Доставка нуклеиновых кислот

Доставка нуклеиновых кислот

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для интродуцирования нуклеиновых кислот в клетки. Для доставки нуклеиновых кислот клетку выдерживают с соединением, имеющим формулу w...x-y-NH-CR₄(CH₂OR₁)(CH₂OR₂), в которой w представляет собой нуклеиновую кислоту, х представляет собой пептид или аминокислоту, у представляет собой линкер, имеющий цепь длиной, эквивалентной 1-20 углеродным атомам, или отсутствует, R₄ представляет собой Н или СН₂О - R₃; R₁, R₂ и R₃ являются одинаковыми или различными и представляют собой либо водород, метильную, этильную, гидроксильную или ацильную группу, полученную из жирной кислоты, имеющей углеродную цепь из 3-24 насыщенных или ненасыщенных углеродных атомов, с условием, что по крайней мере один из радикалов R₁, R₂ и R₃ представляет собой ацильную группу, полученную из жирной кислоты или с соединением, имеющим формулу w. . ..xyNHCH₂CH₂OR₅, в которой w представляет собой нуклеиновую кислоту, х представляет собой пептид или аминокислоту, у представляет собой линкер, имеющий цепь длиной, эквивалентной 1-20 углеродным атомам, или отсутствует, R₅ представляет собой ацильную группу, полученную из жирной кислоты, имеющей углеродную цепь из 3-24 насыщенных или ненасыщенных углеродных атомов. Изобретение позволяет осуществлять доставку генотерапевтического лекарственного средства в клетки. 4 c. и 39 з.п. ф-лы, 24 ил., 5 табл.

Настоящее изобретение относится к способу индуцирования соединений, в частности нуклеиновых кислот, в клетку. Кроме того, настоящее изобретение относится к препаратам для использования по этому способу.

Существует ряд ситуаций, когда необходимо доставить конкретные соединения в клетки. Одной из таких операций является трансфекция эукариотических клеток ДНК. Для этого в настоящее время используют различные коммерческие средства, такие как "Transfectam" (Promega), "DOTAR" (Boehringer Mannheim), "Lipofectin" или "Lipofectamine" (BRL) или применяют трансфекцию, опосредованную кальцийфосфатом.

Способность доставлять в клетки нуклеиновую кислоту с помощью других соединений используют в лекарственной и генной терапии. Доставка соединений в клетки будет изменяться в зависимости от формулы соединения, представленной ниже. Такие изменения можно обнаружить в виде модификаций, касающихся длительности их действия (например, медленное высвобождение или поддерживающее действие), количества требуемого лекарства или способа доставки. Доставка в клетки применяемых соединений, отличающихся в рамках параметров, описанных ниже, может также обеспечивать целевую специфичность лекарственных средств в отношении клеток или тканей.

Авторы настоящего изобретения установили, что ассоциация молекул с соединениями, модифицированными ацильными производными жирной кислоты с общей формулой, приведенной ниже, облегчают доставку такого рода соединений в клетки.

В соответствии с первой целью настоящее изобретение состоит из способа интродуцирования нуклеиновой кислоты в клетку, включающего в себя выдерживание клетки с соединением, имеющим формулу в которой: w представляет собой нуклеиновую кислоту; x представляет собой пептид или аминокислоту; y представляет собой линкер, имеющий цепь длиной, эквивалентной 1-20 атомам углерода, или не имеющий ее; R₄ представляет собой H или CH₂O - R₃; а R₁, R₂ и R₃ являются одинаковыми или различными и представляют собой либо водород, метильную, этильную, гидроксильную или ацильную группу, полученную из жирной кислоты, имеющей углеродную цепь, из 3-24 насыщенных или ненасыщенных углеродных атомов, с условием, что по крайней мере один из R₁, R₂ и R₃ представляет собой ацильную группу, полученную из жирной кислоты.

В соответствии со второй целью настоящее изобретение состоит из способа по интродуцированию нуклеиновой кислоты в клетку, включающего в себя выдерживание клетки с соединением, имеющим формулу w...x-y-NH-CH₂-CH₂O-R₅ в которой: w представляет собой нуклеиновую кислоту; x представляет собой пептид или аминокислоту; y представляет собой линкер, имеющий цепь длиной, эквивалентной 1-20 атомам углерода, или не имеющий ее; R₅ представляет собой ацильную группу, полученную из жирной кислоты, имеющей углеродную цепь из 3-24 насыщенных или ненасыщенных углеродных атомов.

В соответствии с третьей целью настоящее изобретение включает в себя соединение, используемое для интродуцирования нуклеиновой кислоты в клетку, данное соединение, имеющее формулу в которой: w представляет собой нуклеиновую кислоту; x представляет собой пептид или аминокислоту; y представляет собой цепь длиной, эквивалентной 1-20 углеродным атомам, или не имеющий ее; R₄ представляет собой H или CH₂O-R₃; а R₁, R₂ и R₃ являются одинаковыми или различными и представляют собой либо водород, метильную, этильную, гидроксильную или ацильную группу, полученную из жирной кислоты, имеющей углеродную цепь из 3-24 насыщенных или ненасыщенных углеродных атомов, с условием, что по крайней мере один из R₁, R₂ и R₃ представляет собой ацильную группу, полученную из жирной кислоты.

В соответствии с четвертой целью настоящее изобретение включает в себя соединение, используемое для интродуцирования нуклеиновой кислоты в клетку, данное соединение, имеющее формулу w...x-y-NH-CH₂-CH₂O-R₅ в которой: w представляет собой нуклеиновую кислоту; x представляет собой пептид или аминокислоту; y представляет собой линкер, имеющий цепь длиной, эквивалентной 1-20 атомам углерода, или не имеющий ее; R₅ представляет собой ацильную группу, полученную из жирной кислоты, имеющей углеродную цепь из 3-24 насыщенных или ненасыщенных углеродных атомов.

В предпочтительном варианте каждой цели настоящего изобретения "y" присутствует.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, РНК или олигонуклеотиды ДНК или РНК, модифицированные олигонуклеотиды или их комбинации. Нуклеиновая кислота может также нести химические добавки, такие как флуоресцеин (ФИТЦ), холестерин, биотин или радиоактивную метку.

Данный способ настоящего изобретения можно использовать для доставки нуклеиновых кислот, включающих в себя ДНК или РНК, модифицированные олигонуклеотиды или их сочетания, в эукариотические клетки, включающие в себя устоявшиеся клеточные линии животного или растительного происхождения, первичные клеточные линии животного или растительного происхождения, целые организмы животных и растений, примененных системно, местно или в виде аэрозоля. По этому вопросу сошлемся на EPO 426688, включенный в настоящее описание в виде ссылки. Нуклеиновая кислота может также нести химические добавки, такие как флуоресцеин (ФИТЦ), холестерин, биотин или радиоактивную метку. Данный способ настоящего изобретения рассмотрели главным образом для того, чтобы осуществить применение соединения преимущественно в виде водной смеси на поверхности соответствующих клеток. Однако в случае целых организмов соединение можно применять по необходимости преимущественно в неводной форме, путем локальной или общей инъекции, местно или путем ингаляции.

Описание этого изобретения включает в себя также присоединение меченых соединений, таких как флуоресцеин (ФИТЦ) или биотин к пептиду для визуализации и отслеживания в клетках и целых организмах. Меченые соединения вводят в клетки любыми вышеописанными путями или способами.

Пептид может быть любой длины и может включать в себя функциональные домены, такие как сигналы, локализованные ядром и/или связывающие нуклеиновую кислоту. Такие функциональные домены могут объединяться в тандем или в вильчатую структуру, такую, которую можно построить с использованием лизина. Обычно пептид будет обладать суммарным положительным зарядом для приготовления и удержания нуклеиновой кислоты путем присоединения, например, пептида, имеющего один или больше остатков лизина. Можно, однако, создать пептид, несущий суммарный отрицательный заряд, если это является преимуществом для других форм доставки, например для системной доставки ин виво.

Линкер может быть любым из множества молекул, хорошо известных в технике. Однако в настоящее время предпочтительно, чтобы линкер представлял собой аминокислоту или пептид, например аланин, лейцин, глицин, фенилаланин, лизин или его гомологи или гетерополимер. Линкер может также включать в себя атипичные аминокислоты, позволяющие таким образом увеличивать длину линкера больше, чем при использовании обычной аминокислоты. В этом отношении особенно предпочтительно, чтобы линкер представлял собой аминомасляную, аминокапроновую или аминокаприловуюа кислоту.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения R₁, R₂ и R₃ являются одинаковыми, но предпочтительно представляют собой ацильные производные жирных кислот, включающие в себя группу, состоящую из пальмитата, миристата, лаурата, олеата и холестерина, и особенно - лаурата или миристата.

В представленной авторами заявке на Австралийский патент N 649242 раскрыт способ присоединения аминокислот или пептидов к 1-3 ацильным производным жирных кислот путем трометаминового или этаноламинового производного. Используя этот способ, можно получить обширный ряд пептид/ацильных производных жирнокислотных конъюгатов, имеющих 1-3 ацильных производных остатков жирной кислоты. В результате использования способа, раскрытого в этой заявке, можно получить вводящее трилизиналанин-трис-трипальмитатное соединение (КЗАТРЗ). Раскрытие этой заявки включено в настоящее изобретение путем ссылки.

Нуклеиновую кислоту ("w" в соединении) можно связать с остатком данного соединения, используя положительно заряженные аминокислоты, например лизин, аргинин, орнитин и т.д. в положении "x" данного соединения. Особенно предпочтительными группами являются монолизиновая, дилизиновая, трилизиновая, тетрализиновая или пентализиновая группы. Альтернативно нуклеиновую кислоту можно присоединить ковалентно к пептиду или аминокислоте "x". Кроме того, линкерную группу аланин можно заместить, например, на лейциновую, глициновую, фенилаланиновую или -BOC (без -BOC) лизиновую группы и ряд ацильных производных жирных кислот может варьировать от 1 до 3. Нужно отметить, что когда необходимо использовать одно ацильное производное жирных кислот, трис можно заменить на этаноламин.

Очевидно, что технология приготовления лекарственного средства путем введения в липосомы с помощью стандартных способов с использованием такого липида, как диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), DOPC (DOP-холин) или холестерин, может увеличить эффективность изобретения, способствуя доставке соединений в клетки. Это весьма вероятно, когда имеется 2 алифатических ацильных производных. Способы изготовления липосом описаны, например, у Felgner, P.L. et al 1987 PNAS 84 pp 7413-7417 и Yago, K et al 1993 Biochem and Biophys. Res. Comm. 196(3) pp 1042-1048. Показано также, что простое добавление DOPE к растворам соединения может существенно усилить их активность (нижеприведенный эксперимент 4, VerafectinG2 DOPE). Подобно другим модификациям условий трансфекции наличие таких добавок, как соли может усиливать трансфекцию. Описанные изменения ионной силы и присутствие щелочно-земельных катионов меняют эффективность трансфекции (Loeffler and Behr, Methods in Enzimology 1993, H, 599-654).

Главным применением настоящего изобретения должна стать доставка генотерапевтического лекарственного средства. Относительно эффективный перенос генов в клетки, наблюдавшийся до сих пор, в сочетании с низкой токсичностью (особенно если сравнивать с коммерческими лекарственными средствами) делает настоящее изобретение идеальным для терапевтического использования многих соединений. Дополнительную информацию, относящуюся к генной терапии, можно найти у Nabel et al, 1993 PNAS 90 pp 11307-11311, описание которой включено в описание путем ссылки.

Чтобы суть настоящего изобретения была более понятной, предпочтительные его варианты поясняются при рассмотрении нижеследующих примеров и фигур, в которых: Фигура 1a показывает токсичность Verafectin и DMSO, а 1b показывает выживание в % в присутствии Verafectin по сравнению с DMSO.

Цитотоксичность определяли, используя стандартный тест с MTT (3-[4,5-Диметилтиазолил-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид; Тиазолий голубой).

Verafectin представляет собой K3ATP3, и его концентрация указана в мкМ, DMSO использовали в эквивалентной концентрации, до которой разбавляли Verafectin.

a. Результаты гибели клеток с уменьшением ОП.

b. Выживаемость клеток в присутствии одного лишь разбавленного DMSO, взятая за 100%, и выживаемость в присутствии соответствующей концентрации Verafectin.

Фигура 2a показывает цитотоксичность Verafectin и этанола, а 2b - показывает выживаемость в % в присутствии Verafectin по сравнению с этанолом.

Цитотоксичность определяли, используя стандартный тест с MTT (3-[4,5,Диметилтиазолил-2-ил]2,5-дифенилтетразолийбромид; Тиазолий голубой).

Verafectin (K3ATP3) растворяли в 100% нагретом этаноле при концентрации 10 мг/мл и затем разбавляли водой до концентраций, выраженных в мкМ.

a. Параллельно разбавляли этанол и испытывали на цитотоксичность при тех же концентрациях, что и разбавленный Verafectin.

b. Выживаемость клеток в присутствии одного лишь разбавленного этанола, взятая за 100%, и выживаемость в присутствии соответствующей концентрации Verafectin.

Фигура 3 показывает экспрессию CAT через 48 часов после трансфекции pSVLCAT, опосредованной с помощью Verafectin.

Количество Verafectin, выраженное в мкМ, смешивали в 1 мкг pSVLCAT, перед наслаиванием на клетки для трансфекции. Представленные результаты отражают уровни экспрессии CAT, измеренные для 50 мкл клеточной культуральной среды через 48 часов после трансфекции.

Фигура 4 показывает экспрессию CAT, проанализированную спустя 48 часов после трансфекции клеток CHO, опосредованную с помощью тестируемых факторов.

Представленные результаты отражают концентрацию трансфецирующего фактора, дающей наивысший уровень трансфекции в эксперименте. Она составила 5 мкл в каждом случае. Анализы CAT проводили по методу Neuman J.R., Morency, C.A. and Russian, K.O. (1987) Biotecniques 5, p 444-447.

Ничего: фактора трансфекции нет, TF: Transfectam (Promega), Lfe: Lipofectamine (BRL), VF A3: K3ATP3, VF G2:K3GTP2.

Фигура 5 показывает экспрессию CAT, проанализированную через 48 часов после трансфекции клеток Cos 1, опосредованную с помощью тестируемых факторов.

Представленные результаты отражают концентрацию фактора трансфекции, дающей наивысший уровень трансфекции. Ничего: нет фактора, VF A3: K3ATP3, VF G2: K3GTP2, VF G2+DOPE: K3GTP2+DOPE.

Фигура 6 показывает относительную цитотоксичность факторов трансфекции.

Пояснительная подпись a. (Клетки CHO) Жизнеспособность клеток после трансфекции разными факторами на время сбора клеток в CAT-анализе.

Ничего: трансфецирующего реагента нет, TF: Transfectam, Lfe: Lipofectamine, VF G2: Verafectin G2 - все по 5 мкл. Высота ОП отражает степень выживания клеток.

b. (Клетки Cos 1) Жизнеспособность клеток как и на фиг. a. VF A3: Verafectin A3 - 9 мкл, Lfe - 5 мкл. Анализы в этом эксперименте проводили в 35 мм чашках.

Фигуры 7a и 7b показывают результаты по пептиду "x" в эксперименте "a".

Фигура 8 показывает результаты по пептиду "x" в эксперименте "b".

Фигура 9 показывает результаты по пептиду "x" в эксперименте "c".

(Пояснительная подпись - фигуры 7, 8 и 9; ничего: нет фактора, используемого с плазмидной ДНК, rb/реагент: пустой реагент, номер следующего описания соединения указывает no. мкл из 2 мМ маточного раствора (разбавленный водой). 7b: 100% выживаемость клеток в чашках, где осуществляли "псевдотрансфекцию" без ДНК или трансфецирующего фактора. 0% выживаемости в отсутствие клеток. Выживаемость оценивали, используя краситель alamar blue).

Фигуры 10a и 10b показывают результаты по линкеру "y" в эксперименте "a".

Фигура 11 показывает результаты по линкеру "y" в эксперименте "b".

Фигура 12 показывает результаты по линкеру "y" в эксперименте "c".

(Пояснительная подпись - фигуры 10a, 10b, 11, 12; фактор: испытуемое соединение брали из 2 мМ маточного раствора, за исключением особо оговоренных случаев. (. 4): маточный раствор фактора 0,4 мМ. 0: нет фактора. Только ДНК при стандартных условиях трансфекции. Пустая среда: только среда при анализе CAT. Относительная выживаемость (alamar blue): измерение ОП_570-595 культуральной среды с добавленным alamar blue во время инкубации при 37^oC).

Фигуры 13a и 13b показывают результаты по R1-R4-производным в эксперименте "a".

(Пояснительная подпись: такая же, как и Пояснительная подпись к фигурам 10a, 10b, 11, 12).

Фигуры 14a и 14b показывают результаты по R1-R4-производным в эксперименте "b".

(Пояснительная подпись: такая же, как и Пояснительная подпись для фигур 10a, 10b, 11, 12).

Фигуры 15a и 15b показывают результаты по R1-R4 в эксперименте "c".

(Пояснительная подпись: такая же, как и Пояснительная подпись для фигур 10a, 10b, 11, 12. Показано стандартное отклонение).

Фигуры 16a и 16b показывают результаты по R1-R4-производным в эксперименте "d".

Фигуры 17a и 17b показывают результаты по R1-R4-производным в эксперименте "e".

Фигуры 18a и 18b показывают результаты по R1-R4-производным в эксперименте "g". Клетки Cos 1 трансфецировали согласно стандартному анализу в 60 мм чашках. 50 мкл 48 ч культурального супернатанта инкубировали в течение 5 часов при 37^oC для анализа CAT.

Фигуры 19a и 19b показывают результаты по R1-R4, C10-C16 в эксперименте "b". Клетки HeLa.

(Пояснительная подпись: фигуры 19a и 19b: Lfe: Lipofectamine, (1,39) соотношение [липид] /[ДНК], при котором происходит оптимальная трансфекция. Ничего: фактора нет, но ДНК включена в трансфекцию. Цитотоксичность определяли с Alamar blue).

Фигуры 20a и 20b показывают результаты по линкеру "y", представленному необычными аминокислотами, в эксперименте "1".

(Пояснительная подпись: LFE: Lipofectamine. Уровни экспрессии гена показаны в "a" в единицах -галактозидазы. Относительную жизнеспособность анализировали в "b", используя краситель "alamar blue", и представили в виде оптической плотности, измеренной после периода инкубации в присутствии красителя. Высокая ОП указывает на высокую выживаемость клеток).

Фигуры 21a и 21b показывают результаты по линкеру "y", представленному необычными аминокислотами, в эксперименте "2".

(Пояснительная подпись: lfe: Lipofectamine, vf: Verafectin A3, C3; K3C3TL3, C5; K3C5TL3, C7; K3C7TL3, %% трансфектантов вычисляли по числу окрашенных в голубой цвет клеток среди неокрашенных клеток. a: клетки CHO, b: клетки Cos 1).

Фигуры 22a и 22b показывают результаты по линкеру "y", представленному необычными аминокислотами, в клеточных линиях PC3 и Jurkat.

Фигура 23a показывает результаты "технологии приготовления лекарственного средства" в эксперименте "A".

Экспрессия CAT в трансфецированных клетках CHO при использовании различных технологий приготовления липосом, ингредиентов и Lipofectamine (Lfe). Показаны результаты представительного эксперимента.

Фигура 23b показывает результаты "технологии приготовления лекарственного средства" в эксперименте "b".

Процент трансфецированных клеток при использовании липосомных композиций, отдельных ингредиентов и коммерческих препаратов. VF A2: K3ATP2. Липосомы компоновали, используя VF A2 и DOPE при определенном соотношении VF A2: DOPE. Представлены результаты одиночного эксперимента.

Фигура 24 показывает результаты "нетехнологичных смесей" в эксперименте "2".

(Пояснительная подпись: эффективность трансфекции оценивали по уровню экспрессивных -галактозидазных единиц спустя 48 часов. L3: K3ATL3, M3: K3ATM3. Пик отражает комбинацию липопептида и ДНК, дающих наивысшее показание. [липид] отражает использованную концентрацию тотального липопептида).

Примеры Химия Использованные сокращения: -BOC(-Z-Lys) = -Бутилоксикарбонил--карбобензокси-Лизин AEP = Аланин-этаноламин-пальмитат ATP1 = Аланин-трис-монопальмитат ATP2 = Аланин-трис-дипальмитат ATP3 = Аланин-трис-трипальмитат CDCl₃ = Хлороформ-d DCCD = Дициклогексилкарбодиимид DCM = Дихлорметан DIEA = Диизопропилэтиламин DMAP = Диметиламинопиридин DMF = Диметилформамид DMCO-D₆ - Диметилсульфоксид-d₆ DSC = Дисукцинимидилкарбонат FATP1 = Флуоресцеин аланин-трис-монопальмитат FATP2 = Флуоресцеин аланин-трис-дипальмитат FATP3 = Флуоресцеин аланин-трис-трипальмитат FITC = Флуоресцеинизотиоцианат (изомер I) HOSU = Гидроксисукцинимид TEA = Триэтиламин TFA = Трифторуксусная кислота THF = Тетрагидрофуран Tris = 2-амино-2-гидрокси-метил-1,3-пропандиол Z = N-карбобензокси Материалы и методы -BOC(-Z-Lys) получили из Института пептидов, Inc. (Осака, Япония), а DSC получили из Tokyo Kasei Kogyo Co. (Токио, Япония). Все аминокислоты были L-формы и закуплены у компании Sigma Chemical (St. Louis, MO), за исключением особо оговоренных случаев. Все растворители имели квалификацию ч.д.а. и не подвергались дополнительной очистке.

Тонкослойная хроматография Осуществляли на пластинках с Alufolein силикагелем 60 F₂₅₄ (Merck) в следующей системе растворителей: R_f¹, хлороформ/метанол/уксусная кислота - 95/5/3; R_f², хлороформ/метанол/триэтиламин - 95/7/3.

Жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР) Аналитическую ЖХВР осуществляли на оборудовании для ЖХВР Миллипор Уотерс (Waters Chromatography Division of Millipore, Milford, MA), включающему в себя систему подачи растворителя серии 6000A с автоматическим регулированием градиента и запоминающее устройство, модель 746. Хроматографию осуществляли на колонке (100х8) в обращенной фазе с C18-матрицей NOVOPAK^TM. Пептиды и конъюгаты трис-пептид анализировали в линейном градиенте элюирования 24-80% ацетонитрила с 0,1% TFA в течение 5 мин при скорости потока 2 мл/мин (Система A). Детекцию осуществляли при 260 нм, используя Waters Lambda Max 480; (R_f^A). Конъюгаты липопептида анализировали на колонке C₁₈ с помощью линейного градиента от 50% воды, 50% ацетонитрила с 0,1% TFA до 50% ацетонитрила, 50% THF с 0,1% TFA в течение 5 мин при скорости потока 2 мл/мин (Система B); (R_f^B). Разделение соединений, меченых флуоресцеином осуществляли на полупрепаративной обратнофазовой колонке (25х10) с C4-матрицей PrepPak^R при скорости потока 6 мл/мин.

Препаративная ЖХВР Разделение осуществляли на Millipore Waters DeltaPrep 4000 HPLC, используя обратнофазовую колонку (100х40 мм) с C₄-матрицей PrePak и элюировали с помощью линейного градиента теми же элюирующими буферными системами, приведенными выше для аналитической ЖХВР, при скорости потока 20 мл/мин.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) Спектры ЯМР регистрировали на 200 МГц Brucker-спектрофотометре.

Химический синтез Получение ATP1, ATP2 и ATP3.

Эти соединения получали путем гидрогенизации Z-Ала-Трис-моно, ди- и трипальмитатов при давлении 2,812 кг/см² (40 фунтов на квадратный дюйм) в гидрогенизаторе Parr в присутствии палладия на углероде (10%) в этаноле. Удаление бензилокарбонильной группы отслеживали с помощью ЖХВР (Система B). После удаления катализатора фильтрацией и выпаривания растворителей, ATP1, ATP2 и ATP3 получали в достаточном количестве. Синтез и очистка ZATP1, ZATP2 и ZATP3 и соответствующие глицильные соединения описаны у Whittaker, R.G., Hayes, P. J. and Bender, V.J., 1993), Peptide Research, 6, 125-128, и Whittaker R. W. Патент N 649242, Аминокислоты, пептиды или их производные, присоединенные к жирам.

Получение FATP1, FATP2 и FATP3.

К раствору ATP1 (10 мг, 25 мкм) в DCM (500 мкл) приливали при перемешивании раствор ФИТЦ (10 мг, 25 мкм) в DMF (500 мкл). Точное значение pH в реакции поддерживали добавлением TEA, а ход реакции отслеживали с помощью ЖХВР (Система B). Образование флуоресцеин-Ала-трис-пальмитата полностью заканчивалось через 10 мин и продукт выделяли очисткой с помощью препаративной ЖХВР до получения FATR1-продукта до хроматографически чистого состояния, R_f: 7,08. Растворители удаляли при пониженном давлении, а FATR1-продукт лиофилизировали из третичного бутанола.

FATR2 и FATR3 синтезировали таким же образом в результате реакции ATP2 (16,3 мг, 25 мкм) и ATP3 (22 мг, 25 мкм) в DCM (500 мкл) с ФИТЦ (10 мг, 26 мкм) до получения хроматографически чистых продуктов, соответственно, R_f: 8,61 и 9,92.

Получение аланин-этаноламин-пальмитата, меченого флуоресцеином.

Аланин-этаноламин-пальмитат (AEP) получали гидрогенизацией Z-Ала-этаноламин-пальмитата в гидрогенизаторе Parr'а в присутствии палладия на угле (10%) в этаноле. Удаление бензилоксикарбонильной группы отслеживали с помощью ЖХВР (Система B). После удаления катализатора фильтрацией и выпаривания растворителя названное соединение получали в достаточном количестве.

Получение (Лиз)_n-соединений.

Синтез и выделение очисткой Z-Ала-этаноламина и соответствующего пальмитата описаны у Whittaker, R.G., Hayes, P.J. and Bender, V.J., 1993), Peptide Research, 6, 125-128, и Whittaker R.G. Патент N 649242, Аминокислоты, пептиды или их производные, присоединенные к жирам.

К раствору AEP (20 мг, 54 мкм) в DMF (500 мкл) добавляли при перемешивании ФИТЦ (22 мг, 56 мкм) и точно поддерживали pH 9,0 добавлением TEA. Реакция протекала полностью менее чем за 20 мин и продукт выделили очисткой с помощью препаративной ЖХВР до получения названного соединения в хроматографически чистом состоянии, R_f: 7,01.

Синтез олиго-Лиз-соединений [(BOC(-Z-Лиз)_n] осуществляли по классическому способу в растворе (1). Липопептиды BOC(-Z-Лиз)_n-X-трис-пальмитата синтезировали, присоединяя олиго-Лиз и пальмитиновую кислоту с помощью линкерного аминокислотного (X)-трис-соединения. Осуществление синтеза заключается в присоединении BOC(-Z-Лиз)_n-OH к трис-аминокислоте с помощью активированного эфира и последующим присоединением пальмитиновой кислоты к этому конъюгату с помощью симметричного ангидрида. Чистоту интермедиата и конечного продукта контролировали с помощью ТСХ, ЖХВР и ЯМР.

1) Bodansky, M. and Bodansky, A. 1984. Основы синтеза пептидов, Springer-Verlag, Берлин.

2) Whittaker, R.G., Hayes, P.J. and Bender, V.J., 1993, Надежный способ присоединения триса к аминокислотам и пептидам, Peptide Research, 6, 3 (p. 125-128).

Типичные примеры синтеза приведены ниже.

Стадия (I) -BOC(-Z-Лиз)₂OH -BOC(-Z-Лиз)OH, (9,9 г, 30 ммолей) растворяли в 100 мл DCM. HOSU (5,2 г, 45 ммолей) и DIEA (9,0 г, 15 мМ) добавляли к раствору и охлаждали до 0^oC. DCCD (6,2 г, 30 ммолей растворяли в 50 мл DCM, добавляя по каплям в реакционную смесь. Полученный раствор перемешивали при 0^oC в течение 1 ч с последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение ночи для получения активированного эфира (BOC(-Z-Лиз)OSU в количестве 86% по ЖХВР. Преципитат DCU (Дициклогексилмочевина) отфильтровывали и -амино (( -Z-Лиз)OH (7,56 г, 27 мМ) добавляли к реакционной смеси и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Соединение I получали в количестве 93%, как определили с помощью ЖХВР. Растворитель удаляли при пониженном давлении, а маслянистый остаток растворяли в этилацетате и промывали кислотой, основанием и водой. Этилацетатную фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали досуха. Осадок растирали в порошок с диэтиловым эфиром до получения 16,6 г соединения I в количестве 93%, R_f¹: 0,52, R_t^A: 7,33 мин; ¹HЯМР: (DMSO-d₆, ppm), 1,39 (9H, s, BOC(CH₃)₃), 1,4-1,8 (12H, brs, ,, CH₂), 2,99 (4H, brs, CH₂), 3,95 (1H, m, CH), 4,14 (1H, m, CH ), 5,03 (4H, s, Ar-CH₂), 6,89 (1H, d, -уретан NH, J = 7,5 Гц), 7,25 (2H, t, -уретан NH), 7,41 (10H, m, Ar(H)), 7,95 (1H, d, амид NH, J = 8,5 Гц).

Стадия (II) H(-Z-Лиз)₂OH Соединение I (15,6 г, 27 ммолей) растворяли в 50 мл DCM и охлаждали до 0^oC. TFA (50 мл) приливали к реакционной смеси и перемешивали ее при 0^oC в течение 10 мин и в последующие 50 мин - при комнатной температуре. Растворитель и избыток TFA выпаривали досуха, а маслянистый остаток растирали в порошок с диэтиловым эфиром. Получили 15,3 г соединения II; R_f²: 0,19, R_t^A: 6,07 мин.

Стадия (III) -BOC(-Z-Лиз)₃OH -BOC(-Z-Лиз)OH (8,96 г, 27 ммолей) активировали с помощью HOSU и DCCD, как в примере I. DCU отфильтровывали и фильтрат добавляли к 15,1 г соединения II. DIEA (6 г, 46 ммолей) добавляли к реакционной смеси и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель выпаривали, а остаток растворяли в этилацетате и промывали кислотой, основанием и водой. Этилацетат сушили над сульфатом натрия и выпаривали досуха. Остаток растирали в порошок с диэтиловым эфиром до получения 20 г белого осадка соединения III в количестве 87%; R_f¹: 0,36; R_t^A: 7,92 мин. ¹HЯМР: (DMSO-d₆, ppm), 1,39 (9H, s, BOC(CH₃)₃), 1,4-1,8 (18H, brs, ,, CH₂), 2,99 (6H, brs, CH₂ ), 3,95 (1H, m, CH ), 4,14 (1H, m, CH ), 4,34 (1H, m, CH ), 5,03 (6H, s, Ar-CH₂), 6,8 (1H, d, -уретан NH, J = 7,5 Гц), 7,25 (3H, t, -уретан NH), 7,41 (15H, m, Ar(H)), 7,80 (1H, d, амид NH, J = 8 Гц), 8,15 (1H, d, амид NH, J = 8 Гц).

Стадия (IV) -BOC(-Z-Лиз)₃-Ала-трис -BOC(-Z-Лиз)₃OH (1 г, 1,2 ммоля) растворяли в 40 мл DMF и добавляли DSC (0,92 г, 3,6 ммоля). После добавления DIEA (0,2 мл, 1,2 ммоля) и перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч активированный эфир три-Лиз образовывался в количестве 78%, как определили с помощью ЖХВР. В реакционную смесь добавляли трис-Ала (0,46 г, 2,4 ммоля) и pH доводили до 8 добавлением 0,6 мл DIEA. Получение названного соединения продолжили с помощью ЖХВР. Спустя 2 ч активированный эфир почти полностью утилизировали либо путем присоединения к Ала-трис, с образованием соединения IV, или в результате гидролиза до три-Лиз-соединения. Общее количество соединения IV составило 52% по ЖХВР. Препаративной ЖХВР произвели 270 мг очищенного соединения с R_t^A: 7,4 мин. ¹HЯМР: (DMSO-d₆, ppm), 1,39 (9H, s, BOC(CH₃)₃), 1,4-1,9 (18H, brs, ,, CH₂), 2,97 (6H, brs, CH₂), 3,53 (6H, d, трис (CH)₂, J = 3 Гц), 3,75-4,43 (4H, brs, CH ), 3,89 (3H, t, OH), 5,08 (6H, s, Ar-CH₂), 6,8 (1H, d, -уретан NH, J = 7,4 Гц), 7,19 (3H, t, -уретан NH), 7,41 (15H, m, Ar(H)), 7,80 (1H, d, амид NH, J = 8 Гц), 8,15 (1H, d, амид NH, J = 8 Гц), 8,35 (1H, d, амид NH, J = 8 Гц).

Стадия (V) -BOC(-Z-Лиз)₃-Ала-трис(пальмитат)_n, n = 1, 2, 3 -BOC(-Z-Лиз)₃-Ала-трис (173 мг, 0,173 ммоля) растворяли в 3 мл DCM и 1 мл DMF. Пальмитиновую кислоту и каталитическое количество DMAP добавляли к реакционной смеси. Ее охлаждали до 0^oC и DCCD (71 мг, 0,346 ммоля) растворяли в 2 мл DCM, капельно добавляя в реакционную смесь. Ее перемешивали при 0^oC в течение 30 мин и затем выдерживали при комнатной температуре в течение ночи. Соотношение названного соединения к моно-, ди- и трипальмитат составило 17%, 40% и 43% по ЖХВР (система B).

Растворитель упаривали досуха, а остаток повторно растворяли в DCM. Отфильтровывали DCU и фильтрат промывали бикарбонатом натрия (5%) и водой. Препаративной ЖХВР этой смеси получили высокоочищенные соединения монопальмитата (17 мг, R_t^B: 7,63 мин), дипальмитата (76 мг, R_t^B: 8,65 мин) и трипальмитата (63 мг, R_t^B: 9,29 мин). ¹HЯМР соединения трипальмитата: (CDCl₃, ppm): 0,8-0,95 (9H, t, CH₃), 1,3-1,47 (84H, m, BOC (CH₃)₃), пальмитат (CH₂), Ала (CH₃)), 1,47-1,9 (18H, brs, ,,CH₂), 1,83 (6H, t, CH₂), 2,28 (6H, t, CH₂), 3,09 (6H, brs, CH₂), 3,97 (2H, m, CH), 4,29 (1H, m, CH), 4,35 (6H, s, трис(CH₂), 4,47 (1H, t, CH), 5,04 (6H, s, Ar-CH₂), 5,56 (1H, d, амид NH, J = 7 Гц), 5,7 (1H, d, амид NH, J = 7,5 Гц), 5,78 (1H, d, амид NH, J = 7,5 Гц), 6,92 (1H, d, -уретан NH, J = 7,4 Гц), 7,19 (3H, t, -уретан NH), 7,35 (15H, m, Ar(H)).

Стадия (VI) (Лиз)₃-Ала-трис(пальмитат)₃ Соединение V (45 мг) растворяли в DCM (2 мл) и охлаждали до 0^oC. Добавляли TFA (2 мл) для удаления Boc-группы при 0^oC в течение 10 мин и при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель и избыток TFA тщательно удаляли повторным упариванием с диэтиловым эфиром ¹HЯМР этого соединения показал исчезновение BOC (CH₃)-группы. Затем остаток растворили в растворе DCM/метанол (50/50, 4 мл) и гидрогенизировали в течение 2 ч при давлении 40 фунтов на квадратный дюйм в гидрогенизаторе Parr'а, используя 10% палладий/углерод для удаления Z-групп. Удаление Z-групп подтверждали ¹HЯМР-спектроскопией (по исчезновению химического сдвига при 5,04 и 7,35 ppm).

Биология Использованные сокращения: A = Аланин DDME = (Неполная) Модифицированная Дюльбекко среда Игла, удвоенной концентрации, замороженная, оттаянная при 37^oC, отфильтрованная и разбавленная до 1х перед использованием (Loeffler, J-P and Behr, J-P, Методы в энзимологии (1993) H, p. 599-654.

DME = Модифицированная Дюльбекко среда Игла DOPE = Диолеоил фосфатидил-этаноламин EM = Электронный микроскоп(ия) F = Фенилаланин FCS = Околоплодная сыворотка теленка FLAEP = флуоресцеин-аланин-этаноламин-пальмитат FLATP3 = флуоресцеин-аланин-трис-пальмитат G = Глицин K = Лизин K3ATP1-3 = трилизиналанин-трис-моно-трипальмитат L = Лейцин Lfe = Lipofectamine (Gibco BRL) MTS = 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4- сульфофенил)-2H-тетразолий, внутренняя соль; (реактив Owen'a) MTT = 3-[4,5, Диметилтиазол-2-ил]2,5-дифенилтетразолий бромид; тиазолий голубой PBS = фосфатно-солевой буферный раствор TEM = Трансмиссионный электронный микроскоп VF = Verafectin = K3ATR3 VFA3 = K3ATR3 VFG2 = K3GTP2 A. Клеточное поглощение и распределение.

С целью оценить способность доставлять соединения в клетки, провели предварительные эксперименты с флуоресцеин-аланин-этаноламин-пальмитатом (FLAEP) и с флуоресцеин-аланин-трис-пальмитатом (FLATP3).

FLAEP- и FLATP3-конъюгаты разбавляли раствором DMSO в водной среде (PBS) до 10 мкМ и наслаивали на отмытый монослой почти сливающихся клеток Cos 1, растущих на поверхности прокипяченных покровных стекол. После инкубационного периода, как указано в эксперименте, при выдерживании до 24 часов, клетки отмывали и фиксировали в формальдегиде в течение 20 минут. Затем клетки наблюдали при лазерном возбуждении в конфокальном микроскопе MRC 500 фирмы Bio Rad.

Клетки, фиксированные в течение только пятнадцати минут, после обработки FLAEP либо FLATP3, проявляли интенсивное цитоплазматическое окрашивание. Клетки, выдержанные эквивалентно лишь с одним флуоресцеином, проявляли очень слабую общую флуоресценцию целой клетки. Следует особенно подчеркнуть, что FLATP3, как оказалось, предпочтительно связывается с клеточными и ядерными мембранами и сохраняется в клетках, не препятствуя их росту в течение 24 часов, несмотря на то, что раствор для конъюгирования смывали с монослоя спустя 2 часа и заменяли на сыворотку, содержащую среду. Такую длительность окрашивания не наблюдали при использовании FLAEP-конъюгата в тех же условиях.

Фиксация в 4% параформальдегиде сохраняла клеточную морфологию лучше, чем фиксация в формальдегиде. Поэтому в клетке получали более высокое разреше