Способ обнаружения гидролазы и устройство для его осуществления

Способ обнаружения гидролазы и устройство для его осуществления

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, касается обнаружения гидролитически активного фермента, в частности аспарагиновой протеазы в образце или препарате. Образец или препарат контактирует с твердым носителем, на котором иммобилизован фермент-репортер (т.е. сигналгенерирующий фермент) таким образом, что под действием ферментативно активной гидролазы, если таковая присутствует в образце, этот фермент-репортер отделяется от твердого носителя. После контакта с твердым носителем, образец взаимодействует с индикатором. Индикатор представляет собой любое химическое вещество, которое способно подвергаться детектируемому изменению, обычно изменению окраски под действием фермента-репортера. Детектируемое изменение индикатора указывает на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы, что может свидетельствовать о наличии конкретного патогена или патологического состояния, например, кандидоза. Устройство для осуществления способа включает приемник образуемый частично первой и второй противоположными стенками, обращенными друг к другу внутренними сторонами с зазором. Стенки изготовлены из светопроницаемого материала. На внутренней поверхности стенок иммобилизован на твердом носителе фермент-репортер и индикатор, способный к детектируемому изменению под действием фермента-репортера. В приемнике выполнено отверстие для ввода образца. Изобретение обеспечивает простоту выполнения анализа, является быстрым и экономичным в применении. 2 с. и 3 з.п.ф-лы, 2 ил., 30 табл.

Изобретение относится к способам проведения анализа на присутствие гидролазной активности (т.е. гидролитических ферментов) в образце или препарате. В частности, настоящее изобретение относится к способу обнаружения кандидоза путем проведения анализа на присутствие в образце ферментативно активной аспарагиновой протеазы.

Предшествующий уровень техники Candida albicans и другие виды Candida вызывают ряд широко распространенных и с медицинской точки зрения серьезных инфекций. Так, например, кандидоз пищеварительной системы часто встречается у пациентов с иммунодефицитом. Кроме того, вульвовагинальный кандидоз является одним из наиболее распространенных заболеваний в акушерстве и гинекологии. По оценкам специалистов было установлено, что приблизительно три четверти взрослых женщин страдает по крайней мере от одного из этих заболеваний. (De. Bernardis et al., J. Clin Microbiol 27(11):2598-2603 (1989)). В результате такой широкой распространенности заболеваний кандидозом были проведены многочисленные исследования, которые привели к выявлению этиологии кандидоза.

Эти исследования показали, что этиологическим фактором возникновения кандидоза у человека являются грибы вида Candida albicans и других видов Candida; причем в настоящее время считается, что возникновение кандидоза в основном обусловлено присутствием Candida albicans. Кроме того, получены данные, свидетельствующие о роли аспарагиновой протеазы или (что одно и то же) кислой протеиназы как фактора вирулентности Candida albicans. Известно, что чистые культуры Candida albicans выделяют аспарагиновую протеазу при культивировании в конкретно определенных условиях. Известно также, что чистые штаммы Candida albicans, полученные от женщин с симптоматическим вульговагинитом, секретируют указанный фермент после культивирования этих штаммов в специально подобранной культуральной среде.

Антиген кислой протеиназы Candida albicans, т.е. антиген аспарагиновой протеазы, был обнаружен иммунологически в вагинальных выделениях женщин, от которых был выделен вульвовагинальный Candida albicans (De Bernardis et al., Abstracts N F-91, в "Abstracts of Annual Meeting of the American Society for Microbiology Micro, (Anaheim, CA 1990)). Однако у пациентов с симптоматическим вульвовагинальным кандидозом концентрация антигена кислой протеиназы Candida albicans значительно выше, чем у бессимптомных носителей. Концентрация этого антигена в вагинальных выделениях женщин, страдающих кандидозом, составляет приблизительно 176 15,2 нг/мл, тогда как его концентрация у женщин, у которых не был выделен Candida albicans, т.е. у женщин, не страдающих клиническим кандидозом, составляет менее чем 2 нг/мл. Бессимптомные носители Candida albicans имеют промежуточные уровни антигена 94 18,5 нг/мл. Эти данные явно свидетельствуют о том, что кислая протеиназа (т.е. аспарагиновая протеаза) участвует в патогенезе вульвовагинального кандидоза. Однако известно, что аспарагиновая протеаза Candida albicans нестабильна при температурах тела. Кроме того, иммунологическое обнаружение антигена аспарагиновой протеиназы не позволяет определить, присутствует ли данный фермент в ферментативно активной форме.

Кислая протеиназа Candida albicans представляет собой внеклеточную аспарагиновую протеазу. Аспарагиновые протеазы являются одним из обширных классов протеаз. Они содержат один или несколько ключевых остатков аспарагиновой кислоты, ответственных за ферментативную активность. Аспарагиновая протеаза Candida albicans обладает широкой специфичностью к белковому субстрату, например к альбумину, гемоглобину, казеину, иммуноглобулину A и многим другим белкам. Этот фермент оптимально действует в кислых условиях (т.е. при pH 2,5-5,5) и быстро инактивируется при высоких pH (т.е. при pH 7,5). Аспарагиновая протеаза Candida albicans сильно ингибируется пепстатином, но не ингибируется тиоловыми реагентами, хелаторами или ингибиторами сериновых протеаз.

Многие фармацевтические компании и ведущие ученые проводят исследования с целью изучения ингибиторов аспарагиновых протеаз и их возможного терапевтического использования. Однако эти исследования связаны с определенными трудностями из-за отсутствия подходящего ферментного анализа для аспарагиновых протеаз. Для некоторых сериновых, тиоловых, металло-, кислых и щелочных протеаз и пептидаз существуют простые колориметрические анализы, однако эти анализы не могут быть использованы для аспарагиновых протеаз. Субстратная специфичность этого особого класса ферментов требует присутствия нескольких гидрофобных аминокислот. Это свойство указанных ферментов создает значительные трудности в поиске простых синтетических хромогенных субстратов, поскольку гидрофобные аминокислоты, которые служат в качестве субстрата для аспарагиновых протеаз, как известно трудно растворяются в воде. Поэтому хромогенные субстраты для аспарагиновых протеаз не изготавливаются промышленностью, их трудно синтезировать и охарактеризовывать, и они плохо растворяются в воде. В результате этих ограничений ферментативная активность, определяемая указанными хромогенными субстратами, является исключительно низкой, а поэтому колориметрические анализы абсолютно нечувствительны для аспарагиновой протеазы. Аналогично этому были описаны флуорогенные субстраты для аспарагиновых протеаз, но и они также имеют ограниченное применение. Во-первых, как уже упоминалось выше, субстратная специфичность этого класса ферментов требует присутствия нескольких гидрофобных аминокислот, в результате чего указанные субстраты являются практически нерастворимыми. Во-вторых, при достижении низких концентраций, указанные флурогенные субстраты гидролизуются очень медленно, а поэтому флуорогенные анализы требуют больших временных затрат. Кроме того, многие биологические препараты содержат флуоресцентные вещества, которые могут служить помехой при флуорогенном анализе на присутствие аспарагиновых протеаз.

Из-за отсутствия подходящих колориметрических или флуорогенных анализов для обнаружения аспарагиновых протеаз, обычно используют ультрафиолетовый (УФ) спектрофотометрический метод анализа. При типичном УФ-спектрофотометрическом методе анализа, аспарагиновую протеазу добавляют к раствору белка (например, такого как гемоглобин или альбумин), и полученную смесь инкубируют при 30 - 37^oC в течение 0,5-4 часов. После инкубирования, к охлажденной инкубационной смеси добавляют холодную концентрированную трихлоруксусную кислоту (TCA) для осаждения негидролизованного белка, а пептиды, абсорбирующие ультрафиолетовый свет, остаются в растворе. И, наконец, осажденный негидролизованный белок центрифугируют в течение примерно 1 часа при температурах охлаждения, после чего супернатант отсасывают и для оценки степени гидролиза белка определяют оптическую плотность (ОП) при 280 нм. Хотя этот анализ и может быть использован для определения аспарагиновых протеаз, однако он является трудоемким и требует большого количество времени.

Поэтому можно сказать, что на сегодняшний день не существует какого-либо удобного, простого и оперативного метода обнаружения присутствия ферментативно активных аспарагиновых протеаз. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия ферментативно активных аспарагиновых протеаз, который позволяет решить проблемы, связанные с недостатками предшествующих методов анализа. Кроме того, способы настоящего изобретения могут быть также использованы для обнаружения присутствия других гидролитических ферментов, т.е. гидролаз.

Краткое описание изобретения Было обнаружено, что ферментативно активная аспарагиновая протеаза Candida albicans присутствует в вагинальных выделениях женщин с вульвовагинальным кандидозом. Кроме того, было установлено, что присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы в образце или препарате может служить индикатором для обнаружения и диагностики кандидоза. В соответствии с этим был разработан способ обнаружения кандидоза путем проведения анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы в образце.

В этом способе образец, например вагинальные выделения, подвергают контакту с твердым носителем. На этом твердом носителе, т.е. носителе, с которым контактирует данный образец, иммобилизуют фермент-репортер (т.е. сигналгенерирующий фермент). Причем указанный фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе, отделяется от указанного твердого носителя под действием ферментативно активной аспарагиновой протеазы, если эта ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в данном образце. После того, как образец был подвергнут взаимодействию с твердым носителем, он объединяется с индикатором. Индикатором является любое химическое вещество, способное к видимому или обнаруживаемому изменению (например, такому как изменение окраски) под действием фермента-репортера. Если после контакта с образцом, индикатор подвергается обнаруживаемому изменению, то ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в данном образце, а следовательно, может быть поставлен диагноз кандидоза.

До настоящего изобретения не существовало быстрых и прямых способов анализа на присутствие ферментативно активных аспарагиновых протеаз или, что более важно, анализа на кандидоз. Для анализа на присутствие активной аспарагиновой протеазы использовались спектрофотометрический, флуорогенный и иммунологический анализы, однако эти анализы являются трудоемкими, занимают слишком много времени и могут быть использованы лишь в клинических условиях специально обученным персоналом. Аналогичным образом Candida albicans может быть обнаружена путем культивирования препарата в определенной среде или с помощью микроскопического исследования влажного препарата. Процесс культивирования требует очень много времени (т.е. она занимает около 48 часов), и для осуществления обеих указанных операций необходимо дорогостоящее оборудование и специальная подготовка персонала. В отличие от этих известных способов анализа, заявленный в настоящей заявке способ проведения анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы, и соответственно, на наличие кандидоза, является быстрым, точным, экономически эффективным и простым в применении.

Технология высвобождения фермента-репортера, которая была положена в основу анализа на присутствие аспарагиновой протеазы, может быть также использована для детекции присутствия любого активного гидролитического фермента, включая, (но не ограничиваясь ими), следующие ферменты: протеазы или протеиназы (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидазы, липазы, нуклеазы, гомоолигосахаридазы, гетероолигосахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы и экстеразы. В соответствии с этим в данной работе были также разработаны методы анализа на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы.

В этих методах образец или препарат подвергают контакту с твердым носителем. На этом твердом носителе, с которым контактирует данный образец, иммобилизован фермент-репортер (т. е. сигналгенерирующий фермент). Указанный фермент-репортер иммобилизован на твердом носителе так, что он отделяется от этого твердого носителя под действием гидролазы, если такая ферментативно активная гидролаза присутствует в данном образце. После контакта с твердым носителем, образец взаимодействует с индикатором. Таким индикатором является любое химическое вещество, обладающее способностью к видимому или детектируемому изменению (обычно, изменению окраски) под действием фермента-репортера. Детектируемое изменение индикатора свидетельствует о том, что в данном образце присутствует ферментативно активная гидролаза. И напротив, отсутствие детектируемого изменения в индикаторе указывает на то, что в данном образце ферментативно активная гидролаза отсутствует. Как и в случае анализа на ферментативно активную аспарагиновую протеазу, и, соответственно, кандидоз, заявленные способы анализа на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы являются быстрыми, точными, экономически эффективными и простыми в применении.

Кроме того, технология высвобождения фермента-репортера, которая была положена в основу вышеописанных методов, может быть также использована для анализа на присутствие ингибитора любого известного гидролитического фермента, включая, без ограничений, ингибиторы протеаз или протеиназ (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидаз, липаз, нуклеаз, гомоолигосахаридаз, гетероолигосахаридаз, гомополисахаридаз, гетерополисахаридаз, фосфатаз, сульфатаз, нейраминидаз иэстераз. В соответствии с этим в данной работе были разработаны методы анализа на присутствие в образце ингибитора гидролазы.

В этих методах образец или препарат подвергают взаимодействию с твердым носителем. На этом твердом носителе, с которым контактирует данный образец, иммобилизован фермент-репортер (т.е. сигналгенерирующий фермент). Указанный фермент-репортер иммобилизован на твердом носителе таким образом, что он отделяется от твердого носителя под действием целевой гидролазы при условии, что указанная целевая гидролаза не инактивируется в присутствии ингибитора гидролазы. После того, как образец был подвергнут контакту с целевой гидролазой и ферментом-репортером, он реагирует с индикатором. Индикатором является любое химическое вещество, способное к детектируемому изменению, обычно изменению окраски под действием фермента-репортера, если указанный фермент-репортер был отделен от твердого носителя посредством целевой гидролазы. В случае, если ингибитор целевой гидролазы не присутствует в образце, то целевая гидролаза будет способствовать отделению фермента от носителя, вызывая тем самым детектируемое изменение индикатора. И напротив, если ингибитор целевой гидролазы присутствует в образце, то он будет ингибиторовать целевую гидролазу, и фермент-репортер не будет отделяться от твердого носителя, а поэтому детектируемые изменения или ответ индикатора не будут наблюдаться. Как и в случае вышеописанных методов, заявленные методы обнаружения присутствия ингибитора гидролазы в образце являются быстрыми, точными, экономически эффективными и простыми в применении.

Помимо методов анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы и других активных гидролитических ферментов, настоящее изобретение относится к автономному устройству, предназначенному для анализа образца на наличие кандидоза путем обнаружения присутствия ферментативно активной аспарагиновой протеазы. Кроме того, было также разработано сухое, автономное устройство, предназначенное для анализа на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы. Эти испытательные устройства объединяют фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе, индикатор и один или несколько других реагентов в сухом виде, которые находятся на пластинчатой панели с внутренней камерой, причем эта камера является пустой до тех пор, пока вовнутрь не будет помещен образец. Для удобства, части панели и расположения функциональных химических материалов на панели описываются исходя из горизонтального положения панели, поскольку именно такое положение обычно имеет панель во время использования. В таком положении панели, в частности, для предпочтительных панелей настоящего изобретения, которые являются тонкими и плоскими, испытуемый образец помещают в указанную камеру через отверстия в верхней части панели. Из всех слоев, образующих панель, самый верхний слой в этом положении, т.е. слой, через который вводят образец будет обозначаться верхним слоем, при этом нижняя поверхность этого слоя образует верхнюю поверхность камеры. Аналогичным образом, самый нижний слой панели будет далее называться нижним слоем панели, при этом верхняя поверхность этого нижнего слоя образует нижнюю поверхность камеры. Тонкие края по периметру верхнего и нижнего слоев будут далее называться боковыми краями панели, а тонкие боковые концы камеры вдоль краев ее верхней и нижней поверхностей будут далее называться боковыми стенками камеры. Участки любой данной поверхности, которые примыкают к любому другому участку в той же самой горизонтальной плоскости, будут далее называться горизонтально смежными, а слои нанесенные непосредственно поверх других слоев, и образующие параллельные горизонтальные плоскости, будут далее называться вертикально смежными.

Верхний, нижний и оба слоя панели изготавливают из пропускающего свет, а предпочтительно прозрачного материала. Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе; индикатор и другие компоненты и реагенты, необходимые для проведения испытания, располагают в одном или нескольких слоях внутри камеры в виде покрытий либо на верхней поверхности камеры, либо на нижней поверхности камеры, либо на обеих поверхностях. Индикатором является любое химическое соединение, способное к детектируемому изменению, обычно к изменению окраски, под действием фермента-репортера в том случае, когда он отделяется от твердого носителя с помощью ферментативно активной гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. Слой, содержащий индикатор, может находиться на верхней или нижней поверхности камеры. Один или несколько реагентов, необходимых для проведения анализа, могут быть включены в тот же самый слой, который содержит индикатор, либо они могут быть включены в отдельные слои, располагающиеся на той же самой поверхности или противоположной поверхности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, индикатор находится в слое, нанесенном непосредственно под поверхностью светопроницаемой стенки, а фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе, находится в слое, нанесенном на противоположную стенку.

Реагенты, заполняющие указанные слои, могут быть подобраны таким образом, что для осуществления испытания потребуется лишь добавить образец и минимальное количество дополнительных реагентов, например, таких как проявитель. Однако, в особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения, указанные слои содержат все необходимые реагенты, кроме самого образца, так, что для осуществления анализа необходимо лишь добавить образец и ничего более.

Все слои до их контакта с образцом являются твердыми, а слой, содержащий индикатор, предпочтительно представляет собой композицию, которая является нерастворимой в жидком образце, для анализа которого она предназначена, поэтому индикатор остается в этом тонком слое в процессе исследования. Следовательно, для образцов в водной или водорастворимой среде, предпочтительным индикаторным слоем является либо индикатор, который не растворяется в воде, либо индикатор, который содержится в матрице, не растворяющейся в воде. Таким образом, при использовании индикатора, содержащегося в тонком концентрированном слое, нанесенном непосредственно на внутреннюю сторону светопроницаемой стенки, изменение в окраске индикатора, которое наблюдается через светопроницаемую стенку, происходит в короткий период времени, что позволяет получить высокочувствительный и быстрый результат.

Настоящее изобретение может быть адаптировано и использовано для проведения анализа на присутствие различных гидролаз широкого ряда в образцах, взятых из различных источников. Кроме того, настоящее изобретение может быть адаптировано и использовано для проведения анализа на присутствие ингибиторов гидролазы широкого ряда. Испытание может быть проведено с помощью либо одной реакции, либо последовательности реакций, кульминация которых приводит к детектируемому изменению в индикаторе; причем число и типы реагентов и реакций могут соответственно варьироваться от одного теста к другому в зависимости от детектируемой гидролазы. В некоторых случаях, наилучшие результаты могут быть получены, если предварительно нанесенные реагенты распределяются между верхней и нижней поверхностями камеры, при этом они отделены друг от друга зазором до тех пор, пока этот зазор не заполняется испытуемым образцом. В других случаях, реагенты могут находиться в общем слое или в двух или нескольких различных, но вертикально смежных слоях на верхней или нижней поверхности камеры, что никоим образом не отражается на надежности испытания. Однако, во всех случаях, эти слои конструируются и располагаются так, что реакции, кульминация которых приводит к детектируемому изменению индикатора, происходили лишь тогда, когда камера наполняется испытуемым образцом; причем если такое детектируемое изменение индикатора имеет место, то оно по крайней мере, концентрируется в слое, непосредственно примыкающем к светопроницаемой стенке, и предпочтительно ограничивается этим слоем.

В предпочтительных вариантах настоящего изобретения, испытательное устройство включает в себя положительный контроль, отрицательный контроль, либо тот и другой, которые активируются лишь путем добавления образца. Активация этих контрольных реагентов происходит во время проведения испытания, а детектируемые показания (например, изменение окраски или ее отсутствие), представляющие как контроль, так и испытания, индуцируются лишь добавлением образца в устройство, и наблюдаются через светопроницаемую стенку. В данном устройстве, контрольные зоны являются горизонтально смежными и испытательной зоной; причем для идентификации контрольных зон и дифференциации их от испытательной зоны, на нижней или на верхней (предпочтительно на верхней) поверхности устройства имеются соответствующие метки. Сами контрольные зоны обычно состоят из дополнительных слоев, содержащих реагенты или другие подходящие вещества, которые либо непосредственно индуцируют детектируемое изменение в индикаторе, либо препятствуют возникновению такого изменения и которые действуют лишь в присутствии испытуемого образца, причем независимо от того, присутствует или отсутствует "подозреваемая" гидролаза в испытуемом образце. И аналогично, выбор положительного и отрицательного контроля и химических механизмов, с помощью которых они действуют, а также выбор их местоположения (т.е. на поверхности, на которой присутствует индикатор, или на противоположной поверхности камеры) могут варьироваться от одного теста к другому.

В еще более предпочтительном варианте настоящего изобретения предусматривается повышение эффективности испытаний. Для водных образцов, введение поверхностно-активного вещества (ПАВ) в слои, непосредственно примыкающие к зазору, заполняемому образцом, будет стимулировать смачивание слоев образцом и быстрое и однородное заполнение камеры. ПАВ может быть единственным функциональным ингредиентом в данном слое, или он может быть комбинирован с реакционными реагентами в этом слое. Предпочтительно, чтобы обе стороны зазора граничили со слоями, несущими ПАВ. Для непосредственного ввода образца в камеру, устройство снабжено отверстием для ввода образца, а в предпочтительном варианте, в камере имеется одно или несколько вентиляционных отверстий, отделенных друг от друга отверстием для ввода образца и предназначенных для облегчения заполнения камеры.

Другие отличительные признаки, цели и преимущества настоящего изобретения, а также его предпочтительные варианты будут очевидны из нижеследующего описания.

Краткое описание рисунков Фиг. 1 - вид в перспективе характерного испытательного устройства настоящего изобретения.

Фиг. 2 - вид сбоку в разрезе части испытательного устройства, показанного на фиг. 1.

Подробное описание изобретения и его предпочтительного осуществления В одном из аспектов, настоящее изобретение относится к способу анализа на присутствие ферментативно активной гидролазы в образце, включающего: (a) контактирование образца с твердым носителем, на котором иммобилизован фермент-репортер таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием гидролазы; (b) после контактирования с указанным твердым носителем, соединение образца с индикатором, который подвержен детектируемому изменению под действием фермента-репортера; и (c) наблюдение за детектируемым изменением индикатора; при этом детектируемое изменение индикатора свидетельствует о присутствии ферментативно активной гидролазы в образце.

Термин "гидролаза", используемый в настоящем описании, относится к ферменту, катализирующему гидролитические реакции. Способ настоящего изобретения может быть использован для анализа на присутствие любого известного гидролитического фермента. Такими гидролитическими ферментами, т.е. гидролазами, являются, без ограничений, следующие ферменты: протеазы или протеиназы (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидазы, липазы, нуклеазы, гомо- или гетероолигосахаридазы, гомо- или гетерополисахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы и эстеразы. В предпочтительном варианте, способ настоящего изобретения может быть использован для анализа на присутствие протеаз, включая, не ограничиваясь ими, аспарагиновые протеазы, сериновые протеазы, тиоловые протеазы, металлопротеазы, кислые протеазы и щелочные протеазы. В другом предпочтительном варианте способ настоящего изобретения может быть использован для анализа на присутствие гомо- или гетероолигосахаридаз, или гомо- или гетерополисахаридаз, включая, не ограничиваясь ими, хитиназу, амилазу, целлюлазу и лизицим.

Термины "фермент-репортер" или "фермент-маркер" (эти термины являются взаимозаменяемыми), используемые в настоящем описании, относятся к сигналгенерирующему ферменту, т. е. к ферменту, активность которого вызывает детектируемое изменение. Такими ферментами-репортерами являются, не ограничиваясь ими, пероксидазы, фосфатазы, оксидоредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. При выборе фермента-репортера для использования в методе настоящего изобретения, необходимо иметь в виду, что этот фермент-репортер не должен подвергаться инактивации под действием какого-либо агента, присутствующего в образце, включая любую активную гидролазу, присутствующую в образце и участвующую в инактивирующем гидролизе. Выбор подходящего фермента-репортера или -маркера может быть легко осуществлен квалифицированным специалистом. Предпочтительными ферментами-репортерами являются пероксидазы, например, такие как пероксадаза хрена. Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе, на таком, как нерастворимый полимерный материал, неорганическая или органическая матрица, гель, агрегат, преципитат, или смола, таким образом, чтобы указанный фермент-репортер отделялся от носителя под действием гидролазы, присутствие которой необходимо детектировать в данном анализе. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными твердыми носителями являются, не ограничиваясь ими, целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиакриламид или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые шарики и диальдегидсодержащий полимер, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерий или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты, и стекло, имеющее поры определенного размера. Иммобилизацию фермента-репортера на твердом носителе осуществляют с использованием стандартных методов и операций, известных каждому специалисту.

Фермент-репортер может быть связан непосредственно с твердым носителем. В этом случае нерастворимый носитель служит непосредственно в качестве субстрата для гидролазы. Так, например, если анализируемой гидролазой является хитиназа, то репортерный или маркерный фермент, (такой, как пероксидаза хрена) может быть присоединен непосредственно к нерастворимому хитину. В присутствии хитиназы, пероксидаза хрена будет отделяться от твердого носителя. Аналогичным образом, если исследуемой гидролазой является целлюлоза, то фермент-репортер, например пероксидаза хрена, может быть присоединен непосредственно к целлюлозе, и в присутствии целлюлозы, пероксидаза хрена будет отделяться от твердого носителя. И наконец, если детектируемой гидролазой является лизоцим, то фермент-репортер, например пероксидаза хрена, может быть присоединен непосредственно к пептидогликану клеточной стенки бактерии, и в присутствии лизоцима, пероксидаза хрена будет отделяться от твердого носителя.

Альтернативно, фермент-репортер может быть иммобилизован на твердом носителе посредством использования линкерной молекулы, которая представляет собой гидролизуемый субстрат для детектируемой гидролазы. Такими линкерными молекулами являются, не ограничиваясь ими, белки, углеводы, липиды, пептиды, сложные эфиры, и нуклеиновые кислоты. Выбор конкретной линкерной молекулы, используемой для присоединения фермента-репортера к твердому носителю, зависит от типа детектируемой гидролазы, и в любом случае, может быть легко осуществлен квалифицированным специалистом.

Термин "индикатор", используемый в настоящем описании, относится к любому химическому соединению, которое подвергается детектируемому изменению в результате реакции или в результате кульминации реакций, происходящих в случае присутствия в образце или препарате ферментативно активной гидролазы. Индицируемое в результате этого детектируемое изменение указывает на то, что в данном препарате или образце присутствует ферментативно активная гидролаза.

Предпочтительными индикаторами являются визуальные индикаторы, а, в частности, хромогенные индикаторы, то есть, такие индикаторы, в которых видимым изменением является изменение окраски (включая образование окраски в другом бесцветном материале) под действием фермента-репортера или фермента-маркера, в случае, если он отделяется от твердого носителя с помощью ферментативно активной гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. Альтернативно, фермент-репортер может оказаться способным катализировать образование флуоресцентного сигнала, фосфоресцентного сигнала, биолюминесцентного сигнала, хемилюминесцентного сигнала, или электрохимического сигнала после своего отделения от твердого носителя под действием гидролазы. Кроме того, фермент-репортер может оказаться способным продуцировать другие видимые или детектируемые сигналы, например, такие как образование сгустков, агглютинация, преципитация, или образование зон осветления. В этих случаях, индикатор должен быть химическим соединением или субстратом, необходимым для того, чтобы данный фермент-репортер или фермент-маркер продуцировал нужное детектируемое изменение.

В качестве визуальных индикаторов, действующих с помощью фермента-репортера, такого, как пероксидаза хрена, могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т.е. хромогены) и другие соединения, имеющие аналогичное действие. Предпочтительные хромогенные индикаторы в соответствии с настоящим изобретением содержат гидропероксид и хромоген, включая, но не ограничиваясь ими, гваяковую смолу, 2,2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол, 4-аминоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновую кислоту. Особенно предпочтительным хромогенным индикатором является гидропероксид и гваяковая смола, т.е. хромоген, который является бесцветным в его восстановленном виде и темно-синим в окисленном виде. Гваяковая смола может быть (но необязательно) очищена до ее использования, например, путем экстракции растворителем. Выбор наиболее подходящего хромогенного индикатора для данного фермента-репортера зависит от реакции или реакций, которые этот фермент способен катализировать или инициировать, и в любом случае, этот выбор может быть легко осуществлен каждым специалистом.

Если в качестве визуального индикатора применяется хромогенный индикатор, то в этом случае, может быть использована либо жидкая хромогенная система, либо твердая хромогенная система. Если для данных пероксидаз используется жидкая хромогенная система, то такая система должна состоять из растворителя, гидропероксида и хромогена, способного окислять гидропероксидами в присутствии пероксидазы, например пероксидазы хрена. Альтернативно, если используется твердая хромогенная система, то такая система должна состоять из гидроксипероксида; хромогена способного окисляться гидропероксидами в присутствии пероксидазы; и твердого носителя, который пропитывают хромогеном или на который иммобилизуют хромоген, а затем высушивают. В этой системе, хромогеном может быть пропитана промокательная бумага или подложка, как это было сделано в случае с препаратами Hemoccult или альтернативно, хромоген может быть осажден тонким слоем на пластике или другом материале, изготовленном в виде пластины. В последнем варианте, хромоген может быть нанесен слоем в виде раствора, содержащего полимерный материал (например, такой как гидроксипропилцеллюлоза, этилцеллюлоза и т.п.). Если хромоген сам по себе является водорастворимым, то он может быть введен в матрицу материала, нерастворимого в воде. Альтернативно, если хромоген не растворяется в воде, то он может быть нанесен слоем в виде раствора в органическом растворителе либо отдельно, либо в комбинации с растворимым или нерастворимым в воде полимером.

В твердой хромогенной системе для детектирующих пероксидаз, гидропероксид может быть использован в твердом состоянии (например, такой как гипероксид титана), либо он может быть генерирован in situ. Так, например, пероксид водорода может быть генерирован in situ с использованием глюкозы, атмосферного кислорода и глюкооксидазы. Альтернативно, пероксид водорода может быть получен in situ путем использования сухого слоя, образованного после осаждения суспензии пербората натрия в спирте. При низком pH, перборат натрия спонтанно выделяет пероксид водорода. В присутствии пероксида водорода и пероксидазы, после ее отделения от твердого носителя с помощью гидролазы, хромоген окисляется, в результате чего можно визуально наблюдать изменение окраски. Это изменение окраски указывает на присутствие ферментативно активной гидролазы в образце или препарате.

Этот метод, а также другие методы настоящего изобретения могут быть использованы для одновременного анализа на присутствие двух или более активных гидролаз в образце или препарате. В указанном методе может быть использована смесь двух или более ферментов-репортеров, иммобилизованных на твердом носителе (носителях) посредством субстратных сшивок, восприимчивых к специфическим гидр