что V область мышиных антител WS-4 не полностью сходна с человеческой V областью, и в то же время указывает на то, что очеловечивание V области мышиных WS-4 является наилучшим путем решения проблемы иммуногенности у больных людей.

V область мышиных антител WS-4, кроме того, сравнили с консенсусной последовательностью подгруппы человеческой V области по Kabat Е.А., et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health Services, U.S. Government Printing Office, чтобы сравнить FR V области. Эти результаты показаны в таблице 1.

FR V области L цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на консенсусную последовательность FR V области человеческой L цепи подгруппы I (HSGI), имеющую гомологию, равную 64,4%. С другой стороны FR V области H цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на консенсусную последовательность V области человеческой H цепи подгруппы III (HSGIII), имеющую гомологию, равную 62,3%.

Эти результаты подтверждают результаты, полученные из сравнения с известными человеческими антителами, V областью L цепи человеческих антител HAU, принадлежащей к подгруппе I V областей человеческой L цепи, и V областью H цепи человеческих антител VDH26, принадлежащей к подгруппе III V областей H цепи. Чтобы создать V область L цепи реконструированных человеческих антител WS-4, возможно лучше всего использовать V область человеческой L цепи, принадлежащую к подгруппе I (HSGI), тогда как, чтобы создать V область H цепи реконструированных человеческих антител WS-4, возможно, лучше всего использовать V область H цепи человеческих антител, принадлежащих к подгруппе III (HSGIII).

При сравнении с V областью L цепи известных человеческих антител V область L цепи мышиных моноклональных антител WS-4 наиболее близко похожа на V область L цепи человеческих антител REI, представителя подгруппы 1 V областей L цепи. Таким образом, использовались FR из REI при создании V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4. В этих человеческих FR на основе REI существуют различия в пяти аминокислотах (в положениях 39, 71, 104, 105 и 107; см. таблицу 2) по сравнению с последовательностью человеческих REI, документально показанной в специальной литературе (Palm W. et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356, 167-191, 1975; и Epp О. et al., Biochemistry, 14, 4943-4952, 1975).

Номера аминокислот, показанные в таблице, приведены на основе опыта Kabat Е. А. et al. (1991). Изменения двух аминокислот в положениях 39 и 71 были теми изменениями, которые вызваны аминокислотами, присутствующими в FRV области L цепи крысиных антител CAMPATH-IH (Riechmann et al., 1988). По Kabat et al. (1991) изменение других трех аминокислот в FR4 (положения 104, 105 и 107) основаны на J области из других человеческих kL цепей и не отличаются от человеческих.

Было создано два варианта V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4. В первом варианте RVLa FR были идентичными FR на основе REI, присутствующих в реконструированных человеческих антителах CAMPATH-IH (Riechmann et al., 1988), тогда как CDR были идентичны CDR V области L цепи мышиных антител WS-4. Второй вариант, RVLb, основан на RVLa, и отличается только по одной аминокислоте в положении 71 в человеческой FR3. Как определено Clothia С. et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987, остаток 71 является частью канонической структуры CDRI V области L цепи.

Предсказано, что аминокислота в этом положении непосредственно влияет на структуру петли CDRI V области L цепи, и по этой причине считается, что она имеет значительное воздействие на связывание с антигеном. В V области L цепи RVLb реконструированных человеческих антител WS-4 фенилаланин в положении 71 заменен на тирозин. В таблице 2 показаны соответствующие аминокислотные последовательности V области L цепи мышиных антител WS-4, FR модифицированных REI для использования в реконструированных человеческих антителах CAMPATH-1H (Riechmann, et al., 1988) и два варианта V области L цепи реконструированных человеческих антител WS-4.

FR V области H цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на V область человеческой H цепи, принадлежащей к подгруппе Ill (таблица 1).

При сравнении с известными V областями человеческих H цепей и V областью H цепи мышиных антител WS-4 наиболее близко похожи на V область H цепи человеческих антител VDH26, представителя подгруппы III V областей человеческих H цепей, от FR1 до FR3 (Buluwela L. et al., EMBO J., 7, 2003-2010, 1988). В отношении FR4, так как о последовательности FR4 из VDH26 не сообщалось, было решено исп