Аналог эритропоэтина

Аналог эритропоэтина

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается аналога эритропоэтина. Сущность изобретения состоит в том, что аналоги эритропоэтина включают, по крайней мере, один дополнительный сайт для гликозилирования или перегруппировку, по крайней мере, одного сайта для гликозилирования, а также ДНК, кодирующие указанные аналоги и клетки для экспрессии аналога. Изобретение обеспечивает заявленным формам аналогов эритропоэтина, содержащих определенное количество сиаловой кислоты, обладать терапевтически полезным действием. 10 с. и 4 з.п.ф-лы, 10 табл., 15 ил.

Настоящее изобретение относится к аналогам эритропоэтина, имеющим, по крайней мере, один дополнительный сайт для гликозилирования или включающим перегруппировку, по крайней мере одного сайта для гликозилирования. Изобретение также относится к последовательностям ДНК, кодирующим указанные аналоги эритропоэтина, и рекомбинантным плазмидам и клеткам хозяевам для экспрессии аналога.

Эритропоэтин (ЕРО) является гликопротеиновым гормоном, вовлеченным в созревание эритроидных клеток-предшественников в эритроцитах. Он является необходимым при регулировании уровней эритроцитов в кровообращении. Эритропоэтин естественного происхождения образуется легкими в процессе фетальной жизни и почкой взрослых индивидуумов, и циркулирует в крови, и стимулирует образование эритроцитов в костном мозге. Анемия является почти без сомнения следствием почечной недостаточности, обусловленной пониженным образованием эритропоэтина из почки. Рекомбинантный эритропоэтин, полученный с помощью генной инженерии, включающей экспрессию протеинового продукта из клетки хозяина, превращенной геном, кодирующим эритропоэтин, как было найдено, является эффективным, если используется при лечении анемии, возникшей при хронической почечной недостаточности.

В моче человека обычно присутствуют низкие уровни эритропоэтина, тогда как у пациентов, страдающих гипопластической анемией, обнаружены повышенные уровни мочевого эритропоэтина. Для очистки мочевого эритропоэтина человека Miyake et.al. J.Biol.Chem.,252, 5558 /1977/ использовали, в качестве исходного материала, мочу от пациентов с гипопластичной анемией. До сих пор, однако, мочевой эритропоэтин, как было показано, является терапевтически полезным.

Идентификацию, клонирование и экспрессию генов, кодирующих эритропоэтин, описывают в патенте США N 4703008, Lin. Описание способа очистки рекомбинантного эритропоэтина из клеточной среды содержится в патенте США N 4667016. Экспрессия и выделение биологически активного рекомбинантного эритропоэтина из клеток хозяина млекопитающего, содержащих ген эритропоэтина или рекомбинантные плазмиды, впервые сделала доступными количества эритропоэтина, пригодные для терапевтических применений. Кроме того, знание генной последовательности и доступность больших количеств очищенного протеина привело к лучшему пониманию характера действия этого протеина.

Многие поверхностные протеины клеток и секреторные протеины, полученные с помощью клеток эукариотов, модифицируют одной или более олигосахаридными группами. Эта модификация, отнесенная к гликозилированию, может драматически влиять на физические свойства протеинов и может оказывать важное влияние на стабильность протеина, секрецию и субклеточную локализацию. Нужное гликозилирование может являться существенным для биологической активности. Фактически, некоторые гены из организмов эукариотов, если они экспрессированы в бактерию (например, E. coli), которая благоприятствует клеточным процессам гликозилирования протеинов, дают протеины, которые выделяются почти или совсем неактивными в силу их недостаточного гликозилирования.

Гликозилирование происходит в специфических положениях вдоль полипептидного скелета и бывает обычно двух типов: О-связанные олигосахариды присоединяются к сериновым или треониновым остаткам, в то время как N-связанные олигосахариды присоединяются к аспарагиновым остаткам, если они являются частью последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. Структуры N-связанных и О-связанных олигосахаридов и остатков сахаров, найденные в каждом типе, являются различными. Один тип сахара, который обычно находят на обеих структурах, является N-ацетилнейраминовой кислотой (далее употребляется как сиаловая кислота).

Сиаловая кислота является обычно терминальным остатком обоих N-связанных и О-связанных олигосахаридов, и, в силу ее отрицательного заряда, может сообщать кислотные свойства гликопротеину.

Оба эритропоэтина: и мочевой эритропоэтин человека, и рекомбинантный эритропоэтин (экспрессированный в клетки млекопитающего), имеющие аминокислотную последовательность 1-165 эритропоэтина человека, содержат три N-связанных и одну О-связанную олигосахаридные цепи, которые вместе составляют около 40% общего молекулярного веса гликопротеина.

N-связанное гликозилирование протекает в аспарагиновых остатках, расположенных в положениях 24, 38 и 83, в то время как О-связанное гликозилирование протекает в сериновом остатке, расположенном в положении 126 (Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 /1986/; Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 /1988/). Олигосахаридные цепи, как показано, являются модифицированными терминальными остатками сиаловой кислоты.

Ферментативная обработка гликозилированного эритропоэтина с удалением всех остатков сиаловой кислоты приводит к потере активности in vivo, но не влияет на активность in vitro (Lowy et al., Nature, 185, 103 /1960/; Goldwasser et al. , J. Biol. Chem. 249, 4202 /1974/). Это поведение объясняется быстрым выведением азиало-эритропоэтина из кровообращения при взаимодействии с почечным азиалогликопротеином, связывающим протеин (Morrell et al. J.Biol. Chem. 243, 155/1968/; Briggs et al. Am.J.Physiol. 227, 1385 /1974/; Ashwell et al. Methods Enzymol. 50, 287 /1978/). Таким образом, эритропоэтин обладает биологической активностью in vivo только, если он сиалилирован для того, чтобы избежать его связывания почечным связывающим протеином.

Роль других компонентов в олигосахаридных цепях эритропоэтина является недостаточно определенной. Было показано, что частично дегликозилированный эритропоэтин имеет сильно пониженную активность in vivo, по сравнению с гликозилированной формой, но не сохраняет активность in vitro (Dordal et al. Endocrinology 116, 2293 /1985/: Lin). В другом исследовании, однако, удаление N-связанных или О- связанных олигосахаридных цепей поодиночке или совместно с помощью мутагенеза аспарагинового или серинового остатков, которые являются сайтами гликозилирования, резко снижает активность in vitro измененного эритропоэтина, который получают в клетках млекопитающего (Dube et al J.Biol.Chem. 263,17516 /1988/).

Гликопротеины, такие как эритропоэтин, могут быть разделены в различных заряженных формах, используя технику, такую как изоэлектрическое фокусирование (IEF). Несколько исследовательских групп сообщали о IEF изучении неочищенных и частично очищенных эритропоэтиновых препаратов (Lukowsky et al. J. Biochem. 50, 909 /1972/; Sheitton et al. Biochem.Med. 12, 45 /1975/; Fuhr et al. Biochem.Biophys.Res. Comm. 98, 930 /1981/). Самое большее, три или четыре фракции, имеющие эритропоэтиновую активность, были определены с помощью IEF в этих исследованиях и ни одна из них не была охарактеризована в отношении содержания карбогидрата. Кроме того, не было проведено корреляции между изоэлектрическими точками фракций и их биологической активностью.

В процессе очистки мочевого эритропоэтина из мочи человека, обсуждавшемся Miyake et al., сообщалось о двух эритропоэтиновых фракциях, полученных при хроматографировании на гидроксиаппатите, обозначенных как II и IIIA, которые имели подобную специфическую активность. Последующий карбогидратный анализ фракций II и IIIA показал, что фракция II имеет большее среднее содержание сиаловой кислоты, чем фракция IIIA (Dordal et al.).

Целью настоящего изобретения является обеспечение разделенных и выделенных изоформ эритропоэтина, имеющих определенное содержание сиаловой кислоты и биологическую активность. Фармацевтические композиции, содержащие такие молекулы, будут обладать терапевтически полезным действием.

Объект изобретения относится к аналогам эритропоэтина человека, содержащим аминокислотную последовательность, которая включает, по крайней мере, один дополнительный сайт для гликозилирования. Добавленные сайты для гликозилирования могут давать большее число карбогидратных цепей и более высокое содержание сиаловой кислоты, чем эритропоэтин человека. Аналоги эритропоэтина, включающие аминокислотные последовательности, которые включают перегруппировку, по крайней мере, одного сайта для гликозилирования, также охватываются настоящим изобретением. Аналоги, включающие дополнительно одну или более аминокислот с карбокси терминальным концом эритропоэтина, где обеспечивается дополнительно, по крайней мере, один сайт гликозилирования, также включаются в настоящее изобретение. Изобретение далее включает последовательности ДНК, кодирующие такие аналоги эритропоэтина и рекомбинантные плазмиды и клетки хозяев для экспрессии аналога.

Фиг. 1 показывает аналитический изоэлектрический фокусирующий гель разделенных рекомбинантных изоформ эритропоэтина. Полосы геля 1-11 показывают изоформы в области от менее кислой (более высокая величина р1) в полосе 1 до более кислой (более низкая величина р1) в полосе 11. Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ 9-14, также показан в дальних левых и правых полосах геля.

Фиг. 2 показывает взаимосвязь между количеством сиаловой кислоты на изоформу эритропоэтина и специфической активностью in vivo каждой изоформы, выраженной в единицах на мг полипептида эритропоэтина. На фиг.2А концентрацию каждой изоформы эритропоэтина определяли с помощью анализа на протеин по Брэдфорду; на фиг.2В концентрацию определяли по поглощению при 280 нм, на фиг.2С концентрацию определяли с помощью анализа RIA.

Фиг. 3 показывает аналитический изоэлектрический фокусирующий гель определенных смесей рекомбинантных изоформ эритропоэтина, приготовленных с помощью анионообменной хроматографии в различных условиях. Полосы геля 1-6 представляют, соответственно, изоформы эритропоэтина, элюированные в высококонцентрированный солевой промывной раствор после промывания колонки с Q-сефарозой быстрым потоком ("fast flow") 150 ммоль/л уксусной кислоты, pH 4.7, 250 ммоль/л уксусной кислоты, pH 4.7, 300 ммоль/л уксусной кислоты, pH 4.7 или 300 ммоль/л уксусной кислоты (небуферной). Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ, полученный с использованием процедуры, описанной в Примере 2, Lai et al., за исключением того, что хроматографию cDEAE-агарозой заменяют хроматографией с Q-сефарозой, показывают также в левой дальней полосе геля.

Фиг.4 показывает разделение изоформ эритропоэтина с 8 по 12, достигнутое путем воздействия на кондиционированную среду клеток на колонке с Q-сефарозой, градиентом уменьшения pH и увеличения ионной силы.

Аликвоты равномерно распределенных фракций от фракции 2 до фракции 40 подвергали аналитическому изоэлектрическому фокусированию. Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ, полученный с использованием процедур, описанных в Примере 2 Lai et al., за исключением того, что хроматографию с DEAE-агарозой заменяют хроматографией с Q-сефарозой, также показывают в дальней левой полосе геля.

Фиг.5 показывает аминокислотную последовательность эритропоэтина человека. Квадраты указывают на аспарагиновые остатки, к которым присоединяются N-связанные карбогидратные цепи, и звездочки указывают на сериновый остаток, модифицированный О- связанной карбогидратной цепью.

Фиг. 6А, 6В и 6С показывают серии стадий клонирования, использованных в генерировании плазмид для конструирования и анализа аналогов эритропоэтина человека. Эти аналоги имеют измененные аминокислоты, как показано на фиг.5, которые обеспечивают дополнительные сайты гликозилирования.

Фиг. 7 показывает Western blot анализ супернатантов клеток COS эритропоэтина, с последовательностью, подобной эритропоэтину человека и указанных аналогов эритропоэтина. Аналоги [Asn⁹, Ser¹¹] EPO, [Asn⁶⁹] EPO, [Asn¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO и [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO конструируют, как описано в Примере 6. Дополнительные аналоги [Pro¹²⁵, Thr¹²⁷] EPO и [Asn¹²⁶, Ser¹²⁸] EPO, которые не содержат дополнительных карбогидратных цепей, показывают для сравнения.

Фиг. 8 показывает Western blot анализ супернатантов клеток COS эритропоэтина с последовательностью, подобной эритропоэтину человека и указанных аналогов эритропоэтина после обработки N- гликаназой. Аналоги [Thr¹²⁵] EPO и [Pro¹²⁴, Thr¹²⁵] EPO были сконструированы, как описано в Примере 6. Аналоги [Val¹²⁶] EPO, [Pro¹²⁴] EPO, [Pro¹²⁵] EPO, [Thr¹²⁷] EPO, [Pro¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO и [Thr¹²⁵, Ser¹²⁷] EPO показывают для сравнения.

Фиг. 9 показывает изоэлектрический фокусирующий гель пулов 2, 3 и 4, полученных с помощью хроматографии с Q-сефарозой и C4 обращенной фазой среды клеток, которая поддерживала рост CHO клеток, трансфекцированных эритропоэтиновой сДНК, содержащей [Thr¹²⁵] мутацию. Очищенный рекомбинантный эритропоэтин, содержащий смесь изоформ, которые были получены с использованием процедур, описанных в Примере 2 Lai et.al., за исключением того, что хроматографию с DEAE-агарозой заменяют хроматографией с Q-сефарозой, также показывают в левой и правой полосах геля.

Фиг. 10 показывает Western blot анализ супернатантов COS клетки рекомбинантного эритропоэтина человека (rHuEPO) и выбранных аналогов. Конструкцию аналогов описывают в Примере 6. Аналоги N9, N14, N18, N19, N21, N24 и N39 имеют, по крайней мере, одну дополнительную карбогидратную цепь, как это свидетельствует из меньшей подвижности геля.

Фиг. 11 показывает Western blot анализ супернатантов COS клетки рекомбинантного эритропоэтина человека и EPO N14 аналога в процессе усваивания N-гликаназы. Были выбраны точки при 0, 4, 12 и 45 минутах и после усваивания в течение ночи.

Фиг. 12 показывает изоэлектрический фокусирующий гель препаратов изоформы EPO N14 аналога. Низкий пул изоформы содержит EPO N14 аналог, включающий главным образом 6-12 сиаловых кислот на молекулу, средний пул изоформы содержит EPO N14 аналог, содержащий главным образом 10-15 сиаловых кислот на молекулу, и высокий пул изоформы содержит EPO N 14 аналог, имеющий главным образом 12-17 сиаловых кислот на молекулу.

Фиг. 13 показывает фармакокинетические данные рекомбинантного эритропоэтина человека, выделенной изоформы 14 и EPO N 14 аналога (изоформы 15-17) после внутривенной инъекции крысам.

Фиг. 14 показывает данные анализа по холодной замене I¹²⁵ меченного рекомбинантного эритропоэтина человека, связанного с эритропоэтиновым рецептором, в присутствии изменяющихся количеств немеченного rHuEPO, выделенной изоформы 14 или EPO N14 аналога.

Фиг. 15 показывает гематокритное исследование мыши, сравнивающее активность высокого пула изоформы EPO N14 (0.036 и 0.0712 мкг), выделенной изоформы 14 (0.036 и 0.0712 мкг), низкого пула изоформы EPO 177 (0.0712 мкг) и rHuEPO (0.071 мкг).

Объект изобретения включает изоформы эритропоэтина. Специфические изоформы эритропоэтина, полученные в соответствии с настоящим изобретением, и их свойства, могут меняться в зависимости от источника исходного материала. Например, изоформы мочевого эритропоэтина человека отличаются от изоформ рекомбинантного эритропоэтина. В предпочтительном варианте, изобретение относится к изоформе эритропоэтина, имеющей специфическое число (т.е. фиксированное число больше 0) сиаловых кислот на молекулу эритропоэтина, указанное число выбрано из группы, состоящей из 1-14. Преимущественно, указанное число составляет 9, 10, 11, 12, 13 или 14. В другом варианте, указанное число больше 14, преимущественно 16-23.

Термин "изоформа эритропоэтина," как он использован здесь, относится к препаратам эритропоэтина, имеющим одну изоэлектрическую точку (р1) и имеющим одинаковую аминокислотную последовательность. Термин "эритропоэтин", как он использован здесь, включает эритропоэтин естественного происхождения, мочевой эритропоэтин человека, а также полипептиды ненатурального происхождения, имеющие аминокислотную последовательность и гликозилирование, достаточно точно воспроизводящее то, которое свойственно эритропоэтину естественного происхождения, что позволяет им обладать биологическими свойствами in vivo, вызывающими в клетках костного мозга повышенное продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов.

Было найдено, что дискретные изоформы рекомбинантного эритропоэтина, имеющие аминокислотную последовательность мочевого эритропоэтина человека, соответствуют молекулам эритропоэтина, имеющим 1-14 сиаловых кислот, и каждая изоформа, присутствующая в очищенном рекомбинантном эритропоэтине, обладает активностью in vivo, которую связывают с числом сиаловых кислот, которым обладает изоформа.

В предпочтительном варианте, эритропоэтин представляет продукт экспрессии экзогенной ДНК последовательности, которая трансфекцирована в нечеловеческую клетку хозяина эукариота, таким образом, в предпочтительном варианте эритропоэтин представляет "рекомбинантный эритропоэтин".

Рекомбинантный эритропоэтин получают, преимущественно, согласно процедуре, описанной в патенте США 4703008. Рекомбинантный эритропоэтин может быть очищен согласно обычной процедуре, описанной в Примере 2 патента США 4667016 Lai et al. или, напротив, согласно процедуре, описанной в Примере 2 Lai et. al. , где хроматографию с DEAE-агарозой заменяют хроматографией с Q-сефарозой.

Эритропоэтин, очищенный согласно Примеру 2 Lai et al., содержит преимущественно шесть изоформ, при анализе с помощью IEF. Кроме того, по крайней мере одна дополнительная изоформа большей кислотности обнаружена с использованием процедуры хроматографирования, описанной в Примере 4. (Эта более кислая форма, мигрирующая при более 14 сиаловых кислотах на IEF геле, может содержать отрицательные заряды несиаловой кислоты, что проявляется в сопротивлении усваиванию сиалидазы некоторым зарядом). Эти изоформы отличаются друг от друга содержанием сиаловой кислоты. Как показано в Примерах, это демонстрируется выделением 10 из этих изоформ с помощью препаративной IEF и определением содержания сиаловой кислоты в пяти из них. Анализом изоформ на содержание сиаловой кислоты найдено, что пять изоформ содержали либо 9, 10, 11, 12 либо 13 остатков сиаловой кислоты.

Существует взаимосвязь между относительной специфической активностью in vivo эритропоэтина и числом остатков сиаловой кислоты на молекулу эритропоэтина изоформ от 5 до 11 (каждая изоформа обозначена здесь числом сиаловых кислот на молекулу эритропоэтина). Изоформы с 11 по 14 имеют приблизительно одинаковую относительную специфическую активность in vivo. Изоформы 5-14 подвергали анализу на активность in vivo с помощью эксгипоксинового полицитемического биоанализа на мышах и количество каждой присутствующей изоформы определяли с помощью анализа на протеин по Брэдфорду, по поглощению при 280 нм или с помощью радиоиммунного анализа (RIA) для эритропоэтина. RIA определения (Ergie et al. Immunobiology 172, 213 /1986/), выраженные в единицах/мл, делят на 212,770 единиц/мг эритропоэтинового полипептида среднюю специфическую активность очищенного эритропоэтина, определенную с помощью RIA, получая концентрации протеина выделенных изоформ или смесей изоформ, выраженные в мг полипептида эритропоэтина/мл. Как показано в Примерах, относительные специфические активности in vivo увеличиваются ступенчато от изоформы 5 до изоформы 11 (смотри Таблицу 2).

Специфические активности in vivo, на которые ссылаются здесь, являются показателями относительных специфических активностей in vivo и не являются показателями абсолютных специфических активностей in vivo. Для целей этой заявки, специфические активности используют только для сравнения относительных активностей изоформ, которые подвергали анализу, используя один и тот же анализ, используя те же условия, включающие тот же внутренний стандарт, тот же тип животных, имеющих тот же анализ данных, использованных для расчета специфической активности, тот же анализ для определения содержания протеина. Не имеется в виду, что любая величина специфической активности in vivo, приведенная для любой изоформы, представляет характеристическую или абсолютную величину для такой изоформы.

Это изобретение также включает композиции, содержащие две или более изоформы эритропоэтина. В одном варианте композиции включают смесь изоформ, имеющих больше, чем предварительно определенное число сиаловых кислот на молекулу эритропоэтина, например, больше чем 11 сиаловых кислот на молекулу эритропоэтина, или больше чем 12 сиаловых кислот на молекулу, например, смесь изоформ 12, 13 и 14. В другом варианте, композиции содержат смеси изоформ, имеющих предварительно определенное число сиаловых кислот на молекулу эритропоэтина, например, меньше 12, но больше 8 сиаловых кислот на молекулу, как, например, смесь изоформ 9, 10 и 11. Изобретение также включает композиции изоформ эритропоэтина, где относительные количества изоформ являются одинаковыми или разными. Например, смесь изоформ 9, 10 и 11 может иметь изоформы, присутствующие в различных отношениях, таких как 1:1:1, 2:3:1 или 20:20:1.

Преимущественно, композиции включают смеси менее чем четырех изоформ, например, смесь изоформ 11, 12 и 13, или смесь 12 и 14, или смесь 7 и 13.

Для того чтобы получить смеси изоформ эритропоэтина, это изобретение также включает способы выделения выбранных изоформ эритропоэтина. Эти способы включают выделение индивидуальных изоформ с помощью такой техники, как препаративное изоэлектрическое фокусирование или приготовление смесей изоформ, имеющих предварительно определенное число сиаловых кислот на молекулу (например, больше 11), с помощью такой техники, как ионообменная хроматография или хроматофокусирование. Все эти приемы имеют в качестве основы разделение протеинов в соответствии с зарядом.

В общем, ионообменная хроматография и хроматофокусирование включают применение либо неочищенного эритропоэтина человека (клетка кондиционированной среды), или вещества, очищенного на колонке со смолой в условиях, которые позволяют связывать некоторые или все изоформы эритропоэтина со смолой. Для неочищенных препаратов эритропоэтина предпочтительно применять протеин с колонки при pH около 7, в то время как для очищенных препаратов протеин может быть применен с колонки с pH 7 и ниже, до pH 4. После промывания колонки буфером с pH около 4, те изоформы эритропоэтина, которые остаются связанными с ионообменной колонкой, элюируют с помощью повышения pH и концентрации соли в буфере, или с помощью применения градиента повышения pH и увеличения ионной силы при pH около 4. Для хроматофокусирования, изоформы элюируют из колонки с помощью градиента повышения pH или путем промывания колонки раствором с повышенной концентрацией соли.

В предпочтительном варианте, индивидуальные изоформы выделяют, используя ионообменную хроматографию. Как например, изоформу 14 выделяют, используя ионообменную хроматографию, как описано в Примере 8.

Изобретение также включает некоторые аналоги эритропоэтина человека. Фраза "аналог эритропоэтина человека", как она использована здесь, относится к эритропоэтину с одним или более изменениями в аминокислотной последовательности эритропоэтина человека, которая приводит в результате к увеличению числа сайтов для присоединения сиаловой кислоты. Аналоги генерируют сайт-направленным мутагенезом, включающим присоединения, делеции или замещения аминокислотных остатков, которые увеличивают или изменяют сайты, которые являются пригодными для гликозилирования. Такие аналоги могут иметь большее число карбогидратных цепей, чем эритропоэтин человека.

Аналоги эритропоэтина согласно настоящему изобретению включают аминокислотную последовательность, которая включает, по крайней мере, один дополнительный сайт для гликозилирования. Аналоги, имеющие уровни сиаловой кислоты большие чем те, которые найдены в эритропоэтине человека, генерируют добавлением сайтов гликозилирования, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, требуемую для биологической активности. Преимущественно, аналог эритропоэтина человека имеет 1, 2 или 3 дополнительных сайта для N-гликозилирования или О-гликозилирования, которые приводят в результате к добавлению 1, 2 или 3 дополнительных N-связанных или О-связанных карбогидратных цепей. Например, лейцин в положении 69 заменяют аспарагином с получением последовательности Asn-Leu-Ser, которая служит в качестве четвертого сайта для N-гликозилирования. Такое изменение может вообще обеспечивать вплоть до четырех дополнительных сиаловых кислот на молекулу. Примерами изменений, которые генерируют дополнительные сайты О-гликозилирования, являются аланин в положении 125 к треонину и аланины в положениях 124 и 125 к пролину и треонину, соответственно. Могут быть сконструированы аналоги, которые имеют одну или более дополнительных N-связанных и О-связанных цепей, например, аналоги N01 и N02, описанные в Таблице 5. Как будет понятно специалистам в этой области, объект изобретения включает многие другие аналоги эритропоэтина человека, имеющие дополнительные сайты для гликозилирования.

Аналоги, имеющие повышенные уровни присоединенного карбогидрата у сайта гликозилирования, также включаются изобретением. Такие аналоги обычно включают замещение одной или более аминокислот, которые находятся в непосредственной близости к N-связанному или О-связанному сайту. В результате этих изменений аминокислоты, большее количество полипептидов эритропоэтина будет содержать карбогидратную модификацию. Сайты гликозилирования могут быть естественного происхождения или генерированы с помощью мутации. Например, аналог N 13 не генерирует дополнительную карбогидратную цепь даже через сайт гликозилирования, введенный в положение 88. Однако, аналоги N 14 и N 18, которые содержат сериновые и валиновые остатки, соответственно, замещенные в положение 87, имели дополнительную карбогидратную цепь в положении 88.

Изобретение также включает аналоги, которые содержат одну или более аминокислот, простирающихся от карбоксиконцевой области эритропоэтина и где карбоксиконцевое расширение обеспечивает, по крайней мере, один дополнительный карбогидратный сайт. В одном из вариантов, аналог конструировали слиянием карбоксиконцевых 28 аминокислот хорионического гонадотропина человека (HCG) с аргининовым остатком в положении 166 эритропоэтина человека. HCG карбоксиконцевой фрагмент содержал четыре сайта для О-гликозилирования (Kessler et.al. J.Biol.Chem. 254, 7907 /1979/).

Таблицы 3, 4 и 5 представляют аналоги эритропоэтина, которые имеют дополнительные сайты для N-связанных и/или О-связанных карбогидратных цепей. Аналоги имеют последовательность Asn-X-Ser/Thr, замещенную в различных положениях в полипептидной цепи эритропоэтина человека для создания N-связанных сайтов или имеют введенные сериновые или треониновые остатки для создания О-связанных сайтов.

Таблица 6 представляет те аналоги, которые добавляют, по крайней мере, одну дополнительную N-связанную или одну дополнительную О-связанную карбогидратную цепь, или добавляют одновременно дополнительные N-связанные и О-связанные цепи, как следует из данных миграции гликопротеинов на SDS гелях (Пример 7). Как можно заметить из таблиц 3-6, аналоги, имеющие один или более дополнительных сайтов для присоединения карбогидрата, необязательно приводят к молекулам эритропоэтина, имеющим дополнительные карбогидратные цепи. Например, замещение треониновых остатков в положениях 123 и 125 приводит в результате к добавлению О-связанной карбогидратной цепи, в то время как замещение серина или треонина в другие положения не приводит к аналогам с дополнительными О-связанными цепями (смотри Таблицу 4). Однако, замещение аспарагиновых остатков в положениях 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 и 138 в аминокислотной последовательности эритропоэтина человека приводит к добавлению N-связанной цепи в этих сайтах. Слияние HCG полипептидного фрагмента с аспарагиновым остатком в положении 166 эритропоэтина человека приводит к слиянию молекулы эритропоэтин-HCG, имеющей, по крайней мере, две дополнительные О- связанные карбогидратные цепи.

Аналоги эритропоэтина согласно настоящему изобретению также включают эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку, по крайней мере, одного сайта для гликозилирования. Перегруппировка сайта гликозилирования, как использовано здесь, относится к делеции одного или более сайтов гликозилирования в эритропоэтине человека и присоединению одного или более сайтов гликозилирования неестественного происхождения. Аналоги R1, R2 и R3 представляют, например, такие перегруппировки и были сконструированы путем делеции N-связанных сайтов в положениях 24, 38 или 83, соответственно, и добавлением N- связанного сайта в положение 88. Однако, другие многочисленные типы перегруппировок карбогидратного сайта являются возможными и полученные аналоги могут иметь, а могут и не иметь большее число сайтов гликозилирования, по сравнению с эритропоэтином человека.

Аналоги R1, R2 и R3 анализировали in vivo на биологическую активность и результаты показаны в Таблице 7. Введение N-связанной цепи в Asn 88 восстанавливало биологическую активность в эритропоэтине, в котором уничтожен один из трех N-связанных сайтов естественного происхождения. Эти результаты указывают на то, что положения карбогидратных цепей в эритропоэтине могут быть изменены с тем, чтобы генерировать полезные аналоги без значительного влияния на биологическую активность.

Настоящее изобретение включает также ДНК последовательности, кодирующие аналоги эритропоэтина, имеющие дополнительные сайты для N-связанных и/или О-связанных цепей, аналоги, включающие перегруппировку, по крайней мере, одного добавленного сайта для карбогидратной цепи, и аналоги, имеющие одну или более аминокислот, простирающихся от карбоксиконцевой области эритропоэтина. Процедуры, использованные для введения изменений в ДНК последовательность эритропоэтина человека с целью создания и изменения добавленных сайтов для карбогидратов, раскрыты в Примере 6.

Эти аналоги эритропоэтина могут быть продуктом экспрессии экзогенной ДНК последовательности, т. е. продуцированной через рекомбинантную ДНК технологию, или могут быть синтезированными продуктами. Экзогенная ДНК последовательность включает ДНК, ДНК геном или химически полученную ДНК, кодирующую аналог эритропоэтина. Рекомбинантные ДНК плазмиды и клетки хозяева эукариота, полезные для экспрессии указанных аналогов, также охватываются изобретением. Векторы экспрессии включают любой вектор, который способен экспрессировать клонированные ДНК последовательности в клетку хозяина эукариота, в частности, эти векторы используют для экспрессии в клетки COS и CHO. Примеры таких векторов включают плазмиды pTC и pDEC дельта, описанные в Примере 6 заявки. Культивирование COS и CHO клеток хозяина, экспрессирующих аналоги эритропоэтина, проводили, используя процедуры, известные специалистам в этой области.

Выделенные изоформы и смеси изоформ, полученные из аналогов эритропоэтина, получают, используя способы, описанные выше для приготовления изоформ эритропоэтина человека. Эти способы могут включать изоэлектрическое фокусирование, ионообменную хроматографию и хроматофокусирование. Предпочтительно, используют ионообменную хроматографию для приготовления индивидуальных изоформ и смесей изоформ, полученных из аналогов эритропоэтина.

Увеличение числа карбогидратных цепей в эритропоэтине, и, соответственно, числа сиаловых кислот в молекуле эритропоэтина может придавать предпочтительные свойства, такие как повышение растворимости, большее сопротивление протеолизу, понижение иммуногенности, повышение времени полураспада сыворотки и повышения биологической активности.

Кондиционированная среда из CHO клеток, экспрессирующих аналоги эритропоэтина, была анализирована на биологическую активность in vivo и результаты показаны в Таблице 6. Некоторые испытанные аналоги имели активность, которая в три или больше раз превышала активность эритропоэтина человека. В частности, аналоги, имеющие дополнительную N-связанную карбогидратную цепь, либо в положении 30, либо в положении 88 проявляли в 2 или 3 раза большую активность, чем у эритропоэтина человека, в то же время аналоги, имеющие дополнительные О-связанные цепи в результате слияния эритропоэтина человека с HCG полипептидным фрагментом, имели, по крайней мере, в два раза большую активность.

Два аналога эритропоэтина, имеющие дополнительные карбогидратные цепи, были очищены, и смеси изоформ, имеющие различное содержание сиаловых кислот, были выделены (Пример 8). Аналоги Thr¹²⁵ и Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ (EPO N14) были разделены на три отдельные фракции изоформ, и была для каждой фракции определена биологическая активность in vivo. Результаты, представленные в Таблице 8, демонстрируют, что фракции EPO N14 изоформы, имеющие более высокое содержание сиаловой кислоты, обладали большей активностью in vivo.

Пул изоформ с высоким содержанием сиаловой кислоты аналога EPO N14 и рекомбинантного эритропоэтина человека (изоформы 9-14) были изучены по данным анализов по рецепторному связыванию, фармакокинетическим экспериментам и экспериментам с повышением гематокрита мыши. Результаты этих анализов указывают на то, что существует прямая связь между содержанием сиаловой кислоты, периодом полураспада клиренса и способностью к повышению гематокрита мышей, подвергнутых обработке. Таким образом, как показано на фиг. 13, 14 и 15, EPO N14 пул изоформы с высоким содержанием сиаловой кислоты имел значительно более продолжительный период полураспада in vivo и способствовал большему повышению гематокрита, чем это было в случае выделенной изоформы 14 или рекомбинантного эритропоэтина человека, даже несмотря на то, что пул изоформы N 14 с высоким содержанием сиаловой кислоты не связан так сильно с рецептором.

Другой объект изобретения относится к клеткам хозяевам млекопитающего (например, Chinese Hamster Ovary, CHO), которые предпочтительно синтезируют изоформы эритропоэтина человека или аналоги эритропоэтина, имеющие большее чем определенное число сиаловых кислот на молекулу, например, больше чем 10 сиаловых кислот на молекулу.

Молекулы эритропоэтина содержат N-связанные и О- связанные олигосахаридные структуры, которые могут ограничивать содержание сиаловой кислоты в молекуле. Например, четырехусиковые (четырехразветвленные) N-связанные олигосахариды наиболее вероятно обеспечивают четыре возможных сайта для присоединения сиаловой кислоты, в то время как двух и трехусиковые олигосахаридные цепи, которые могут заменять четырехусиковую форму в аспарагин-связанных сайтах, обычно имеют не более двух или трех присоединенных сиаловых кислот.

О-связанные олигосахариды обычно обеспечивают два сайта для присоединения сиаловой кислоты. Таким образом, молекулы эритропоэтина могут аккомодировать полностью 14 остатков сиаловой кислоты при условии, что все три N-связанных олигосахарида являются четырехусиковыми. Культуры клеток млекопитающего отсевают от тех клеток, которые предпочтительно присоединяют четырехусиковые цепи к рекомбинантному эритропоэтину, тем самым минимизируя число сайтов для присоединения сиаловой кислоты.

N-связанные олигосахариды мочевого эритропоэтина содержат сиаловую кислоту в обоих положениях в альфа 2,3 и альфа 2,6 связях с галактозой /Takeuchi et. al. J.Biol.Chem. 263, 3657 /1988/. Обычно, сиаловую кислоту в альфа 2,6 связи присоединяют к галактозе на маннозное альфа 1,6 ответвление и сиаловую кислоту в альфа 2,6 связи присоединяют к галактозе на маннозное альфа 1,3 ответвление. Ферменты, которые присоединяют эти сиаловые кислоты (бета- галактозид альфа 2,3 сиалилтрансфераза и бета-галактозид альфа 2,6 сиалилтрансфераза), являются наиболее эффективными при присоединении сиаловой кислоты к маннозе альфа 1,6 и маннозе альфа 1,3 ответвлениям соответственно.

Неполные Chinease Hamster Ovary (CHO) клетки дигидрофолат редуктазы (DHFR) обычно используют клетку хозяина для продуцирования рекомбинантных гликопротеинов, включая рекомбинантный эритропоэтин. Эти клетки не экспрессируют фермент бета-галактозид альфа 2,6 силилтрансферазы и поэтому не добавляют сиаловую кислоту в альфа 2,6 связь с N-связанными олигосахарида