Гены агглютинации, дрожжи

Гены агглютинации, дрожжи

Реферат

 

Изобретение относится к генам агглютинации дрожжей, а также к дрожжам, которые их содержат. Получены гены агглютинации дрожжей: FL01L из штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ABXL-1D, имеющий размер 4,70,2 кb, кодирующий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ IDN1, и определяющийся картой рестрикционного расщепления, представленной на фиг. 1. Ген агглютинации дрожжей FL01S получен из штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ABXL-1D, имеющий размер 2,60,2 кb, кодирующий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID N2, и определяющийся картой рестрикционного расщепления, представленной на фиг.2. Получены и штаммы дрожжей W204-FL01L и W204-FL01S, содержащие вышеуказанные гены, обладающие агглютинирующими свойствами. Полученные гены и дрожжи обладают более сильными и стабильными агглютинирующими свойствами. 4 с.п.ф-лы, 27 ил., 1 табл.

Область техники, к которой относится данное изобретение Настоящее изобретение относится к генам агглютинации дрожжей, а также к дрожжам, которые их содержат.

Предпосылки создания изобретения В ферментационной промышленности агглютинация дрожжей представляет собой весьма важное явление, и в этой связи дрожжи, способные к агглютинации, достаточно интенсивно изучались с целью выявления причины, вызывающей агглютинацию. Известно, что агглютинация дрожжей контролируется множеством генов, среди которых относительно хорошо изученные принадлежат к гену агглютинации FL01, который картирован на правой ветви дрожжевой хромосомы 1.

Структура гена агглютинации FL01, полученного из дрожжей Sacharomyces cerevisiae, была абсолютно неизвестной, но в 1989 году ген был клонирован впервые авторами настоящего изобретения с соавторами, при этом была получена рестрикционная карта гена (Watari et al., Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, N 3, p. 901-903, 1989). (Тем не менее, последовательность нуклеотидных оснований оставалась неизвестной).

Мы, авторы настоящего изобретения, сообщали о возможности превращать промышленные дрожжи, не обладающие способностью к агглютинации, в дрожжи, обладающие способностью к агглютинации, для их практического использования путем введения гена агглютинации FL01 в различные промышленные дрожжи (Watari et al. , Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 55, N 6, p. 1547-1552, 1991); однако, не всегда было возможно придать сильные и стабильные агглютинирующие свойства всем промышленным дрожжам.

Мы, авторы настоящего изобретения, продолжали далее интенсивно изучать FL01 ген и обнаружили при этом, что данный ген, который мы, авторы настоящего изобретения с соавторами, рассматривали как ген FL01 (Watari et al., Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, N 3, p. 901-903, 1989), не был интактным FL01 геном, присутствующим на хромосоме 1 дрожжей Sacharomyces cerevisiae, штамм ABXL-ID, но представлял собой FL01 ген, часть которого была делетирована в процессе поддержания плазмиды в Esherichia coli, штамм К12, содержащий интактный FL01 ген (этот ген мы дальше будем называть как FL01S).

Раскрытие изобретения Целью настоящего изобретения является определение структуры интактного FL01 гена (этот ген мы будем далее определять как FL01L), а также разработка технологии придания более сильных и более стабильных агглютинирующих свойств различным промышленным дрожжам.

К настоящему времени мы, авторы настоящего изобретения, в результате различных исследований, связанных с FL01 геном, смогли выделить интактный FL01 ген или FL01L ген, определили полную нуклеотидную последовательность этого гена и открыли далее, чем при использовании FL01L гена возможно выращивать для промышленного использования различные дрожжи с более сильными и стабильными агглютинирующими свойствами, чем это было возможно с использованием FL01S гена, и на этом настоящее изобретение завершается.

Другими словами, настоящее изобретение относится к гену агглютинации размером 4,70,2 кb в дрожжах, который кодирует полипептид, обладающий агглютинирующей активностью, а более специфично оно относится к вышеупомянутому гену агглютинации, полученному из дрожжей Sacharomyces cerevisiae, характеризующемуся рестрикционной картой, представленной на фиг. 1, а более специфично оно относится к вышеупомянутому гену агглютинации, который принципиально кодирует аминокислотную последовательность, представленную в Последовательности N 1.

Настоящее изобретение относится также к гену агглютинации размером 2,60,2 кb в дрожжах, который кодирует полипептидную цепь, обладающую агглютинирующей активностью, и более специфично, к гену агглютинации, полученному из дрожжей Sacharomyces cerevisiaе, определенному картой рестрикционного расщепления, представленной на фиг. 2, и более специфично к гену агглютинации, кодирующему аминокислотную последовательность, представленную в Последовательности N 2.

Далее настоящее изобретение относится к дрожжам, либо содержащим вышеупомянутый ген агглютинации, либо имеющим агглютинирующие свойства.

"Ген агглютинации" в контексте настоящего описания используется для определения гена, который контролирует агглютинацию дрожжей.

Действие изобретения Как описано выше, гены агглютинации, в соответствии с настоящим изобретением, способны придавать агглютинирующие свойства неагглютинирующим дрожжам Sacharomyces cerevisiae. Значение использования дрожжей, обладающих агглютинирующими свойствами в ферментационной промышленности, состоит в том, что: 1) клетки могут быстро быть отделены от ферментационной среды по завершении ферментации и таким образом процесс может быть упрощен так, что отпадает необходимость проведения других процедур для отделения дрожжей от ферментационной среды, включая центрифугирование и т.д.; 2) ферментируемая масса обладает достаточно высокой степенью прозрачности, при этом груз снижается во время последнего фильтрования ферментируемой массы и, таким образом, повышается эффективность процесса; 3) возможна непрерывная ферментация так же, как с иммобилизованными клетками, при этом не требуется реакторов или какого-то специального оборудования.

Кроме того, ранее предпринимались попытки выращивания дрожжей, обладающих способностью к агглютинации, с использованием метода индукции, методов получения гибридов, слияния клеток и т.д. для естественных или искусственных мутантов, но при этом очень часто сообщалось о том, что такие методы сопровождаются изменением генетических свойств исходного выращиваемого штамма и обычно нарушением желательных свойств исходного варианта. Однако, в соответствии с настоящим изобретением, возможно улучшать агглютинирующие свойства выращиваемых штаммов просто путем введения в них генов, которые не нарушают других желательных свойств исходного штамма, что является основным преимуществом предлагаемого в изобретении метода.

Краткое описание чертежей Фиг. 1.

Карта рестрикционного расщепления FL01L гена в соответствии с настоящим изобретением. На чертеже сайты расщепления каждого рестрикционного энзима изображены как Ac для AccI, B для BglI, RV для EcoRV, K для KpnI, Pv для PvuII.

Фиг. 2.

Карта рестрикционного расщепления FL01S гена в соответствии с настоящим изобретением.

На чертеже сайты расщепления каждого рестрикционного энзима отражаются как Ac для AccI, Bg для BglII, RV для EcoRV, K для KpnI, Pv для PvuII.

Фиг. 3 Схема получения плазмид YRpGLF14S и YRpGLF8L, содержащих гены агглютинации EL01S и FL01L, для прямой селекции дрожжей.

Фиг. 4 YCpHF19S (20,00 кb).

Фиг. 5.

YIpHF19S (15,80 кb).

Фиг. 6 5,8 кb BamHI - XhoI фрагмент YCpHF19S, содержащий FL01S ген.

Фиг. 7 YCpHF19L (22,10 кb) Фиг. 8 7,9 кb BamHI-XhoI фрагмент YCpHF19L, содержащий FL01L ген.

Фиг. 9 YRpGL10 (9,70 кb).

Фиг. 10.

YRpGLF14S (15,50 кb).

Фиг. 11 YRpGLF8L (17,66 кb).

Фиг. 12 Схема получения плазмид pBR-ADHI-FL01S и pBR-ADHI-FL01L, содержащих гены агглютинации FL01S и FL01L, для включения в хромосомы дрожжей.

Фиг. 13 pAAH5 (12,60 кb).

Фиг. 14 pAAH5, расщепленная BamHI (12,60 кb).

Фиг. 15 pBR322 (4,30 кb).

Фиг. 16 pBR322-dH (4,30 кb).

Фиг. 17 pBR-DEP1 (2,50 кb).

Фиг. 18 Открытая рамка считывания FL01S, полученная с помощью PCR.

Фиг. 19 pBR-dEP1-FL01S (5,1 кb).

Фиг. 20 Открытая рамка считывания FL01L.

Фиг. 21 pBR-dH-ADHI (6,20 кb).

Фиг. 22 pBR-ADHI-FL01S (8,80 кb).

Фиг. 23 YCpHF19L (22,10 кb).

Фиг. 24 YCpHF19L, расщепленная EcoRv + BglII.

Фиг. 25 pBR-dEP1-FL01L (7,20 кb).

Фиг. 26 Открытая рамка считывания FL01L.

Фиг. 27 pBR-ADHI-FL01L (10,80 кb).

Предпочтительный способ реализации изобретения Более конкретное объяснение настоящего изобретения предлагается ниже.

Ген агглютинации.

В соответствии с настоящим изобретением, гены, придающие дрожжам Sacchoromyces cerevisiae агглютинирующие свойства, включают ген дрожжей размером 4,70,2 кb, который кодирует полипептид, обладающий агглютинирующей активностью, а также ген агглютинации размером 2,6 0,2 кb, полученный из вышеупомянутого гена агглютинации. При этом данные гены соответствуют гену FL01L (также обозначенному как FL01L) и гену FL01S (также обозначаемому как FL01S), полученным из гена агглютинации FL01 из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, описанных выше. FL01S представляет собой FL01L ген с частью делетированной нуклеотидной последовательности. К тому же, как будет представлено позже, ген FL01 также заключает гены, которые являются искусственными или естественными производными гена FL01L и обладают агглютинирующими свойствами, хотя длина их открытой рамки для считывания может различаться. Отсюда, ген FL01L представляет собой интактный ген FL01 на хромосоме I дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а FL01S представляет собой ген FL01L с частью делетированной открытой рамки считывания, делеция которой осуществлена без сдвига рамки связи с этим, FL01L придает относительно сильные агглютинирующие свойства хозяйской клетке дрожжей, в которую он был включен, тогда как FL01S, в сравнении с FL01L, придает более слабые агглютинирующие свойства клетке дрожжей, в которую он включается.

В соответствии с настоящим изобретением, агглютинирующие гены присутствуют в дрожжах Saccharomyces cerevisiae в форме плазмид, которые содержат гены как составляющие их части, а также в форме инсерций в геном хозяина. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением гены агглютинации с целью стабильной экспрессии в дрожжах, могут быть помещены под контроль соответствующего промотора и терминатора и присутствовать в такой форме в виде плазмид или инсерций внутри генома. Используемые для таких целей промотор и терминатор могут представлять собой подходящие комбинации хорошо известных промоторов и терминаторов, таких как гена алкогольдегидрогеназы (ADHI), гена фосфоглицераткиназы (PGK) и других.

Полипептиды, кодируемые генами.

В соответствии с настоящим изобретением, FL01L ген определяется по аминокислотной последовательности полипептида, который он кодирует. Этот полипептид имеет агглютинирующую активность и представляет собой полипептид, чья аминокислотная последовательность в целом отражается последовательностью N 1. Отсюда, выражение "тот объект, чья аминокислотная последовательность в основном отражается Последовательностью N 1", означает, что некоторые аминокислоты могут быть делетированы или замещены, а также, что некоторые аминокислоты могут быть добавлены, и при этом полипептид сохраняет агглютинирующую активность.

В соответствии с настоящим изобретением, типичный полипептид, обладающий агглютинирующей активностью, имеет аминокислотную последовательность, приведенную в Последовательности N 1, и состоит из 1637 аминокислот. При этом ранее его аминокислотный состав не был известен.

Выше отмечено, что в соответствии с настоящим изобретением выражение "тот объект, чья аминокислотная последовательность в основном отражается Последовательностью N 1", означает, что некоторые аминокислоты могут быть делетированы или замещены, а также, что некоторые аминокислоты могут быть добавлены, и при этом сохраняется агглютинирующая активность полипептида; примером пептида, который имеет изменения аминокислотного состава, является такой полипептид, в котором аминокислотная последовательность с 329 аминокислоты по 1003 аминокислоту (FL01L последовательность) делетирована, при этом получается последовательность FL01S (см. Последовательность N 2) и при этом данный пептид обладает агглютинирующей активностью, хотя и несколько более слабой.

Если агглютинирующие свойства дрожжей во время ферментации достаточно сильны, то число суспендируемых клеток дрожжей будет снижено, и это приведет к снижению скорости ферментации. Поэтому желательно иметь возможность выращивать дрожжи таким способом, чтобы агглютинирующие свойства соответствующей силы были присущи каждой ферментационной системе. Агглютинирующие свойства могут стать очень сильными при введении гена FL01L, и в этой связи введение гена FL01S несколько более предпочтительно. В данном контексте, несмотря на то, что в соответствии с данным изобретением, длины полипептидов в основном совпадают с последовательностью, перечисленной в Последовательности N 1, делеции, замещения, присоединения и так далее нескольких аминокислот весьма существенны для установления агглютинирующей активности желательной силы в различных дрожжах. Таким образом, подобного рода измененные полипептиды также имеют отношение к настоящему изобретению, как полипептиды, обладающие агглютинирующей активностью.

Нуклеотидная последовательность гена агглютинации.

Ген FL01L имеет нуклеотидную последовательность, представленную в Последовательности N 1 или изомера с вырожденным кодом и имеет последовательность оснований, которая соответствует аминокислотной последовательности, представленной в Последовательности N 1 или ее изомера с вырожденным кодом. Отсюда, термин "изомер с вырожденным кодом" означает цепь ДНК, которая отличается только в вырожденном кодоне, но которая сохраняет способность кодировать тот же самый полипептид.

Последовательность оснований цепи ДНК, перечисленная в Последовательности N 1, была определена для гена FL01, полученного из Saccharomyces cerevisiae штамма ABXL-ID (Генетический Центр по хранению Дрожжей, Университет Калифорнии, США) с использованием дидезокси метода.

Коллекция цепей ДНК гена агглютинации.

В настоящее время отсутствует какая-либо информация относительно продукта FL01 гена, который имел бы агглютинирующую активность (по аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого FL01 геном) и поэтому невозможно клонировать FL01 ген с использованием обычно применяемой процедуры гибридизации, в которой применяется соответствующий зонд ДНК, синтезированный на основе известной аминокислотной последовательности. В результате этого, авторы настоящего изобретения вынуждены были создавать генную библиотеку полной ДНК Saccharomyces cerevisiae штамма ABXL-ID с использованием "челночной" векторной плазмиды дрожжей /E. coli, при этом неагглютинирующие дрожжи трансформировались для получения агглютинирующего клона, и плазмиды выделены из трансформированного штамма (см. далее примеры с описанием деталей процедуры).

Введение гена агглютинации в дрожжи.

В соответствии с настоящим изобретением, посредством введения гена агглютинации, полученного описанным выше способом, в дрожжи, которые используются в ферментационной промышленности согласно методам биоинженерии, например пивные дрожжи, винные дрожжи, дрожжи виски, дрожжи японского саке, шоку (Shochu) дрожжи, спиртовые дрожжи и т.д. (все - представители Saccharomyces cerevisiae), возможно превращать в агглютинирующие штаммы, если они ранее не обладали способностью к агглютинации, или усиливать их агглютинирующие свойства, если они были представителями штаммов, обладающих агглютинирующими свойствами.

Дрожжи.

В соответствии с настоящим изобретением, трансформируемые дрожжи представляют собой микроорганизмы, относящиеся к роду Saccharomyces cerevisiae, описанному в The Yeasts: A Taxonomic Study, 3rd Ed. (Yarrow D., ed by N.J.W. Kreger-Van Rij, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984, p. 379), или их синонимы или мутанты; однако, в соответствии с целью настоящего изобретения, предпочтительны различные промышленные дрожжи, принадлежащие к роду Saccharomyces cerevisiae, например пивные дрожжи, винные дрожжи, дрожжи виски, дрожжи японского саке, шоку (Shochu) дрожжи, спиртовые дрожжи и т.д.

Конкретные примеры их включают пивные дрожжи низового брожения W164 (Мюнхенский Институт Технологии, Германия), W204 (Мюнхенский Институт Технологии, Германия), SMA-S (Берлинский Институт Технологии, Германия), Н.Н. (Берлинский Институт Технологии, Германия), а также пивные дрожжи верхового брожения Obg.160 (Берлинский Институт Технологии, Германия), винные дрожжи: IAM 4175 (Токийский Университет), дрожжи виски: AHU 3200 (Университет Хоккайдо), дрожжи японского саке: Ассоциация N 6 (Японская Ассоциация Пива), шоку (Shochu) дрожжи: IF0 0282 (Фонд Исследовательского Института по ферментации), спиртовые дрожжи: IF0 0216 (собственность Института Исследования Ферментации) и т.д. Эти промышленные дрожжи были отобраны и культивировались в виде чистых культур в течение многих лет с получением форм, подходящих для ферментационной промышленности, т.е. форм, способных к эффективной ферментации и продукции спирта с хорошим вкусом, генетические свойства которых являются стабильными и так далее.

Трансформация.

Используемые процедуры и методы получения трансформированных форм практически не отличаются от общеприменяемых в молекулярной биологии и генной инженерии и могут включать иные методы, кроме тех, что указаны ниже, в связи с их способностью увеличивать эффективность широко используемых технологий. В соответствии с настоящим изобретением, для того, чтобы ген агглютинации подвергался экспрессии в дрожжах, необходимо, во-первых, вставить ген в плазмидной вектор, который способен к стабильному существованию в дрожжах. При этом может использоваться любой из известных в настоящее время векторов, таких как YRp, YEp, YCp, YIp и другие. Эти плазмидные векторы не только хорошо известны по их описаниям в литературе, но также достаточно легки в изготовлении.

В соответствии с настоящим изобретением, в качестве маркера для селекции нужных трансформантов можно использовать любой ген устойчивости против лекарств, такой как G418 и т.д., поскольку в случае промышленных дрожжей не существует внутренних генетических маркеров, таких как потребность в аминокислотах или нуклеиновых кислотах и т. д. Однако, возможно получить трансформант, маркированный собственно агглютинацией, используя тот факт, что рассматриваемый ген агглютинации экспрессируется в виде доминантного гена.

В соответствии с настоящим изобретением, инсерция гена агглютинации в плазмиду и введение ее далее в дрожжи достаточно легко осуществляется, но с другой стороны, данный тип плазмид обычно трудно стабильно поддерживать в клетках, и они часто теряются из трансформированных клеток. В соответствии с настоящим изобретением, для того, чтобы поддерживать цепь ДНК гена агглютинации в дрожжах в более стабильном состоянии, ее следует вставить в геном дрожжей. Более предпочтительно улучшать дрожжи, используя только гены дрожжей, особенно в случае дрожжей, используемых в пищевой промышленности, таким образом, чтобы в конечном рекомбинанте не присутствовал фрагмент недрожжевой ДНК из E. coli (содержащийся в плазмидном векторе, если плазмида выращивалась в E. coli). Мы, авторы настоящего изобретения, сделали выбор в пользу введения только гена дрожжей, используя метод ко-трансформации Пентилла с соавторами и метод замещения гена (Current Genetics, Vol. 12, p. 413-420, 1987), в соответствии с которыми только дрожжевой ген включается в геномную ДНК. Кроме того, трансформация может быть осуществлена с использованием любых подходящих методов, используемых в области молекулярной биологии и генной инженерии, таких как, например, метод протопластов Хиннена (Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, Vol. 75, p. 1929-1933, 1978), литий-ацетатный метод Ито с соавторами (Journal of Bacteriology, Vol. 153, p. 163-168, 1983) и другие. Получаемые с помощью таких методов дрожжи имеют, кроме введенной экзогенной ДНК, точно те же самые генетические свойства, как и у исходного штамма перед интродукцией, а с использованием, кроме того, метода хромосомной интродукции, при котором вводится только цепь ДНК гена агглютинации с помощью техники ко-трансформации и генного замещения, получаются рекомбинантные дрожжи, которые не содержат необязательных последовательностей вектора, т.е. они не обладают свойствами используемого вектора. В результате положительные качества исходного штамма никоим образом не нарушаются. При этом представляется возможным выращивать промышленные дрожжи, способность которых к агглютинации определенным образом улучшена.

Производство спиртовых жидкостей.

В соответствии с настоящим изобретением для достижения описанного выше эффекта проводится ферментация ферментируемого источника с использованием трансформированных дрожжей, содержащих ген агглютинации. Само собой разумеется, что ферментируемый источник выбирается с учетом объекта ферментации, например, при производстве пива или виски используется сусло, при производстве вина - фруктовый сок, в производстве японского саке используется койи (koji), в производстве шоку - крахмал или другие углеводные источники, а в производстве спирта - меласса, крахмал или другие углеводные источники. Кроме того, условия ферментации могут соответствовать традиционно применяемым, при этом отсутствует необходимость модифицировать существующие процедуры ферментации или использовать другое оборудование при внедрении настоящего изобретения Поскольку используемые дрожжи проявляют тенденцию к агглютинации в получаемой спиртовой жидкости, они быстро агглютинируют и оседают на дно ферментационного куба после завершения ферментации. Таким образом, клетки дрожжей легко отделяются от ферментационной среды.

Примеры Более детальное описание настоящего изобретения предлагается ниже со ссылками на примеры.

Пример 1 (Коллекция генов, контролирующих агглютинацию дрожжей) Для получения FL01S нега как одного из генов агглютинации, в соответствии с настоящим изобретением, проводится следующий эксперимент (Watari et al. , Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, N 3, p. 901 - 903, 1989). Используется хромосомная ДНК Saccharomyccs cerevisiae штамм ABXL-ID (генный тип: MATa FL01, Центр по хранению Генетической информации Дрожжей, Университет Калифорнии, США), которая была получена по методу Крайера с соавторами (Methods of Cell Biology, Vol. 12, p. 39 - 44, 1975). Полученная хромосомная ДНК была частично расщеплена с помощью рестрикционного фермента Sau 3AI, фрагменты ДНК размером около 5 кb были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и встроены in vitro с помощью легирования (Watari, et al., Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, N 3, p. 901 - 903, 1989), в BamHI-сайт клонирующего вектора YCpH4, который содержал ген HIS4 для синтеза гистидина в качестве селективного маркера. Esherichia coli (E. coli) штамм MC1061 (генный тип: hsdR mcrB arad139 (araABC-leu) 7679^lacX74 galU glaК rspL thi) была трансформирована с помощью легирующей смеси, а плазмиды затем были экстрагированы из трансформанта для создания генной библиотеки штамма ABXL-ID. Штамм E.coli MC1061 представляет собой штамм, широко распространенный для исследования в области технологии рекомбинантных ДНК. С использованием генной библиотеки была проведена трансформация пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамм YJW6, которые зависят от гистидина и не обладают агглютинирующей способностью (генный тип: MAT-adeI uraI his4 canI karI) (Watari et al., Agricultural and Biological Chem. , vol. 53, N 3, p. 901 - 903, 1989). Трансформация Saccharomyces cerevisiae штамм YJW6 проводилась, в основном, по литий-ацетатному методу Ито с соавторами (Journal of Bacteriology, vol. 153, p. 163 - 168, 1983). В соответствии с этим методом, 100 мл жидкой культуральной среды в YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона, 2% глюкозы) инокулируют одной петлей штамма YJW6, после чего клетки инкубируют в течение ночи при 30^oC, отделяют на следующее утро с помощью центрифугирования, инокулируют в новую среду того же состава и далее культивируют в течение 2 часов при 30^oC. Собранные клетки промывают 40 мл стерильной воды и суспендируют в 20 мл раствора TE (10 мМ Трис-HCl буферного раствора, содержащего 1 мМ ЭДТА, pH 7,5). 5 мл полученного раствора переносят в L-образную опытную пробирку (пробирка Моно), добавляют 5 мл 0,2 М раствора ацетата лития и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение одного часа со скоростью 100 об/мин. Из раствора отбирают 0,1 мл и переносят в 1,5 мл пробирку Эппендорфа, которая уже содержит 50 мкг рекомбинантной плазмиды (осажденной этанолом и затем высушенной на воздухе). Смесь хорошо перемешивают и оставляют в течение 30 мин при 30^oC. Далее, продолжая хорошо перемешивать пробирку Эппендорфа, добавляют в нее 0,1 мл 70%-ного полиэтиленгликоля # 4000, смесь хорошо перемешивают и оставляют стоять в течение одного часа при 30^oC. После этого смесь нагревают до 42^oC в течение 5 минут (обработка тепловым шоком), охлаждают до комнатной температуры и промывают затем клетки с помощью стерильной воды. Далее клетки суспендируют в 0,5 мл стерильной воды и 0,1 мл суспензии вносят в минимальную культуральную среду, которая не содержит гистидина (0,67% Difco, содержащий азотистые основания из дрожжей без аминокислот, 2% глюкозы, 40 мкг/мл сульфата аденина, 40 мкг/мл урацила, 2% бактоагара Difco) для получения трансформанта, независимого от гистидина. Указанный эксперимент трансформации повторяли 10 раз для получения примерно 10000 клонов трансформантов, независимых от гистидина.

Далее, среди полученных трансформантов проводили скриннинг агглютинирующих клонов. Трансформанты отбирали с планшета с помощью зубочистки, инокулировали в 96-луночный микротитровальный планшет [каждая лунка которого содержала 200 мкл минимальной жидкой культуральной среды (указанная выше минимальная среда без агара)] и культивировали при 25^oC в течение трех дней. Агглютинацию наблюдали при энергичном перемешивании микроплат после культивирования с использованием специального встряхивателя для микроплат (микромиксер Titech) в течение 60 секунд. При этом агглютинирующие клоны отмечаются визуально. Один клон с относительно сильными агглютинирующими свойствами был получен из примерно 6000 трансформантов, независимых от гистидина. Этот штамм культивировали в неселективной культуральной среде YPD, на которой был получен гистидин-зависимый в связи с потерей плазмиды клон. Этот клон, будучи гистидин-зависимым, теряет также свои агглютинирующие свойства. К тому же, при выделении ДНК из первоначально полученных агглютинирующих трансформантов была также выделена плазмида из E.coli штамм MC1061, и, с помощью ретрансформации штаммом YJW6, получили трансформанты, независимые от гистидина, все обладающие агглютинирующими свойствами. Эти результаты приводят к выводу о том, что агглютинирующие свойства, наблюдаемые у трансформированного штамма, связаны не с генетической мутацией клетки-хозяина, а вызваны плазмидой в трансформированном штамме. Исходя из этого, мы, авторы настоящего изобретения, назвали плазмиду, которая содержит генетическую последовательность, контролирующую агглютинацию, как YCpHF19S. Карта рестрикции данной плазмиды представлена на фиг. 4.

Естественно предположить, что подобная плазмида, содержащая ген агглютинации, может быть использована в качестве селективного маркера для селекции агглютинирующей способности дрожжей, не содержащих маркер, в скрининговом тесте с использованием микротитровального планшета для получения нужных трансформантов. В этом эксперименте трансформанты, в которые настоящая плазмида была введена, были получены из неагглютинирующих дрожжей. Иными словами, данный тип гена аггютинации может быть использован для получения трансформантов дрожжей, принадлежащих к Saccharomyces cerevisiae без какого-либо генетического маркера. Кроме того, важнейшим достоинством такой процедуры скрининга является отсутствие необходимости готовить специальную культуральную среду (минимальную среду или среду, содержащую антибиотики) для скрининга трансформантов, и возможность культивирования в нормальной культуральной среде. К настоящему времени имеется несколько генетических маркеров, полученных из дрожжей, для приготовления трансформантов дрожжей, которые оказались очень полезными в экспериментах по самоклонированию дрожжей.

Пример 2.

(Картирование и идентификация клонирования гена агглютинации) Для того чтобы определить, является ли ген агглютинации, клонированный в примере 1, геном FL01 на хромосоме 1 дрожжей, был выполнен эксперимент физического картирования данного гена агглютинации (Watari et al., Agricultural and Biological Chemystry, vol. 53, N 3, p. 901 - 903, 1989).

В качестве зонда используют фрагмент EcoRV размером 2,6 кb, взятый из ДНК плазмиды YCpHF19S, содержащий ген, контролирующий агглютинацию, и провели физическое картирование данного генного фрагмента с помощью электрофореза хромосомной ДНК (электрофорез в пульсирующем градиенте напряжения). Электрофорез хромосомы Saccharomyces cerevisiae штамм ABXL-ID проводили по методу Карле с соавторами (Carle et al., Proceeding of the National Academy of Science of United States of America, vol. 82, p. 3756 - 3760, 1985). Для приготовления образца при этом использовали аппарат для электрофореза Biorad CHEF. По окончании электрофореза, полоса ДНК в электрофорезном геле была подвергнута саузерн-блоттингу и гибридизации по методу Маниатиса с соавторами (Maniatis et al., Mollecular Cloning, p. 382 - 389, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). В результате была получена гибридная молекула, содержащая вышеупомянутый EcoRV фрагмент 2,6 кb и хромосому 1 штамма ABXL-ID, указывая на то, что ген агглютинации, клонированный в настоящем эксперименте, представляет собой ген на хромосоме 1.

Далее провели генеалогическое картирование клонированного гена агглютинации (Watari et al., Agricultural and Biological Chemystry, v. 55, N 6, p. 1547 - 1552, 1991). После частичного расщепления YCpHF19S рестриктазой XbaI, были выделены центрамерный ген (GEN4) из дрожжей и дрожжевого ориджин-репликации ARSI для получения YIp дрожжевой плазмиды YIpHF19S (см. фиг. 5), подлежащей включению. После расщепления плазмиды рестриктазой BamHI с целью повышения эффективности включения клонированного гена в дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамм YJW2A (генный тип: MATA FL01 his 4) был трансформирован описанным выше способом для получения трансформантов, независимых от гистидина. Полученный штамм был гибридизован с Saccharomyces cerevisiae штамм YJW6 (генный тип: MAT-adeI uraI his4 canI karI) с получением способного к спорообразованию диплоида, которого далее подвергали генетическому анализу (тетрадный анализ). В результате было продемонстрировано наличие генеалогического сцепления (родительский дитип: неродительский дитип: тетратип = 22: 0 : 7) между His + свойством (отсутствие потребности в гистидине) и ADEI на хромосоме 1, что четко показывает, что порция клонированного гена агглютинации плазмиды YIpHF19S была включена в хромосому 1 штамма YJW2A.

Из результатов описанных выше экспериментов по физическому и генеалогическому картированию мы, авторы настоящего изобретения, сделали вывод о том, что клонированный ген агглютинации представляет собой FL01 ген на дрожжевой хромосоме 1. Однако, исходя из этих результатов, не было возможности узнать, представляет ли FL01 ген интактный FL01 ген, присутствующий на дрожжевой хромосоме (или FL01L ген), или он является FL01S геном, лишившимся части последовательности ДНК FL01L, как описано ниже.

Пример 3 (Определение последовательности оснований FL01S) Мы, авторы настоящего изобретения, провели эксперимент с целью определения последовательности оснований FL01 гена (фактически FL01S гена), полученного выше.

В результате субклокирования было показано, что регион гена FL01S, необходимый для экспрессии агглютинации, состоит из фрагмента ДНК размером 4,1 кb, находящегося между сайтами Bam HI-(BamHI/sau 3AI) на плазмиде YCpHF19S. В этой связи, регион, содержащий данный фрагмент ДНК, был субклонирован на векторах pUC118 и pUC119 с мультилинкерными сайтами (оба - продукты Takara Brewing Co). Далее, каждый из субклонов анализировали по методу (Henikoff et al. , Gene, vol. 28, p. 351 - 359, 1984) и по метолу (Yanisch-Porron et al., Gene, vol. 33, p. 103, 119, 1985) с обработкой включенных участков плазмиды экзонуклеазой III и нуклеазой из растений маша, что привело к получению различных клонов небольшой длины со вставленными фрагментами, часть из которых с различными пропусками, что отражается в различной длине цепи. В результате этого процесса был получен набор делеций (продукт Takara Brewing Co. ). Для анализа вставленных фрагментов у полученных клонов был применен ди-дезокси-метод Сангера с соавторами (Sanger et al., Science, vol. 214, p. 1205 - 1210, 1981), а для определения нуклеотидной последовательности вышеупомянутого фрагмента ДНК размером 4,1 кb был использован автоматизированный секвенатор ДНК фирмы Эпплайд Байосистемс, Япония (Applied Biosystems Japan, Inc. ). В результате проведенного анализа было показано наличие открытой рамки считывания размером 2586 н.п. (Последовательность N 2), способной кодировать полипептид, состоящий из 862 аминокислот, молекулярный вес которого оценивается в 89368.

Пример 4 (Эксперимент по гибридизации по методу Саузерна) Как было описано выше, ген агглютинации, полученный в примере 1, находится точно в FL01 локусе дрожжевой хромосомы 1. Однако, для того чтобы определить, является ли он интактным FL01 геном, была проведена гибридизация по Саузерну, описанная ниже. Из дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамм ABXL-ID, использовавшихся для клонирования гена агглютинации, была экстрагирована ДНК, которую затем полностью расщепили с помощью рестриктазы EcoRV, подвергали электрофорезу и затем геномному анализу по Саузерну с использованием в качестве пробы EcoRV фрагмента ДНК размером 2,6 кb, содержащего открытую рамку для считывания, упомянутую выше в примере 2. Саузерн-блоттинг и гибридизацию проводили по методу Маниатиса с соавторами (Maniatis et al., Molecular Cloning p.382-389, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Были получены неожиданные результаты, заключающиеся в том, что не было обнаружено гибридизационного сигнала на участке, соответствующем примерно 2,6 кb, а на участке, соответствующем примерно 4,7 кb, этот сигнал был получен. Это заставило авторов предположить, что клонированный ген агглютинации скорее всего не идентичен FL01 гену штамма ABXL-ID, но, скорее всего, это - интактный FL01 ген с частью последовательности ДНК, потерянной по различным причинам во время процесса клонирования.

Пример 5.

(PCR (полимерная цепная реакция) эксперимент) В данном примере авторы настоящего изобретения выполнили представленный ниже эксперимент для подтверждения структуры FL01 гена ABXL-ID с помощью PCR метода (полимеразная цепная реакция). Вначале химическим путем синтезировали цепь ДНК с использованием приведенной в примере 3 последовательности нуклеотидных оснований. То есть химически с помощью ДНК-синтезатора (продукт ABI Co. ) была синтезирована последовательность ДНК, состоящая из 33 оснований, включая регион с инициирующим кодоном открытой рамки для считывания данного гена, которая использовалась в качестве PCR 5'-праймера.

+1 5'-CCCAAGCTTAAAAATGACAATGCCTCATCGCТA-3' (Sequence N.3) HindIII Linker site (ATF-старт с 14 основания 5'-конца приведенной выше последовательности представляет собой 5'- конец Последовательности FL01S).

Кроме того, химически, тем же самым способом, была синтезирована последовательность ДНК из 33 оснований, включающая комплементарную нить (обратную нить) участка, содержащего терминирующий кодон открытой рамки для считывания данного гена агглютинации, которая использовалась как PCR 3'-праймер (Последовательность N 4).

(STOP) 5'-CCCAAGCTTTTAAATAATTGCCAGCAATAAGGA-3' (Sequence N 4) HindIII Linker site (TTA-старт с 10 основания 5'- конца приведенной выше последовательности представляет собой 3'-конец Последовательности FL01S (обратная нить)).

Далее, с использованием указанных 5'- и 3'-праймеров был поставлен PCR эксперимент с целой ДНК из Saccharomyces cerevisiae штамм ABXL-ID в качестве матрицы.

Для проведения PCR эксперимента использовались зимореактор, модель АВ-1800 (продукт Ato Co. ) и ДНК-полимераза Pfu (Stratagene Co.) в качестве ДНК-полимеразы. Условия проведения PCR эксперимента поддерживались идентичными таковым, описанным в методе Иниса с соавторами (Inis et al., PCR Technology p.3-12, Stockton Press, ed.Henry A.Erlich, 1989). Для подтверждения амплификации ДНК в результате PCR эксперимента исследовали полосы ДНК в агарозном геле после гель-электрофореза. При этом была получена единственная полоса в области примерно 4,7 кb, и это дало основание полагать, что открытая рамка для считывания FL01 штамма ABXL-ID составляет примерно 4,7 кb. Кроме того, в контрольном эксперименте, в котором авторы изобретения использовали плазмиду YCpHF19, содержащую клонированный ген агглютинации в качестве матрицы, была показана полоса в области примерно 2,6 кb. Исходя из полученных результатов, авторы настоящего изобретения сделали вывод о том, что интактна